Una strategia per sensibili, su larga scala quantitative Metabolomica

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare il profilo metabolico nelle cellule in coltura. Ciò si ottiene estraendo prima i metaboliti polari dalle cellule. Il secondo passo consiste nel ricostituire gli estratti cellulari in acqua e trasferire i campioni in fiale lc.

Successivamente, i campioni vengono iniettati nello strumento lc QE MS, che è stato calibrato e i dati grezzi vengono registrati nel computer nella fase finale. I picchi dei metaboliti vengono estratti dai dati grezzi utilizzando un software commerciale e i picchi sconosciuti vengono ricercati in un database di massa ad alta risoluzione. Sebbene questo master possa fornire informazioni sui livelli relativi di metaboliti nella sars, può essere applicato anche ad altri sistemi come il siero o i tessuti.

Innanzitutto, preparare 500 millilitri di fase A mobile, che è 20 millimolare di acetato di ammonio e 15 millimolari di idrossido di ammonio in 3% di aceto, nitrile e acqua. Dopo aver tappato la bottiglia, sonicare la soluzione a bagnomaria per 10 minuti senza riscaldarla. Successivamente, sciogliere cinque milligrammi di fluoroacetato di sodio e acido in cinque millilitri di acqua per ottenere una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro.

Quindi sciogliere il diazinone in metanolo per ottenere una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro. Per preparare un millilitro di soluzione di calibrazione negativa a bassa massa, mescolare 960 microlitri di soluzione di calibrazione termonegativa con 20 microlitri di fluoro acetato di sodio e soluzione di acido omovanillico. Per ottenere un millilitro di soluzione di calibrazione positiva a bassa massa, mescolare 990 microlitri di soluzione di calibrazione termopositiva e 10 microlitri di soluzione di diazinone.

Dopo aver eseguito una calibrazione della massa standard in modalità positiva, regolare l'intervallo di scansione da 60 a 900 rapporto massa/carica nel pannello di controllo dello strumento e applicare una dissociazione indotta dalla collisione della sorgente di 25 elettronvolt. Inserisci ioni di calibrazione personalizzati e, una volta che la sorgente ionica è stabile, avvia la calibrazione personalizzata nella pagina di sintonizzazione. Cambiare la polarità in modalità negativa dopo aver eseguito una calibrazione della massa standard in modalità negativa, regolare l'intervallo di scansione da 60 a 900 rapporto massa/carica nel pannello di controllo dello strumento e applicare una dissociazione indotta dalla collisione della sorgente di 35 elettronvolt.

Inserisci ioni di calibrazione personalizzati e, una volta che la sorgente ionica è stabile, avvia la calibrazione personalizzata. Nella pagina di sintonizzazione, equipaggiare lo strumento QE MS con la sonda HESI a ionizzazione elettrospray riscaldata o HESI fissandola al livello C e quindi collegandola agli ingressi dell'azoto gassoso, al cavo del vaporizzatore e ai cavi di tensione. Nella pagina di ottimizzazione del computer, impostare i parametri di sintonizzazione pertinenti per la sonda.

Impostare la temperatura del capillare a 320 gradi Celsius e la lente S a 55. Successivamente, nel programma del metodo, creare un metodo di analisi completo utilizzando i valori seguenti. Stabilire il metodo cromatografico inserendo le informazioni sul gradiente lineare.

Utilizzare una colonna intermedia per la separazione dei composti a temperatura ambiente. A questo punto preparare un solvente da estrazione mescolando manualmente 40 millilitri di metanolo e 10 millilitri di acqua in un 50 millilitro. Due. Quando il carcinoma del colon precedentemente coltivato H CT, otto cellule raggiungono l'80% di confluenza.

Aspirare rapidamente il terreno e posizionare la piastra a sei pozzetti sopra il ghiaccio secco. Quindi aggiungere immediatamente un millilitro di solvente di estrazione a ciascun pozzetto e trasferire la piastra in un congelatore a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Dopo aver tolto la piastra dal congelatore, 15 minuti dopo, posizionarla sopra il ghiaccio secco e raschiare le cellule nel solvente.

Trasferire la soluzione da ciascun pozzetto in tre provette da 1,7 millilitri e centrifugare i campioni con una velocità di 20.000 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante in due nuove provette eore. Quindi asciugare i campioni in un vuoto veloce.

Una volta che i campioni sono asciutti, conservarli nel congelatore a 80 gradi Celsius negativi. Dopo aver tolto i campioni dal congelatore per l'analisi, lasciarli raggiungere la temperatura del ghiaccio. Quindi aggiungere 20 microlitri di acqua ghiacciata e agitare i campioni per sciogliere i metaboliti.

Quindi, centrifugare i campioni a 20.000 volte G a quattro gradi Celsius. Per due minuti, trasferire il SUPERNAT nelle fiale lc e iniettare cinque microlitri di campioni nello strumento lc QES per l'analisi. Una volta eseguita correttamente la calibrazione sullo strumento QE MS, equilibrare la colonna lc per cinque minuti con l'85% di fase B mobile ad una portata di 0,15 millilitri al minuto.

Successivamente, impostare la sequenza di campioni in ordine casuale per distribuire le fluttuazioni introdotte dall'LCMS a ciascun campione e garantire un confronto più accurato tra i diversi campioni. Dopo ogni sei campioni, aggiungere un ciclo di lavaggio, seguito da un campione bianco per valutare il background del sistema e i livelli di carryover. Salva la sequenza e avvia l'esecuzione della sequenza.

