Name: Metodi per facilitare la crescita microbica sui flussi di rifiuti delle cartiere e caratterizzazione del potenziale di biodegradazione dei microbi coltivati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: Scopri metodi per facilitare la crescita microbica sui flussi di rifiuti delle cartiere e caratterizzare il potenziale di biodegradazione. Questo protocollo utilizza la Black Liquor come substrato per isolati ambientali.

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Vorremmo ringraziare Jim McMurray per aver fornito il liquore nero e il Dr. David Tilotta e August Meng per il loro aiuto con GC-MS. Il sostegno a Stephanie L. Mathews è stato fornito da una borsa di studio per i bisogni nazionali dell'USDA (numero di premio 2010-38420-20399).

1. Raccolta di liquore nero e preparazione di liquore nero per colture di crescita
<ol>
	<li>Raccogliere un campione di liquore nero dalla valvola di uscita collegata al digestore kraft in una bottiglia di vetro sterile e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere con i seguenti passaggi. 
	neutralizzazione</li>
	<li>Aggiungere 100 ml di campione di liquore nero in un becher da 500 ml dotato di una barra di agitazione.</li>
	<li>Posizionare il bicchiere su una piastra per mescolare e regolare la velocità su media.</li>
	<li>Aggiungere lentamente gocce di acido fosforico fino a quando il liquor nero diventa viscoso (viscosità simile al glicerolo).</li>
	<li>Aliquotare tutta la soluzione di liquore nero versandola lentamente in provette coniche da 50 ml e centrifugare a 9,300 x g per 30 minuti.</li>
	<li>Posizionare il surnatante nel becher e misurare il pH utilizzando i nastri per il test del pH. Il pellet di lignina precipitata può essere scartato e trattato come rifiuto solido non pericoloso.</li>
	<li>Continuare ad aggiungere acido fosforico e centrifugare la soluzione fino a quando le strisce di pH indicano un pH neutro del surnatante. 
	sterilizzazione</li>
	<li>Passare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm per rimuovere eventuali batteri contaminanti e posizionare la soluzione filtrata in un contenitore sterile per la conservazione. Conservare a temperatura ambiente.</li>
</ol>
2. Estrazione della lignocellulosa
Separazione dei carboidrati
<ol>
	<li>Mettere 5 g di panico verga, pino o erba delle Bermuda (macinata con particelle di 1 mm o inferiore) in un pallone di Erlenmeyer da 500 ml. Quindi aggiungere 200 ml di acqua distillata o deionizzata, 7,5 g di NaClO2, 2,5 ml di acido acetico glaciale e una barra di agitazione al pallone.</li>
	<li>Immergere il pallone in un bagno d'olio posto sopra una piastra di agitazione a 80 °C per 1 ora. Regolare la velocità della piastra di agitazione su media.</li>
	<li>Aggiungere altri 7,5 g di NaClO2 e 2,5 ml di acido acetico glaciale al pallone. Continuare a mescolare a 80 °C nel bagno d'olio per 30 min.</li>
	<li>Ripetere il passaggio precedente 2 volte (Nota: un totale di 30 g di NaClO2 e 10 ml di acido acetico glaciale vengono aggiunti al pallone contenente la biomassa lignocellulosica). Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mettere un foglio di carta da filtro in un imbuto Büchner. Posizionare l'imbuto sopra un pallone a braccio laterale e fissarlo a un aspirapolvere.</li>
	<li>Versare lentamente la soluzione nell'imbuto.</li>
	<li>Lavare il materiale solido 3 volte con 100 ml di acqua distillata o deionizzata. Scartare il filtrato dopo aver lavato il materiale solido.</li>
	<li>Mettere da parte 1 g di materiale solido e posizionarlo su un foglio di carta da filtro pulito.</li>
	<li>Asciugare questo materiale solido per una notte in un forno a 50 °C. Dopo aver tolto il campione dal forno, metterlo in una fiala con l'etichetta "olocellulosa".</li>
	<li>Aggiungere il materiale solido rimanente a 250 ml di NaOH al 10% (v/v) in un matraccio di Erlenmeyer da 500 ml. Tappare il pallone con un tappo.</li>
	<li>Porre la soluzione in un'incubatrice a 70 °C per 1 ora agitando a 250 giri/min.</li>
