Name: Una strategia per sensibili, su larga scala quantitative Metabolomica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-27T13:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Scopri un protocollo per l'estrazione e l'analisi di metaboliti polari da cellule coltivate mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa ad alta risoluzione. Questo metodo consente profili metabolici accurati.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori vorrebbero riconoscere Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) e Nathaniel Snyder (Università della Pennsylvania) per le discussioni importanti sul calibrazione di massa ed elaborazione dei dati. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Cancer Institute dei National Institutes of Health nel quadro Premio Numero R00CA168997. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

1. Preparazione di LC-MS Reagenti, Istituzione di un metodo cromatografico, e Istituzione di strumenti procedure operative <ol><li> Preparazione di solventi LC <ol><li> Preparare 500 ml fasi mobili. A è acetato di ammonio 20 mM e 15 mM idrossido di ammonio in 3% acetonitrile / acqua, pH finale 9.0; e B è 100% acetonitrile. </li><li> Liberamente tappo della bottiglia, metterla in un sonicatore bagnomaria, e sonicare per 10 minuti senza riscaldamento supplementare. (Questo passaggio è quello di garantire che tutti i sali di ammonio dissolvono completamente e che non ci siano bolle d&#39;aria residue.) </li><li> Trasferire 250 ml di solvente per una bottiglia di vetro da 250 ml per uso LC-MS, e mantenere il resto a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione di taratura gamma bassa di massa. E &#39;importante utilizzare una gamma bassa massa miscela personalizzata calibrazione per applicazioni metabolomica per garantire che masse accurate vengono rilevati a basso peso molecolare. <ol><li> Pesare 5 mg sia sodium fluoroacetate e acido omovanillico e sciogliere in 5 ml di acqua per fare una concentrazione finale di 1 mg / ml. Sciogliere diazinon in metanolo per effettuare una concentrazione finale di 10 mg / ml. </li><li> Per preparare 1 ml di soluzione negativa basso calibrazione di massa, mescolare 960 ml di soluzione negativa termo calibrazione con 20 ml di fluoroaceate sodio e soluzione di acido omovanillico. Per fare 1 ml di soluzione positiva a basso calibrazione di massa, mescolare 990 ml di termo soluzione di calibrazione positivo e 10 ml di soluzione diazinone. (La soluzione di taratura massa bassa deve essere conservato a 4 ° C ed essere preparato fresco ogni 2 mesi). </li></ol></li><li> Taratura di QE-MS ad una Messa Low Range <ol><li> Prima di eseguire la calibrazione gamma bassa massa, effettuare una calibrazione massa standard (m / z, 150-2,000) in modalità sia positivi che negativi in ​​base alle istruzioni del produttore. </li><li> Una volta che passa una calibrazione di massa regolare, regolare l&#39;intervallo di scansione a 60-900 m / z nel pannello di controllo dello strumentoe viene applicato un CID fonte di 25 eV per modalità positiva e 35 eV per modalità negativa. (Questo darà segnali stabili del frammento ione caffeina e lo ione solfato. L&#39;intervallo di scansione qui è fisso, perché l&#39;ultima m / z non deve essere maggiore di 15x del partendo m / z) </li><li> Una volta che la sorgente di ioni è stabile, quindi eseguire la calibrazione personalizzato. Nota: Una fonte stabile è definita come meno del 10% della variazione corrente ionica totale in modalità positiva, e meno del 15% in modo negativo. Gli ioni di calibrazione personalizzati e corrispondenti m / z sono elencati nella Tabella 1. </li></ol></li><li> Stabilire la strumentazione LC-MS per l&#39;analisi metabolita polare. LC è accoppiato ad un QE-MS per la separazione metabolita e rilevamento. <ol><li> Dotare il QE-MS con una sonda di ionizzazione elettrospray riscaldata (H-ESI). Impostare i parametri di ottimizzazione rilevanti per la sonda elencati: temperatura del riscaldatore, 120 ° C; gas guaina, 30; gas ausiliario, 10; spazzare gas, 3; spruzzo di tensione, 3,6 kV permodalità positiva e 