Metodi per facilitare la crescita microbica sui flussi di rifiuti delle cartiere e caratterizzazione del potenziale di biodegradazione dei microbi coltivati

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di determinare la capacità di un microrganismo o di consorzi di microrganismi di utilizzare il liscivio nero di cellulosa per la crescita, i componenti del liquor nero che vengono utilizzati per la crescita e i prodotti prodotti dal metabolismo microbico di questi scarti di spappolamento. Ciò si ottiene raccogliendo il liscivio nero di scarto e preparandolo per l'uso come componente del terreno di coltura. In una seconda fase, vengono estratti i componenti della lignocellulosa, che vengono utilizzati per determinare il fabbisogno di fonti di carbonio dei microrganismi.

Successivamente i terreni vengono preparati, inoculati e analizzati per la crescita microbica al fine di determinare la capacità dei microrganismi di crescere sul liquor nero e sui suoi componenti. I risultati mostrano l'utilizzo del black liquor come unica fonte di carbonio per la crescita e la sintesi di prodotti metabolici da parte dell'isolato ambientale microbico basato sulla sua crescita visualizzata su piastre di agar con terreno minimo e da GCMS. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo discutendo la possibilità che i microbi potessero crescere sui prodotti di scarto della cellulosa e che potessimo essere in grado di isolare questi microbi direttamente da una cartiera.

Il vantaggio principale della tecnica di estrazione zignale del cellosio rispetto al metodo esistente oggi, come lo sbiancamento con idrossido di sodio, è che lo sbiancamento al cloruro di sodio offre un'elevata e maggiore purezza. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Poiché le fasi di preparazione dei campioni Theo Cellulosa e GCMS sono difficili da imparare, e ciò è dovuto al numero di passaggi necessari e alla determinazione visiva necessaria per verificare il completamento del processo.

Questo metodo non solo può fornire informazioni sulla degradazione microbica del liquor nero, ma può anche essere applicato a flussi di rifiuti industriali contenenti materiali di cellulosa Magno come residui di colture, residui forestali e rifiuti solidi urbani. Per iniziare questa procedura, raccogliere il campione di liquore nero dalla valvola di uscita collegata al digestore artigianale e da una bottiglia di vetro sterile e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere alla fase successiva. Quindi aggiungere 100 millilitri di campione di liquore nero a un becher da 500 millilitri dotato di una barra di agitazione e agitare il campione a velocità media.

Neutralizzare il liquor nero aggiungendo acido fosforico goccia a goccia fino a quando non diventa viscoso. Dopo questa aliquota, tutta la soluzione di liquore nero in provette coniche da 50 millilitri e centrifugare i campioni a 9, 300 Gs per 30 minuti. Per separare i carboidrati, mettere cinque grammi di panico verga macinato da un millimetro o più piccolo e una barra di agitazione in un pallone da 500 millilitri.

Quindi aggiungere 200 millilitri di acqua distillata, 7,5 grammi di clorito di sodio e 2,5 millilitri di acido acetico glaciale. Mettere il pallone in un bagno d'olio posto sopra una piastra di agitazione a 80 gradi Celsius per un'ora. Quindi aggiungere altri 7,5 grammi di cloruro di sodio e 2,5 millilitri di acido acetico glaciale al pallone.

Continuate a mescolare a 80 gradi Celsius per 30 minuti dopo aver ripetuto il passaggio precedente due volte. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente. Quindi filtrarlo attraverso un imbuto buchner sotto vuoto per isolare il materiale solido.

Lavare il materiale solido tre volte con 100 millilitri di acqua distillata. Quindi, raccogli un grammo di materiale solido e posizionalo su un foglio pulito di carta da filtro. Posizionare il solido a 50 gradi Celsius per asciugare durante la notte.

Dopo aver tolto il campione dal forno il giorno successivo, trasferirlo in una fiala di conservazione etichettata a cella cava. Aggiungere il materiale solido rimanente in un pallone da 500 millilitri contenente 250 millilitri di idrossido di sodio al 10% e tappare il pallone con il tappo. Mettere la soluzione in un'incubatrice a 70 gradi Celsius per un'ora agitando a 250 giri/min.