	<li>Raffreddare la soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere il materiale solido utilizzando carta da filtro e imbuto Büchner fissato a un pallone a braccio laterale.</li>
	<li>Trasferire il materiale solido su un foglio pulito di carta da filtro in un forno a 50 °C e lasciarlo asciugare per una notte.</li>
	<li>Dopo che il residuo si è asciugato, metterlo in una fiala di conservazione ed etichettarlo come "cellulosa".</li>
	<li>Trasferire il filtrato dal punto 2.13 in un matraccio di Erlenmeyer da 500 ml e aggiungere 30 ml di acido acetico e 250 ml di alcol isopropilico. Tappare il pallone e posizionare la soluzione sul piano di lavoro per almeno 8 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire tutta la soluzione in provette coniche da 50 ml e centrifugare la soluzione a 9.300 x g per 30 minuti. Pipettare con cura la soluzione dalla provetta conica e gettarla.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 30 ml di acqua distillata o deionizzata mediante vortex.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 2.17-2.18 15 volte per lavare accuratamente il pellet.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e conservare il pellet per la liofilizzazione. Una volta liofilizzato, raccogliere il campione e metterlo in una fiala etichettata "emicellulosa". 
	Separazione della lignina 
	Protocollo di separazione della lignina basato su Karaaslan et al. 12</li>
	<li>Aggiungere 5 g di panico verga, pino o erba delle Bermuda (macinata a particelle di 1 mm o inferiore) a 500 ml di una soluzione di NaOH 0,25 M e etanolo al 30%. Porre il liquame in un'incubatrice a 75 °C con agitazione a 250 giri/min per 2 ore.</li>
	<li>Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mettere un foglio di carta da filtro in un imbuto Büchner sopra un pallone a braccio laterale. Collegare a un aspirapolvere e versare lentamente la soluzione nell'imbuto.</li>
	<li>Scartare il materiale solido.</li>
	<li>Aggiungere un'ancoretta al pallone contenente il filtrato e posizionare il pallone sopra una piastra di agitazione regolata a velocità media. Aggiungere acido cloridrico concentrato goccia a goccia alla soluzione fino ad ottenere un pH di 2,0 (circa 20 ml).</li>
	<li>Lasciare riposare la soluzione acidificata per una notte a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione a 9.300 x g per 30 minuti in provette coniche. Pipettare con cura la soluzione dal tubo conico e gettarla.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 30 ml di acqua distillata o deionizzata mediante vortex.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 2.27-2.28 15 volte per lavare accuratamente il pellet.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e conservare il pellet per la liofilizzazione. Una volta liofilizzato, posizionare il campione in una fiala etichettata come "lignina".</li>
</ol>
3. Preparazione di colture microbiche per la crescita
Piastre di agar
<ol>
	<li>Aggiungere lo 0,2% (p/v) di prodotti sterili per l'estrazione della lignocellulosa al terreno minimo M9da 13 agar prima di versare le piastre.</li>
	<li>Piastre solidificate a strisciamento con circa 200 ul di coltura batterica coltivata in terreno minimo M9 con un diametro esterno di circa 2,0.</li>
	<li>Incubare le piastre a 37 °C e monitorare la crescita. 
	Colture liquide</li>
	<li>Aggiungere 50 ml di terreno sterile Luria-Bertani (LB)13 o M9 minimo13 in un pallone sterile da 125 ml. Aggiungere liquor nero al 10% (v/v) o allo 0,2% (p/v) di prodotti di estrazione della lignocellulosa.</li>
	<li>Inoculare il terreno con lo 0,1% (v/v) di una coltura batterica con un O.D. di circa 2,0.</li>
	<li>Incubare le colture a 37 °C con agitazione a 200 giri/min.</li>
	<li>Valutare la crescita ogni 6 ore durante il periodo di coltura misurando la densità ottica (λ = 600 nm). Mettere un'aliquota di 1 ml di coltura in una cuvetta. Determinare la densità ottica della coltura oscurata rispetto a terreni non inoculati.</li>
	<li>Trasferire i batteri in un flacone di siero anaerobico a metà della fase logaritmica.