2,5 kV per modalità negativa. Impostare la temperatura capillare a 320 ° C, e S-lente a 55. </li><li> Costruire un metodo di scansione completa come segue: Fascia Scansione completa: da 60 a 900 (m / z); Risoluzione: 70.000; tempo massimo di iniezione: 200 msec con tempi di iniezione tipici intorno a 50 msec; controllo automatico del guadagno (AGC): 3.000.000 di ioni. Queste impostazioni determinano un ciclo di lavoro di circa 550 msec per eseguire scansioni in modalità sia positivi che negativi. </li><li> Stabilire il metodo cromatografico. Impiegare una colonna ammide (100 x 2,1 mm di diametro, 3.5 mm) per la separazione composto a temperatura ambiente 13,15. La fase mobile A è come sopra descritto, e la fase mobile B è acetonitrile. Utilizzare un gradiente lineare come segue: 0 min, 85% B; 1.5 min, 85% B, 5.5 min, 35% B; 10min, 35% B, 10.5 min, 35% B, 14.5 min, 35% B, 15 min, 85% B e 20 min, 85% B. La portata è di 0,15 ml / min tra 0 e 10 min e 15 per 20 min, e 0,3 ml / min 10,5-14,5 min. </li></ol></li></ol> 2. Preparation del metabolita Campioni <ol><li> Preparare un solvente di estrazione. Miscelare 40 ml di metanolo (LC-MS grado) e 10 ml di acqua (grado LC-MS) in un tubo da 50 ml, e tenerlo in freezer -80 ° C per almeno 1 ora prima dell&#39;uso. Nota: Questa procedura e alle fasi che seguono possono essere modificati per l&#39;estrazione di tessuto biologico e di campioni di fluido. <ol><li> Culture cancro colon HCT 8 cellule in tre 10 centimetri piatti o piastre da 6 pozzetti con terreno di coltura completo, RPMI 1640 supplementato con 10% inattivato al calore siero fetale bovino e 100.000 unità / L penicillina e 100 mg / L streptomicina. </li><li> Quando le cellule raggiungono l&#39;80% di confluenza, rimuovere rapidamente il mezzo, e posizionare il piatto o piatto sulla parte superiore del 13,15 ghiaccio secco. Aggiungere estrazione 1 ml di solvente immediatamente (80% metanolo / acqua), e trasferire la piastra al -80 ° C freezer. Per un piatto 10 cm e aggiungere 3 ml di solvente di estrazione per ciascun pozzetto. (Prova per rimuovere il mezzo più possibile per evitare l&#39;effetto di soppressione ionica causa di sali residui di mezzo.)</li><li> Lasciare la piastra per 15 min. Togliere dal freezer, e raschiare le cellule nel solvente in ghiaccio secco. Trasferire la soluzione in 1,7 ml provette Eppendorf e centrifugare con la velocità di 20.000 xga 4 ° C per 10 min. (Preparare metaboliti cellulari da tre piatti separati per fare tre campioni replicati. Lo scopo di mantenere due tubi è di avere uno come backup.) </li><li> Trasferire il supernatante in due nuove provette Eppendorf, e asciugarli nel vuoto velocità. Questo richiede circa 3-6 ore a seconda della velocità di aspirazione utilizzata. (I campioni possono anche essere essiccate per una notte sotto gas azoto.) </li><li> Dopo tubi di essiccazione, negozio di ciascun campione nel -80 ° C freezer. Quando si è pronti, ricostituire un campione in 20 ml di acqua (LC-MS grado), e iniettare 5 ml di LC-QE-MS per l&#39;analisi. </li></ol></li></ol> 3. Impostazione di Sequenza Campione <ol><li> Una volta che la taratura è stata correttamente effettuata sul QE-MS, LC colonna equilibrare per 5 minuti con il 85% e ad un flussovelocità di 0,15 ml / min, che è la condizione iniziale della sfumatura LC. </li><li> Impostare la sequenza di esempio in ordine casuale. Nota: In questo modo, distribuisce le fluttuazioni introdotte dal LC-MS per ogni campione e assicura confronto più accurato tra diversi campioni. Ogni 6 campioni, aggiungere una pista di lavaggio, che condivide lo stesso metodo MS, tranne il gradiente LC è 95% A per 10 min e seguita da un 5 min colonna equilibrazione al 85% A con una portata di 0,15 ml / min. Aggiungere campioni bianchi (100% acqua) dopo ogni corsa lavaggio di valutare lo sfondo del sistema e riportare i livelli. </li><li> Salvare la sequenza e una volta che la colonna LC mostra la pressione stabile, circa 400 psi, inizia la corsa sequenza. Se non c&#39;è altro campione è da eseguire dopo questa sequenza, quindi aggiungere una corsa di arresto alla fine della