Successivamente, lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente Dopo 30 minuti, isolare il materiale solido mediante filtrazione sottovuoto utilizzando un imbuto buchner. Una volta che il residuo solido è stato essiccato per una notte in un forno a 50 gradi Celsius, metterlo in una fiala di conservazione etichettata con cellulosa. Trasferire il filtrato in un pallone da 500 millilitri e aggiungere 30 millilitri di acido acetico e 250 millilitri di alcool isopropilico e porre la soluzione risultante sul banco di lavoro per almeno otto ore a temperatura ambiente.

Al termine, trasferire tutta la soluzione in provette coniche da 50 millilitri e centrifugare il campione a 9.300 G per 30 minuti. Dopo la centrifugazione, pipettare con cura la soluzione dai tubi conici e gettarla. Successivamente, lavare i pellet con 30 millilitri di acqua distillata a vortice e centrifugare a 9, 300 Gs per 30 minuti.

Ripetere questo passaggio 15 volte per lavare accuratamente il pellet. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante per isolare il pellet per la liofilizzazione. Una volta che il campione è stato liofilizzato, metterlo in una fiala etichettata con emicellulosa.

Per la separazione della lignina, aggiungere cinque grammi di panico verga macinato da un millimetro o più piccolo a una soluzione da 500 millilitri di idrossido di sodio molare di punto 25 e etanolo al 30%. Mettere il liquame in un'incubatrice a 75 gradi Celsius con agitazione a 250 giri/min per due ore. Dopo aver filtrato la soluzione fredda, aggiungere un'ancoretta al pallone e posizionarla sopra una piastra di agitazione regolata a velocità media.

Aggiungere acido cloridrico concentrato goccia a goccia al filtrato fino ad ottenere un pH di due. Lasciare riposare la soluzione per una notte a temperatura ambiente. Una volta che la soluzione è stata trasferita in provette coniche da 50 millilitri, centrifugare i campioni a 9.300 GS per 30 minuti.

Al termine, pipettare con cura la soluzione dal tubo conico e gettarla. Lavare il pellet con 30 millilitri di acqua distillata a vortice e centrifugare a 9,300 Gs per 30 minuti. Ripetere questo passaggio 15 volte per lavare accuratamente il pellet.

Dopo la centrifugazione, rimuovere il natante supino per isolare il pellet per la liofilizzazione. Una volta liofilizzato, posizionare il campione in una fiala etichettata con lignina. Aggiungere 50 millilitri di terreno sterile M nine minimal a un pallone sterile da 125 millilitri.

Quindi aggiungere il 10% in volume di liquore nero al supporto. Per l'inoculazione aggiungere alla miscela lo 0,1% in volume di una coltura batterica durante la notte, incubare le colture a 37 gradi Celsius in un incubatore con agitazione a 200 giri/min. A metà della fase logaritmica, trasferire i batteri in un flacone di siero anaerobico sterile sigillato utilizzando una siringa dopo la centrifugazione delle colture batteriche inoculate e inoculate dall'ONU.

Dopo 450 ore di crescita, aggiungere 10 millilitri di ciascun surnatante in provette di vetro separate. Acidificare ogni surnatante con acido cloridrico concentrato aggiunto goccia a goccia a pH da uno a due. Per ogni campione, aggiungere 30 millilitri di acetato di etile al soprannatante.

Dopo aver tappato la provetta, mescolare la soluzione capovolgendo la provetta da quattro a sei volte. Quindi mettere uno o due grammi di solfato di sodio anidro in una provetta di vetro pulita. Raccogliere con cura lo strato organico superiore pipettandolo con la pipetta monouso in vetro per pascoli.

Posizionare lo strato organico nella provetta contenente il solfato di sodio anidro. Disidratare lo strato organico sul solfato di sodio anidro picchiettando delicatamente la provetta per mescolare gradualmente. Aggiungere piccole quantità di solfato di sodio anidro e mescolare fino a quando non ci sono grossi grumi.

Successivamente, filtrare la soluzione attraverso un imbuto buchner sotto vuoto, quindi trasferire la soluzione in un pallone di evaporazione ed evaporare il filtrato utilizzando un evaporatore rotante. Al termine, mettere tre milligrammi di residui di estrazione dell'acetato di etile in una fiala per cromatografia ambrata da due millilitri. Sciogliere il residuo con 100 microlitri di un quattro diossano e 10 microlitri di piridina.

