L'utilizzo di un α-bungarotossina Binding Tag sito per studiare GABA un recettore di membrana localizzazione e il traffico

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la localizzazione della superficie del recettore gabaa e l'endocitosi nei neuroni dell'ippocampo. Ciò si ottiene effettuando prima il sezionamento dei neuroni dell'ippocampo con la subunità del recettore gabaa marcata e consentendo ai neuroni coltivati di svilupparsi nell'incubatrice. Il secondo passo consiste nell'etichettare i recettori gabaa di superficie con il die Alexa fluorescente accoppiato a bungalow alfa

Successivamente, i neuroni vengono incubati per vari punti temporali al fine di consentire ai recettori marcati di essere endocitosi. Il passaggio finale consiste nel fissare i campioni nei punti temporali appropriati ed eseguire la colorazione immunologica utilizzando anti GFP per osservare il pool totale di recettori marcati. In definitiva, la microscopia confocale viene utilizzata per mostrare i cambiamenti nella localizzazione superficiale e nell'endocitosi dei recettori gabaa marcati utilizzando approcci di imaging fissi o dal vivo.

Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nel campo del traffico dei recettori, come ad esempio quale effetto può avere il legame del ligando sull'endocitosi del recettore e sui tassi di inserzione, e se diversi ligandi e modulatori possono influenzare il riciclaggio e la degradazione del recettore. Sebbene questo metodo sia stato utilizzato per studiare i canali ionici legati e i recettori accoppiati a proteine G principalmente nel contesto del sistema nervoso, può anche essere applicato per studiare la localizzazione dinamica e il traffico di altre proteine di membrana in colture cellulari e cellule primarie di diversi tessuti. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà per due motivi.

In primo luogo, per creare costrutti funzionali e in secondo luogo, la pratica e le esperienze necessarie per elaborare diversi punti temporali contemporaneamente. Per iniziare, preparare da quattro a cinque vetrini rotondi in polietilene di lisina all'interno di ogni piatto di coltura tissutale da 3,5 centimetri, come descritto nel protocollo di testo. Quindi trasfetta i neuroni appena dissociati il giorno della coltura con uno o quattro microgrammi di maxi piastra di DNA costrutto preparata.

I neuroni trasfettati sul coprioggetto rivestito di poli de luccina scivolano ad una densità finale di circa 200.000 neuroni per piatto di 3,5 centimetri. Sostituire il terreno da quattro a 24 ore dopo la preparazione delle colture neuronali. Quindi lasciare che i neuroni si sviluppino nell'incubatrice fino a 14-17 giorni in vitro o allo stadio desiderato per eseguire il test di endocitosi.

Per prima cosa impostare un dispositivo di riscaldamento di raffreddamento da banco a 16 gradi Celsius. Raffreddare cumuli extracellulari, soluzione salina tamponata o HBS a 16 gradi Celsius a bagnomaria. Trasferire le piastre di neurone sulla piastra di alluminio a 16 gradi Celsius e raffreddare per cinque minuti.

Rimuovere il terreno e sostituirlo con un millilitro di 16 gradi Celsius HBS più 150 micromolari due Bo Rine per due minuti. Quindi, rimuovere il terreno in un contenitore per rifiuti etichettato e sostituirlo con un millilitro di HBS a 16 gradi Celsius più due bokerine più alfa tossina bungalow. Alexa 5 9 4 in incubazione a 16 gradi Celsius per 15 minuti.

Dopo l'incubazione, trasferire il terreno in un contenitore per rifiuti etichettato e lavare le piastre tre volte con due millilitri di HBS a 16 gradi Celsius per esperimenti di serie temporali di imaging dal vivo dopo l'endocitosi del recettore utilizzando una piastra di coltura da 3,5 centimetri con fondo di vetro. Trasferire la piastra su un tavolino riscaldato al microscopio e iniziare l'imaging con un microscopio confocale o per tappeto erboso. Predisposizione per vetrini di copertura fissi.

Il trasferimento T equivale a zero punti temporali scivola il coperchio in un piatto a temperatura ambiente 4% di formaldeide, 4% di saccarosio per 20 minuti per altri punti temporali. Sostituire l'HBS con un terreno condizionato ed equilibrato a 37 gradi Celsius e riportarlo all'incubatore per l'endocitosi a 37 gradi Celsius nei punti temporali necessari. Prendere i piatti dall'incubatrice e lavarli velocemente due volte con due millilitri di temperatura ambiente, delcos fosfato, soluzione salina tamponata o DPBS.

Quindi fissare il campione in aldeide paraforme al 4%, saccarosio al 4% per 20 minuti. Dopo un fissaggio di 20 minuti, rimuovere il 4% di aldeide paraforme, il 4% di saccarosio nel contenitore dei rifiuti e lavare i piatti due volte con due millilitri di DPBS a temperatura ambiente. Quindi, incubare i vetrini coprioggetti a temperatura ambiente per 10 minuti.