sequenza, che ha una portata di 0 ml / min alla fine del gradiente e scegliere &quot;stand-by&quot; dopo aver terminato l&#39; sequenza. </li><li> Eseguire nuovamente lo stesso campione fissato 12 ore dopo la calibrazione. (Questo is per valutare la fluttuazione errore massa dopo la calibrazione.) </li></ol> 4. Post Analisi Strumento di pulizia e manutenzione <ol><li> Al termine della sequenza, lavare la colonna con 95% Un ad una portata di 0,2 ml / min per 2 h, e se necessario, invertire la colonna prima del lavaggio. </li><li> Rimuovere la colonna LC e collegare direttamente il LC alla sorgente di ioni da un sindacato. Preparare detergente, acqua / metanolo / acido formico (v: v: v, 90:10:0.2), impostare MS in modalità standby, e sistema di lavaggio LC-MS ad una portata di 0,1 ml / min per 1 ora per rimuovere il residuo precipitato sali o altre impurità. Abbassare la portata se c&#39;è pressione dell&#39;impianto troppo. </li><li> Impostare la temperatura capillare a 50 ° C, e rimuovere la gabbia ione. Estrarre con attenzione il cono ione sweep e il condotto di trasferimento ionico dopo che la temperatura capillare scende a 50 ° C. Utilizzare una maglia ruvida come carta vetrata, per rimuovere le impurità lasciati sulla superficie del cono ione sweep. </li><li> Posizionare il trasferimento di ionitubo in un tubo Falcon da 15 ml contenente 10 ml di 90% di acqua / metanolo contenente 0,1% di acido formico. Dopo sonicating la provetta in un bagno sonicatore acqua per 20 minuti, decantare il solvente all&#39;interno, sostituirlo con 10 ml di metanolo puro e con ultrasuoni per altri 20 min. (Se necessario, la sonicazione può essere effettuata a 40 ° C o una temperatura ancora più elevata per ottenere migliori risultati di lavaggio.) </li></ol> 5. Analisi LC-MS Data <ol><li> Per la sequenza del campione senza intoppi, dopo aver terminato i primi due campioni della sequenza, controllare i picchi di metaboliti sconosciuti. Utilizzare un file csv che elenca i nomi dei metaboliti, formula chimica neutro e modalità di rilevamento (positivo o negativo), come file di input, e il file di output contiene picchi estratti ed errori di massa in ppm. Se la forma del picco è anormale o l&#39;errore di massa è spento da più di 5 ppm, il resto della sequenza deve essere fermato e risoluzione di problemi deve essere fatto. </li><li> Scegliere il metodo di &quot;allineamento piccoed estrazione frame &quot;sul software disponibile in commercio. Selezionare i dati grezzi da LC-MS e di gruppo. Scegli campioni nel mezzo della sequenza di esecuzione come campione di riferimento cromatografia per l&#39;allineamento di picco. Carica un seme telaio compresi i metaboliti noti per l&#39;analisi dei metaboliti mirato con i dati raccolti e il relativo seme telaio. </li><li> Effettuare l&#39;analisi dei dati in modalità positiva e negativa separatamente. Utilizzare l&#39;impostazione predefinita per gli altri parametri. Disattivare la funzione di ricerca del database ed eseguire il flusso di lavoro. Esportare i dati elaborati da un foglio excel contenente area del picco di ogni frame. Il primo set di fotogrammi corrispondono ai metaboliti nel elenco mirato. Nota: Per un&#39;analisi metabolita mirata, le informazioni metaboliti è ottenuta sulla base degli studi precedenti 13,15. </li><li> Per un&#39;analisi metabolita non mirati, scegliere il metodo di &quot;estrazione componente&quot;. Caricare i campioni in bianco per sottrazione del fondo. Impostare picco di intensità soglia di unt 10 5, larghezza m / z di 10 ppm e rapporto segnale-rumore di 3. </li><li> Utilizzare il database metabolome umano per l&#39;identificazione di composti sconosciuti. Utilizzare un filtro CV a rimuovere i componenti con grandi curricula all&#39;interno di campioni replicati. Passare manualmente ogni componente e scegliere quelli con picchi ben definiti o relativamente grande differenza in diversi tipi di campioni per la ricerca nel database. I dati di esportazione con risultati in database. (Allineamento Peak potrebbe essere aggirato se il punteggio di allineamento picco è troppo bassa.) </li></ol>