	<ol>
		<li>Per preparare il flacone di siero anaerobico: sigillare il flacone di siero con un tappo di gomma butilica e un tappo a crimpare in alluminio in condizioni aerobiche e in autoclave. Non modificare lo spazio di testa all'interno del flacone del siero dopo la sterilizzazione.</li>
		<li>Trasferire l'intera coltura da 50 ml dal pallone da 125 ml nel flacone di siero sterile sigillato utilizzando una siringa.</li>
		<li>Incubare a 37 °C agitando a 200 giri/min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Preparazione del campione per GC-MS
Prepara i campioni secondo Raj, Reddy e Chandra14. Il controllo negativo utilizzato per il confronto è costituito da un terreno minimo M9 con il 10% di liquore nero ed è anche indicato come campione non inoculato.
<ol>
	<li>Centrifugare colture batteriche non inoculate e inoculate (50 ml) a 9.300 x g per 30 minuti dopo 450 ore di incubazione.</li>
	<li>Trasferire 10 ml di surnatante in una provetta di vetro. (Nota: la plastica è incompatibile con le sostanze chimiche nei passaggi seguenti.)</li>
	<li>Acidificare il surnatante con HCl concentrato a pH 1-2.</li>
	<li>Aggiungere 3 volumi di acetato di etile (30 ml), tappare il tubo e mescolare capovolgendo 4-6x.</li>
	<li>Mettere una piccola quantità di Na2SO4 anidro (1-2 g) in una provetta di vetro pulita.</li>
	<li>Raccogliere con cura lo strato organico (in alto) dalla soluzione di acetato di etile pipettandolo con una pipetta monouso in vetro Pasteur.</li>
	<li>Posizionare lo strato organico nella provetta con Na2SO4 anidro.</li>
	<li>Disidratare lo strato organico su Na2SO4 anidro picchiettando delicatamente la provetta per mescolare. Aggiungere gradualmente piccole quantità di Na2SO4anidro e mescolare fino a quando non ci sono grossi grumi.</li>
	<li>Mettere un foglio di carta da filtro in un imbuto Büchner sopra un pallone a braccio laterale fissato a un aspirapolvere.</li>
	<li>Versare la soluzione nell'imbuto. Scartare il materiale solido.</li>
	<li>Trasferire la soluzione in un pallone di evaporazione e far evaporare il filtrato utilizzando un evaporatore rotante.</li>
	<li>Introdurre 3 mg di residuo di estrazione dell'acetato di etile in un flaconcino da 2 ml di cromatografia ambrata.</li>
	<li>Sciogliere il residuo con l'aggiunta di 100 μl di 1,4-diossano e 10 μl di piridina.</li>
	<li>Aggiungere 50 μl di N,O-Bis(trimetilsilil) trifluoroacetammide con trimetilcolorsilano 99:1% (BSTFA). Porre quindi in un'incubatrice a 60 °C agitando per 15 min.</li>
	<li>Conservare i campioni a 4 °C fino al momento dell'uso.</li>
</ol>
5. GC-MS
Equipaggia il gascromatografo (GC) interfacciato con uno spettrometro di massa (MS) con una colonna capillare non polare ed elio come gas di trasporto con una portata di 1 ml/min.