Quindi aggiungere 50 microlitri di una soluzione di B-S-T-F-A con l'1% di cloro trimetilico al flaconcino. Mettere la soluzione in un'incubatrice a 60 gradi Celsius agitando per 15 minuti. Analizzare il campione con GCMS.

La raccolta e la modifica del liquor nero generato nel processo di spappolamento artigianale sarà uno dei seguenti: utilizzare questi scarti di pasta per determinare la capacità di biodegradazione di un singolo isolato batterico o di una coltura mista. Qui è mostrata la crescita aerobica misurata dalla densità ottica di un ceppo ambientale coltivato in terreno LB e terreno LB integrato con il 10% di liquor nero neutralizzato. Questi risultati indicano che questo batterio cresce in presenza di liscivio nero.

La crescita dell'isolato ambientale nei terreni LB è più rapida rispetto a quando viene coltivato in presenza di liscivio nero, ma la densità ottica inizia a diminuire dopo 62 ore. Mentre la crescita dell'isolato ambientale microbico in presenza di black liquor continua ad aumentare in densità ottica fino a dopo 230 ore di crescita. La curva di crescita dell'isolato ambientale microbico in presenza di liscivio nero rappresenta anche una crescita bifasica, il che suggerisce che il liquor nero contiene più di una fonte di carbonio che può essere utilizzata dall'isolato ambientale microbico e che esiste una preferenza per l'utilizzo dei nutrienti da parte del batterio.

Sono necessari ulteriori esperimenti per determinare la sua capacità di utilizzare il liquor nero per le esigenze di crescita. Si può anche determinare la crescita di un batterio su liscivio nero non neutralizzato o determinare l'effetto di un aumento delle concentrazioni di liscivio nero sulla crescita. Dopo aver dimostrato la crescita sul liquor nero, si può determinare l'utilizzo della fonte di carbonio utilizzando esperimenti minimi di crescita del terreno.

I substrati commerciali che costituiscono i componenti della lignocellulosa possono essere utilizzati come fonti di carbonio nei mezzi minimi. Il protocollo di estrazione LIGNOCELLULOSA qui presentato fornisce un modello per determinare i requisiti di crescita del batterio raffigurato Ecco la crescita dell'isolato microbico ambientale su M nove. Minima media agar integrata con ogni componente dell'estrazione della lignocellulosa.

La presenza di colonie sulle piastre di agar del terreno minimo indica la capacità dell'isolato ambientale di degradare le colonie di olocellulosa, cellulosa, emicellulosa e lignina presenti su M nine. Un numero minimo di terreni può suggerire la capacità dell'isolato ambientale di degradare l'agar al posto delle piastre. Le curve di crescita minime dei terreni per le colture liquide potrebbero anche essere utilizzate per determinare il tasso di crescita specifico su ciascuna frazione di lignocellulosa in modo che l'agar, che potrebbe essere una potenziale fonte di carbonio, non debba essere aggiunto.

L'analisi degli occhi estratti e derivati, le colture batteriche mediante GCMS rivela i prodotti metabolici prodotti. Qui è mostrato lo spettro GCMS dei derivati TMS presenti nel campione non inoculato, lo spettro dei derivati TMS prodotti dall'isolato microbico ambientale quando coltivato anaerobicamente e M nine, terreno minimo con il 10% di liquor nero non neutralizzato è raffigurato qui. Il confronto tra i due spettri rivela differenze nei componenti presenti nei mezzi suggerendo la presenza di prodotti di fermentazione e la degradazione dei componenti del liquor nero.

Nel campione inoculato è apparso un picco con un tempo di ritenzione di 39,34 minuti. Un picco con un tempo di ritenzione di 21 virgola 84 minuti è aumentato nel campione inoculato. Un picco con un tempo di ritenzione di 25,79 è diminuito nel campione inoculato.

Lo spettro mostrato qui è quello dello standard guac, che è stato utilizzato per identificare il picco con un tempo di ritenzione di 25,79 minuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare se un microrganismo o un consorzio di microrganismi può degradare il liquor nero. Inoltre, seguendo questo protocollo, è possibile utilizzare altri metodi come le curve di crescita per rispondere a ulteriori domande sul tasso di crescita di uno o più microrganismi su varie concentrazioni di componenti dell'estratto di liscivio nero o ligon.