<ol><li>Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+genomics%2C+metabolome+analysis%2C+and+biochemical+modelling+to+understand+metabolic+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+and+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks.</a> Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).</li>
<li>Mulleder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prototrophic+deletion+mutant+collection+for+yeast+metabolomics+and+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology.</a> Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).</li>
<li>Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CircadiOmics%3A+Integrating+circadian+genomics%2C+transcriptomics%2C+proteomics+and+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics.</a> Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).</li>
<li>Ideker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomic+and+proteomic+analyses+of+a+systematically+perturbed+metabolic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network.</a> Science. 292 (5518), 929-934 (2001).</li>
<li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+identifying+differences+in+large+series+of+metabolomic+samples+analyzed+by+GC%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS.</a> Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).</li>
<li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+data+analysis+for+detecting+and+identifying+differences+between+samples+in+GC%2FMS-based+metabolomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).</li>
<li>Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+profiling%3A+Quantitative+analysis+of+1H+NMR+metabolomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data.</a> Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).</li>
<li>Wiklund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+GC%2FTOF-MS-based+metabolomics+data+for+identification+of+biochemically+interesting+compounds+using+OPLS+class+models%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models.</a> Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).</li>
<li>Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetaboMiner--semi-automated+identification+of+metabolites+from+2D+NMR+spectra+of+complex+biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids.</a> BMC Bioinformatics. 9, 507(2008).</li>
<li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C+NMR+isotopomer+analysis+reveals+a+connection+between+pyruvate+cycling+and+glucose-stimulated+insulin+secretion+%28GSIS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+rate+of+the+glutamate%2Fglutamine+cycle+in+the+human+brain+b.+in+vivo+13C+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).</li>
<li>Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+reaction+monitoring+for+quantitative+biomarker+analysis+in+proteomics+and+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+B%2C+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).</li>
<li>Locasale, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+of+human+cerebrospinal+fluid+identifies+signatures+of+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics+%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma.</a> Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).</li>
<li>Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+reaction+monitoring+for+robust+quantitative+proteomic+analysis+of+cellular+signaling+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).</li>
<li>Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+positive%2Fnegative+ion-switching%2C+targeted+mass+spectrometry-based+metabolomics+platform+for+bodily+fluids%2C+cells%2C+and+fresh+and+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue.</a> Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).</li>
<li>Ramanathan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It+is+time+for+a+paradigm+shift+in+drug+discovery+bioanalysis%3A+From+SRM+to+HRMS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry+%3A+JM%22%5BJournal%5D)">It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS.</a> Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).</li>
<li>Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+analysis+via+reversed-phase+ion-pairing+liquid+chromatography+coupled+to+a+stand+alone+orbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer.</a> Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).</li>
<li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+high+resolution+linear+ion+trap+orbitrap+mass+spectrometer+%28orbitrap+elite%29+facilitates+top+down+LC+MS%2FMS+and+versatile+peptide+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics+%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes.</a> Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).</li>
<li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics+using+Q+exactive%2C+a+high-performance+benchtop+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics+%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).</li>
<li>Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untargeted+Metabolomics+from+Biological+Sources+Using+Ultraperformance+Liquid+Chromatography-High+Resolution+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22UPLC-HRMS%29.+J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry.</a> UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).</li>
<li>Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Within-day+reproducibility+of+an+HPLC-MS-based+method+for+metabonomic+analysis%3A+Application+to+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine.</a> Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).</li>
<li>Want, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano assenza di conflitti di interesse.