Una soluzione di blocco dell'immunofluorescenza contenente lo 0,2% di Tritone X 100 per permeare i neuroni e consentire la colorazione immunologica anti GFP del pool di recettori intracellulari e/o la marcatura di altre proteine di interesse. Quindi rimuovere la soluzione di blocco permeabile e incubare i vetrini di copertura in una soluzione di blocco di immunofluorescenza senza Triton X 100 per 20-30 minuti. Eseguire l'incubazione primaria degli anticorpi dei vetrini coprioggetti in blocco per diverse ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius dopo l'incubazione.

Lavare i vetrini coprioggetto immergendoli in DPBS per cinque minuti per un totale di tre lavaggi. Quindi incubare i vetrini coprioggetti con anticorpi secondari in soluzione a blocchi per un'ora a temperatura ambiente dopo un'ora. Lavare i vetrini coprioggetto tre volte con DPBS come prima.

Quindi, montare ciascun vetrino coprioggetto rimuovendo il liquido in eccesso dal retro del vetrino con un panno da laboratorio e quindi capovolgendo il vetrino coprioggetto su quattro microlitri di mezzo di montaggio su un vetrino. Eseguire l'acquisizione delle immagini con la microscopia confocale in cieco rispetto alle condizioni sperimentali utilizzando un'apertura numerica dell'olio 60x. 1.49 Obiettivo ad immersione.

Utilizzando le stesse impostazioni di acquisizione delle immagini, è possibile acquisire immagini di singole sezioni Z con il corpo cellulare neuronale e diversi processi dendritici a fuoco per quantificare la tossina alfa bungalow, il segnale fluorescente Alexa e la colorazione immunologica GFP lungo 20 micron di tre o quattro dendriti prossimali per neurone utilizzando la stessa soglia per l'analisi di tutti i dati di endocitosi. Analizza i dati da 10 a 12 neuroni per ogni punto temporale. Ripetere l'esperimento con diverse colture neuronali indipendenti.

Gli assoni GABAergici stabiliscono contatti inibitori sui dendriti dei neuroni piramidali. I terminali inibitori presinaptici sono identificati dal trasportatore di aminoacidi inibitori vescicolari che carica GABA e glicina nelle vescicole sinaptiche. I recettori GABA a sono strettamente opposti ai siti di rilascio dei neurotrasmettitori legati dall'impalcatura inibitoria post-sinaptica La proteina gein mostrata qui sono i neuroni alfa due phg F-P-B-B-S che esprimono con i recettori gabaa di superficie marcati con la tossina bungalow Alexa 5 9 4 seguita da colorazione immuno per la popolazione totale del recettore con anticorpo anti GFP mostrato in verde, e la proteina dell'impalcatura inibitoria post-sinaptica gein o il trasportatore di aminoacidi inibitori vescicolari.

Qui viene mostrata l'endocitosi dell'alfa due contenente il recettore GABA A e i neuroni dell'ippocampo a 15 giorni in vitro con la tossina alfa bungalow. Fluorescenza Le misurazioni dei singoli processi dendritici, come mostrato nei pannelli, sono normalizzate al livello di espressione del costrutto tramite gli anticorpi GFP. Il confronto finale dei punti temporali viene effettuato mediante normalizzazione alla misurazione T uguale a zero.

La quantificazione dell'internalizzazione dei recettori in un periodo di 60 minuti dai cambiamenti del segnale fluorescente nel tempo è stata meglio descritta da un singolo esponenziale. Un approccio alternativo consiste nel seguire l'endocitosi del recettore in un singolo neurone mediante microscopia confocale time-lapse con imaging dal vivo. La fluorescenza puntata e sovrapposta del recettore GABA A marcato P-H-G-F-P e dei recettori marcati con la tossina alfa bungalow di superficie è visibile all'inizio dell'esperimento nel corso del tempo il segnale del recettore GABA A marcato con la tossina alfa bungalow diminuisce man mano che i recettori si endocitosi.

Mentre il segnale P-H-G-F-P rimane alto a causa dell'inserimento di un nuovo recettore, la diminuzione minima del segnale P-H-G-F-P è dovuta ai cambiamenti della distribuzione dei recettori sulla superficie cellulare e al fotosbiancamento Seguendo questa procedura. Altri metodi, come i saggi di inserimento della tossina nei bungalow, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come i tassi di inserimento dei recettori con trattamenti diversi. Questa tecnica consente di valutare come l'attività cellulare, i domini proteici specifici, gli agonisti e altri modulatori possono modificare il turnover dei recettori nei neuroni vivi, in altre cellule e tessuti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare i coloranti Alexa accoppiati alla tossina alfa bungalow in combinazione con tecniche standard di immunofluorescenza per quantificare la localizzazione dei recettori di superficie nei neuroni dell'ippocampo.