Una volta che la colonna lc mostra una pressione stabile vicina a 400 PSI, dopo che i primi due campioni della sequenza sono stati eseguiti, controllare i picchi in questi cromatogrammi per verificare la presenza di metaboliti sconosciuti per assicurarsi che la sequenza del campione funzioni senza intoppi. Al termine di tutti i campioni della sequenza, eseguire l'analisi dei dati su un computer separato. Scegli il metodo di allineamento dei picchi e l'estrazione del frame per piccole molecole su software disponibili in commercio.

Quindi caricare i dati grezzi lc ms e raggrupparli in base ai tipi di campione. Prelevare i campioni al centro della sequenza di esecuzione come campione di riferimento cromatografico per l'allineamento dei picchi e selezionare un gruppo come gruppo di rapporti o per il calcolo della modifica completa. Quindi caricare un seme di frame, inclusi i metaboliti noti per l'analisi mirata dei metaboliti con i dati raccolti e il seme di frame corrispondente.

Quindi, scegli la scansione completa degli spettri in modalità positiva o negativa e salva questo file di elaborazione dati nella stessa cartella dei dati grezzi. Disattiva la funzione di ricerca nel database ed esegui il flusso di lavoro. Quindi esporta i dati di processo come foglio Excel contenente l'area di picco di ogni fotogramma.

Per un'analisi non mirata dei metaboliti, scegliere il metodo di estrazione dei componenti. Caricare i dati grezzi di esempio e tre campioni vuoti per la sottrazione in background. Dopo questo gruppo, i dati grezzi e impostare i campioni di riferimento come descritto in precedenza.

Impostare la soglia del componente su 10 al quinto. Utilizza un database di metabolomi umani per l'identificazione di composti sconosciuti. Dopo aver salvato questo file di elaborazione, disattivare la funzione di ricerca nel database e avviare il flusso di lavoro.

Una volta terminata l'elaborazione dei dati, utilizzare coefficienti di variazione o filtri CV per rimuovere i componenti con CV di grandi dimensioni all'interno di campioni replicati e filtri di intensità. Per rimuovere manualmente i componenti rilevati a livello di rumore, esaminare manualmente ciascun componente e selezionare quelli con un picco ben definito o una differenza relativamente grande nei diversi tipi di campione per la ricerca nel database. Infine, esportare i dati con gli hit nel database.

L'accuratezza dei dati metabolomici dipende fortemente dalle prestazioni dello strumento QEMS per valutare se lo strumento funziona in buone condizioni e se il metodo applicato è corretto. Diversi picchi noti di metaboliti lc vengono estratti dalla cromatografia ionica totale, come mostrato qui. I metaboliti polari, tra cui aminoacidi, glicolisi, intermedi, TCA, nucleotidi intermedi, vitamine A, TP e NADP, hanno una buona ritenzione sulla colonna e buone forme dei picchi nelle attuali condizioni di lc.

Nel frattempo, un test di errore di massa viene eseguito entro 24 ore dalla calibrazione della massa bassa, come illustrato. Qui, l'errore di massa viene valutato confrontando il rapporto massa/carica rilevato con il rapporto teorico massa/carica dei metaboliti mirati. Qui, i metaboliti bersaglio hanno un rapporto massa/carica che va da 74 a 744.

L'asse Y qui rappresenta la percentuale cumulativa di metaboliti all'interno di un certo intervallo di errore di massa. La curva blu mostra il risultato da zero a 12 ore, mentre la curva di colore rosso mostra i dati raccolti da 12 a 24 ore dopo la calibrazione. Più del 90% dei metaboliti ha un errore di massa compreso tra cinque parti per milione, il che significa che il metodo di calibrazione dell'intervallo di massa basso sviluppato qui è sufficiente per mantenere un errore di massa di cinque parti per milione per il rilevamento di un intervallo di massa basso.

Un altro problema da affrontare è la sensibilità dello strumento con il metodo e la configurazione attuali dello strumento. Una diluizione seriale di campioni triplicati da una piastra di Petri di 10 centimetri è stata eseguita cinque volte con un fattore di diluizione di sei, ottenendo sei diverse concentrazioni di campioni. Un elenco mirato viene utilizzato per valutare il numero di metaboliti rilevati a diverse concentrazioni di campione.

I risultati mostrati qui indicano che il numero ottimale di metaboliti bersaglio rilevati è compreso tra 2,78 volte 10 al quinto e 1,67 volte 10 alle sei cellule, mentre uno volte 10 alle sette cellule fornisce un numero inferiore di metaboliti rilevati, a causa degli effetti di soppressione ionica. Questo risultato indica che la quantità ottimale di cellule da estrarre per questa analisi è all'incirca quella di un pozzetto in una piastra a sei pozzetti. Per l'analisi non mirata dei metaboliti, per filtrare la tabella dei componenti vengono utilizzati un cutoff CV del 20% e un valore medio di intensità compreso tra 10 e settimo.

I valori di cutoff CV possono essere aumentati, mentre i valori medi di intensità devono essere diminuiti per includere più picchi: Dopo aver controllato manualmente i picchi, i componenti con buone forme vengono selezionati e ricercati nel database del metaboloma umano. I risultati dei dati raccolti in modalità positiva sono elencati qui, mentre i risultati della modalità negativa sono elencati qui. Alcuni dei metaboliti qui identificati si sovrappongono ai metaboliti nell'elenco mirato, come il glutatione e la prolina.

Vengono esplorati anche ulteriori metaboliti assenti dall'elenco mirato, come il metilgliossale, che può essere derivato dalla glicolisi e un pto, due ELE SN glicerolo, tre fosfocolina, che viene rilevato in modalità positiva con un tempo di ritenzione di 3,2 minuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre i polimetaboliti dalla sars in coltura e quindi utilizzare RC QES per misurare i livelli metabolizzati relativi in diversi campioni. Grazie per aver guardato.