I passaggi più critici per successo profiling metabolita in cellule usando questo protocollo sono: 1) controllo del mezzo di crescita e attenta estrazione delle cellule; 2) regolazione del metodo LC basato su MS configurazione metodo per assicurarsi che ci sia un numero sufficiente (di solito almeno 10) punti dati attraverso un picco per la quantificazione; 3) fare una calibrazione bassa massa prima di eseguire campioni; 4) l&#39;iniezione non più di 5 ml di evitare tempi di ritenzione spostamento e allargamento della c...

Metabolomica, definiti come un esperimento che misura più metaboliti contemporaneamente, è stata una zona di forte interesse. Metabolomica fornisce una lettura diretta di fisiologia molecolare e ha fornito intuizioni in sviluppo e malattie come il cancro 1-4. Risonanza magnetica nucleare (NMR) e spettrometria cromatografia-massa del gas (GC-MS) sono tra gli strumenti più comunemente utilizzati 5-9. NMR, in particolare è stato utilizzato per esperimenti di flusso in quanto composti marcati con isotopi pesanti, come ad esempio 13 metaboliti C etichettati, sono NMR attivo 10,11. Tuttavia, questa strategia richiede relativamente elevata purezza del campione e grandi quantità di campione, il che limita le sue applicazioni in metabolomica. Nel frattempo, i dati raccolti da NMR analisi delle esigenze intensiva e assegnazione composta di spettri NMR complesso è difficile. GC-MS è stato ampiamente utilizzato per metaboliti polari e studi lipidici, ma richiede componen volatilids e quindi spesso derivatizzazione dei metaboliti, che a volte coinvolge la chimica complessa che può richiedere molto tempo e introduce rumore sperimentale. Cromatografia liquida (LC) accoppiato a tripla spettrometria di massa a quadrupolo utilizza il primo quadrupolo per selezionare gli ioni madri intatte, che vengono poi frammentate nel secondo quadrupolo, mentre il terzo quadrupolo viene utilizzato per selezionare frammenti caratteristici o ioni figlia. Questo metodo, che registra il passaggio da ioni madri a specifici ioni figlia, è denominata multiple reaction monitoring (MRM). MRM è un metodo molto sensibile, preciso e robusto sia per piccole molecole e proteine ​​quantificazione 12-15,21. Tuttavia, MRM ha i suoi limiti. Per ottenere un&#39;elevata specificità di un metodo MRM deve essere costruita per ogni metabolita. Questo metodo consiste nell&#39;identificare un frammento specifico e corrispondente energia di collisione ottimizzata, che richiede pre-conoscenza della propeproprietā dei metaboliti di interesse, come ad esempio informazioni di struttura chimica. Pertanto, con alcune eccezioni che comportano la perdita neutro di frammenti comuni, non è possibile identificare metaboliti non noti con questo metodo. Negli ultimi anni, la spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) strumenti sono stati rilasciati, come la serie LTQ-Orbitrap e Exactive, il QuanTof, e TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS possono fornire una massa rapporto carica (m / z) degli ioni intatto, per un errore di pochi ppm. Pertanto, uno strumento HRMS operato da rilevare tutti gli ioni precursori (cioè modalità di scansione completa) può ottenere informazioni strutturali diretto dalla massa esatta e la composizione elementare risultante dell&#39;analita, e queste informazioni possono essere utilizzate per identificare potenziali metaboliti. Infatti, tutte le informazioni relative ad un composto può essere ottenuta con una massa esatta, fino al livello di isomeri strutturali. Inoltre, una completametodo di scansione non richiede conoscenza precedente dei metaboliti e non richiede l&#39;ottimizzazione metodo. Inoltre, poiché tutti gli ioni con m / z compreso nel range di scansione possono essere analizzati, HRMS ha una capacità praticamente illimitata in termini di numero di metaboliti che possono essere quantificati in una sola passata rispetto al metodo MRM. HRMS è paragonabile ad un MRM triplo quadrupolo capacità quantitativa causa del breve ciclo di lavoro con un conseguente numero paragonabile di punti di dati che possono essere ottenuti in una MS scansione completa. Pertanto, HRMS offre un approccio alternativo per metabolomica quantitativi. Recentemente, una versione migliorata del HRMS chiamato spettrometria di massa Q-Exactive (QE-MS) può essere utilizzato sotto la commutazione tra i modi positivi e negativi con tempi di ciclo sufficientemente veloce in un unico metodo, che amplia il campo di rilevamento 19. Qui si descrive la nostra strategia metabolomica utilizzando il QE-MS.