<ol>
	<li>Dopo che la temperatura del forno si è stabilizzata a 50 °C, iniettare 1 μl di campione con un rapporto di divisione di 1/50.</li>
	<li>Tenere la colonna a 50 °C per 5 minuti e aumentare a 280 °C a 5 °C/min. Mantenere la temperatura finale di 280 °C per 20 minuti.</li>
	<li>Mantenere la linea di trasferimento tra il gascromatografo e lo spettrometro di massa a 300 °C.</li>
	<li>Selezionare un ritardo del solvente di 15 min.</li>
	<li>Registrare spettri di massa a ionizzazione elettronica compresi tra 10 e 500 (m/z) con un'energia elettronica di 70 eV.</li>
	<li>Derivatizzare e cromatografare standard come sopra. Identifica i composti confrontando i tempi di conservazione degli standard acquistati o dei dati nel database spettrale di massa del National Institute of Standards and Technology (NIST).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo descrive una combinazione di tecniche che mira a identificare i microrganismi che possono degradare gli scarti della cellulosa, le fonti di carbonio utilizzate durante la crescita sugli scarti della pasta e i prodotti metabolici microbici prodotti quando vengono coltivati sugli scarti della cellulosa. Abbiamo dimostrato il successo di questo protocollo con l'isolato microbico ambientale: un anaerobo facoltativo che può crescere con il 10% di liscivio nero e utilizzare i componenti di estrazione della li...

La spappolatura del legno è un processo chimicamente intensivo che è stato ottimizzato nel corso di molti anni per creare un sistema con il minimo spreco. Tuttavia, alcuni risultati di questo processo potrebbero essere utilizzati per produrre prodotti di valore superiore. Il liquore nero è uno di questi esempi. Viene generato dal processo kraft, che è il metodo di produzione chimico dominante, che rappresenta l'85% della produzione mondiale di lignina1. Il processo kraft (Figura 1) utilizza la temperatura (160-200 °C), la pressione (120 psig) e le sostanze chimiche contenute nel liquor bianco (idrossido di sodio e solfuro di sodio) per sciogliere la lignina dalle fibre di legno2,3. Il liquor nero contiene lignina, acidi organici e sottoprodotti della degradazione dei polisaccaridi4. Viene incenerito per produrre vapore e recuperare sostanze chimiche nella caldaia di recupero che fornisce energia termica per i processi di produzione della carta e pasta di legno a valle. Il volume di liscivio nero generato dalla polpa può superare la quantità che la caldaia di recupero può elaborare efficacemente. Smaltire il liquor nero come effluente influisce negativamente sulla flora e la fauna acquatica e quindi non è un'opzione. L'applicazione di organismi microbici che potrebbero utilizzare il black liquor per la crescita sarebbe vantaggiosa in termini di aumento del recupero chimico e della generazione di prodotti a valore aggiunto che migliorerebbero l'analisi complessiva del ciclo di vita del sistema di spappolamento. La conversione chimica e biologica dei monomeri derivati dalla lignina ha prodotto con successo vanillina e acido cinnamico da utilizzare come dolcificanti alimentari e additivi per fragranze, fenolo utilizzato per plastica e resine e cicloesano, che potrebbe essere utilizzato come carburante5.
Il lavoro precedente sulla biodegradazione di questi scarti di cellulosa si è concentrato sulla depolimerizzazione della lignina. L'International Lignin Institute (ILI) riferisce che ogni anno vengono prodotte tra i 40 e i 50 milioni di tonnellate di lignina (http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php). Solo l'1,5% di quella lignina viene utilizzato per processi industriali commerciali6. La depolimerizzazione della lignina da parte degli enzimi laccasi e perossidasi prodotta dai funghi del marciume bianco dei generi Phanerochaete e Trametes è stata studiata a lungo7. Anche i batteri del suolo noti per degradare i composti aromatici come Nocardia e Rhodococcus8, Pseudomonas putida mt-29 e Streptomyces viridosporus T7A10 hanno dimostrato di essere in grado di degradare la lignina. La degradazione batterica degli scarti della pasta di legno è promettente perché alcuni batteri possono prosperare nelle condizioni saline e alcaline (pH 10-14) che caratterizzano gli effluenti degli scarti della pasta11. Mentre la lignina è il componente principale del liquor nero, i microrganismi possono anche degradare gli altri componenti che compongono il liquor nero. Queste tecniche non identificano esclusivamente i microrganismi che degradano la lignina, ma servono a identificare i microrganismi che possono essere applicati direttamente al liquor nero di scarto della pasta invece dei suoi costituenti ulteriormente lavorati.