<table><tbody><tr><td>Miscela di calibrazione positiva</td><td>Thermo Scientific</td><td>#88323</td><td>È sensibile alla luce. Conservare a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Miscela di calibrazione negativa</td><td>Thermo Scientific</td><td>#88324</td><td>Conservare a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Diazinon</td><td>Sant Cruz Biotechnology</td><td>#C0413</td><td>Provoca irritazione agli occhi, quindi lavorare nel cappuccio. Conservare a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Inserto per aghi H-ESI</td><td>Fisher Scientific</td><td>#1303200</td><td>Questo potrebbe essere sostituito o pulito con acido formico/acqua al 5% (rimuovere l'anello di gomma) se intasato.</td></tr><tr>Si consiglia la <td>colonna Xbridge amide</td><td>Waters</td><td>#186004860</td><td>Guard per aumentare la durata della colonna.</td></tr></tbody></table>

una strategia per sensibili, su larga scala quantitative metabolomica

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolita profiling è stato un bene prezioso per lo studio del metabolismo in salute e malattia. Tuttavia, piattaforme attuali hanno diversi fattori limitanti, come il lavoro intensivo preparazione del campione, limiti di rilevabilità bassi, velocità di scansione lenta, ottimizzazione del metodo intensivo per ciascun metabolita, e l&#39;incapacità di misurare sia positivamente e ioni negativi in ​​singoli esperimenti. Pertanto, un nuovo protocollo metabolomica potrebbe avanzare gli studi di metabolomica. Cromatografia idrofilo a base di ammide consente analisi metabolita polare senza derivatizzazione chimica. Alta risoluzione MS utilizzando il Q-Exactive (QE-MS) ha migliorato ottica ionica, maggiore velocità di scansione (256 msec alla risoluzione di 70.000), e ha la capacità di svolgere / commutazione positiva e negativa. Utilizzando una strategia di estrazione metanolo freddo, e accoppiando una colonna ammide con QE-MS consente robusta rilevamento di 168 metaboliti polari mirati e migliaia di funzionalità aggiuntive contemporaneamente. Datun trattamento avviene con il software disponibile in commercio in un modo altamente efficiente, e caratteristiche sconosciute estratte dagli spettri di massa può essere interrogato in database.

L&#39;accuratezza dei dati metabolomica dipende molto dalle prestazioni LC-QE-MS strumento. Per valutare se lo strumento funziona in buone condizioni, e se il metodo applicato è corretto, diversi metaboliti noto picchi LC sono estratte dal cromatografia ionica totale (TIC), come mostrato nella Figura 1. Metaboliti polari inclusi amminoacidi, intermedi glicolisi , intermedi TCA, nucleotidi, vitamine, ATP, NADP + e così via hanno una buona conservazione delle colonne e buon picco di forme nella...

Metabolita profiling è stato un bene prezioso per lo studio del metabolismo in salute e malattia. Utilizzando cromatografia normale fasi liquida accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione con commutazione di polarità e un ciclo rapido, si descrive un protocollo per analizzare la composizione metabolica polare di materiale biologico con elevata sensibilità, precisione e risoluzione.

Una strategia per sensibili, su larga scala quantitative Metabolomica

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare il profilo metabolico nelle cellule in coltura. Ciò si ottiene estraendo prima i metaboliti polari dalle cellule. Il secondo passo consiste nel ricostituire gli estratti cellulari in acqua e trasferire i campioni in fiale lc.Successivamente, i campioni vengono iniettati nello strumento lc QE MS, che è stato calibrato e i dati grezzi vengono registrati nel computer nella fase finale. I picchi dei metaboliti vengono estratti dai dati grezzi utilizzando un software commerciale e i picchi sconosciuti vengono ricercati in un database di massa ad alta risoluzione. Sebbene questo master possa fornire informazioni sui livelli relativi di metaboliti nella sars, può essere applicato anche ad altri sistemi come il siero o i tessuti.Innanzitutto, preparare 500 millilitri di fase A mobile, che è 20 millimolare di acetato di ammonio e 15 millimolari di idrossido di ammonio in 3% di aceto, nitrile e acqua. Dopo aver tappato la bottiglia, sonicare la soluzione a bagnomaria per 10 minuti senza riscaldarla. Successivamente, sciogliere cinque milligrammi di fluoroacetato di sodio e acido in cinque millilitri di acqua per ottenere una concentrazione

a-strategy-for-sensitive-large-scale-quantitative-metabolomics

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

La profilazione dei metaboliti non mirati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata con spettrometria di massa (UPLC-MS) è una tecnica potente per studiare il metabolismo.  Questo articolo descrive un flusso di lavoro tipico utilizzato per la profilazione dei metaboliti non mirati del siero, tra cui l'organizzazione e la preparazione dei campioni, l'acquisizione dei dati, l'analisi dei dati, il controllo di qualità e l'identificazione dei metaboliti.

Su larga scala e non mirato Profiling Metabolomica di siero da Ultra Performance Liquid Chromatography-Spettrometria di Massa (UPLC-MS)

Non mirati metabolomica fornisce una ipotesi la generazione di un'istantanea di un profilo di metabolico. Questo protocollo dimostrerà la estrazione e l'analisi delle metaboliti provenienti da cellule, siero, o tessuto. Una gamma di metaboliti vengono intervistati usando l'estrazione in fase liquido-liquido, microflusso UltraPerformance liquida cromatografia in fase / ad alta-risoluzione di massa spettrometria di (UPLC-HRMS) accoppiato ad software di analisi differenziale di.

Metabolomica non mirati da fonti biologiche Uso UltraPerformance cromatografia liquida-spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS)

L'affidabilità dei risultati in esperimenti di metabolomica dipende l'efficacia e la riproducibilità della preparazione del campione. Descritto è un metodo rigoroso e approfondita che consente l'estrazione di metaboliti da fluidi biologici con possibilità di analizzare successivamente fino a migliaia di composti, o solo le classi di composti di interesse.

Multi-step di preparazione tecnica per recuperare più classi di composti metabolita di approfondita analisi e Metabolomica informativo

La neurochimica del cervello dei mammiferi è cambiata in molte malattie neurologiche e sistemiche. I profili caratteristici dei metaboliti cerebrali possono essere ottenuti in modo efficiente sulla base di estratti grezzi di tessuto cerebrale. A tal fine, viene impiegata la spettroscopia NMR ad alta risoluzione, che consente un'analisi quantitativa dettagliata delle concentrazioni di metaboliti (metabolomica).

Analisi Metabolomica di cervello di ratto da Alta Risoluzione Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare di estratti di tessuto

Interazioni proteina-proteina e proteina-metabolita sono cruciali per tutte le funzioni cellulari. Qui, descriviamo un protocollo che permette l'analisi parallela di queste interazioni con una proteina di scelta. Il nostro protocollo è stato ottimizzato per colture di cellule vegetali e combina purificazione di affinità con proteina basati sulla spettrometria di massa e rilevamento di metabolita.

2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

Questo protocollo descrive un singolo throughput per complementari tecniche analitiche e omiche che culmina in una caratterizzazione completamente accoppiato di sostanza organica naturale e proteomica microbica in ecosistemi differenti. Questo approccio permette confronti robusti per identificare vie metaboliche e trasformazioni importanti per descrivere la produzione di gas serra e predire le risposte al cambiamento ambientale.

Singolo-velocità effettiva complementari ad alta risoluzione tecniche analitiche per la caratterizzazione di miscele complesse di sostanza organica naturale

Presentiamo un protocollo per l'identificazione e la quantificazione delle principali classi di metaboliti idrosolubili nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Il metodo descritto è versatile, robusto e sensibile. Permette la separazione di isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di metaboliti idrosolubili l'uno dall'altro.

Metabolomica quantitativa di Saccharomyces Cerevisiae mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem

In questo protocollo, presentiamo un flusso di lavoro ottimizzato, che combina una preparazione efficiente e veloce del campione di molti campioni. Inoltre, forniamo una guida passo-passo per ridurre le variazioni analitiche per la valutazione ad alto rendimento degli studi GWAS metabolici.

Studi di associazione multiomica su larga scala (Mo-GWAS): linee guida per la preparazione e la normalizzazione dei campioni

Abbiamo costruito un flusso di lavoro metabolomico non mirato che integrava XY-Meta e metaX insieme. In questo protocollo, abbiamo mostrato come utilizzare XY-Meta per generare una libreria spettrale esca dal riferimento spettrale ad accesso aperto, quindi eseguito il controllo FDR e utilizzato il metaX per quantificare i metaboliti dopo aver identificato gli spettri di metabolomica.

Un flusso di lavoro integrato di identificazione e quantificazione sul metaboloma non mirato basato sul controllo FDR

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) viene utilizzata per identificare la disregolazione dei metaboliti in pazienti con varie malattie. Questa tecnica consente la quantificazione dei metaboliti squilibrati, svelando le intuizioni fisiopatologiche. Qui, descriviamo la procedura passo-passo dell'approccio basato sulla risonanza magnetica magnetica per la caratterizzazione metabolica dei pazienti.

Identificazione e quantificazione di metaboliti squilibrati in pazienti critici utilizzando la metabolomica basata sulla risonanza magnetica nucleare

Questo protocollo mira a preservare i metaboliti cellulari per la spettrometria di massa a singola cellula (SCMS) combinando il lavaggio con soluzione salina volatile, l'estinzione rapida dell'azoto liquido, la liofilizzazione e lo stoccaggio a -8 °C. Dimostra che l'estinzione dell'azoto liquido è essenziale per mantenere i profili dei metaboliti, mentre la conservazione prolungata del freddo dovrebbe essere ridotta al minimo per prevenire alterazioni metaboliche.

Preparazione del campione per la spettrometria di massa a singola cellula Studi di metabolomica: lavaggio, tempra, essiccazione e conservazione combinati delle cellule

Scopri un protocollo per l'estrazione e l'analisi di metaboliti polari da cellule coltivate mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa ad alta risoluzione. Questo metodo consente profili metabolici accurati.

Una strategia per sensibili, su larga scala quantitative Metabolomica

Esplora altri video