Il liquore nero è stato raccolto e modificato per la crescita microbica attraverso la neutralizzazione e la sterilizzazione con filtro. I requisiti di crescita microbica per un isolato microbico ambientale sono stati identificati mediante esperimenti di crescita minima su componenti lignocellulosici prodotti da un nuovo protocollo di estrazione della lignocellulosa. I terreni di crescita sono stati analizzati mediante gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS) per determinare i prodotti metabolici dell'isolato microbico ambientale quando coltivato su liscivio nero come unica fonte di carbonio. La combinazione di queste tecniche fornisce uno strumento di valutazione per determinare la capacità metabolica di un microrganismo quando viene coltivato su scarti di cartiera come il liquor nero. L'uso di tali tecniche offre anche informazioni sul valore dell'applicazione di microrganismi specifici ai rifiuti delle cartiere per la generazione di sottoprodotti.

<table><tbody><tr><td>1,4-diossano (certificato ACS)</td><td>Fisher</td><td>D111</td><td>Infiammabile, preossidabile chimico</td></tr><tr><td>Black</td><td>Liquor Dipartimento di biomateriali forestali presso la North Carolina State University</td><td>N/A</td><td>pH 12,72, 13,67% di solidi</td></tr><tr><td>Etanolo (grado microbiologico)</td><td>Fisher</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di etile (grado di reagente ACS)</td><td>EMD</td><td>EX0240-9</td><td>Infiammabile</td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale (Certificato ACS)</td><td>EMD</td><td>AX0073</td><td>Guaiacolo corrosivo</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1136</td><td>Dannoso per ingestione, corrosivo</td></tr><tr><td>Colonna capillare HP-5</td><td>Agilent</td><td>19091J-577</td><td>60 m x 0,18 mm diametro interno, 0,18 &mu; m spessore</td></tr><tr><td>Acido cloridrico (certificato ACS)</td><td>EMD</td><td>HX0603P</td><td></td></tr><tr><td>N,O-Bis(trimetilsilil)trifluoroacetammide con trimetilcolorsilano 99:1% (BSTFA)</td><td>Fluka</td><td>15238</td><td>Infiammabile, provoca ustioni cutanee e danni agli occhi con contatto</td></tr><tr><td>Na2SO4 (grado FCC)</td><td>VWR</td><td>BDH8026</td><td></td></tr><tr><td>NaClO2 (80%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244155</td><td>Infiammabile, tossico &nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH (certificato ACS)</td><td>EMD</td><td>1.06498.1000</td><td>Nastri per</td></tr><tr><td>il test del pH corrosivo Alkacid</td><td></td> Fisher <td>A979</td><td></td></tr><tr><td>Acido fosforico (certificato ACS)</td><td>Spettrometro</td> di massa Fisher <td>A242</td><td></td></tr><tr><td>Polaris Q&nbsp;</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piridina (99%)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12005</td><td>Infiammabile, tossico a contatto con la pelle</td></tr><tr><td>Panico verga</td><td>Cherry Research Farm Goldsboro, NC</td><td>N/A</td><td>Raccolto nell'agosto 2011</td></tr><tr><td>Termo Finnigan gascromatografo in tracce</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman n. 1 carta da filtro</td><td>Whatman</td><td>1001-150</td><td></td></tr></tbody></table>

metodi per facilitare la crescita microbica sui flussi di rifiuti delle cartiere e caratterizzazione del potenziale di biodegradazione dei microbi coltivati

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

Il processo kraft viene applicato ai trucioli di legno per la separazione della lignina dai polisaccaridi all'interno della lignocellulosa per la cellulosa che produrrà una carta di alta qualità. Il black liquor è uno scarto di pasta di legno generato dal processo kraft che ha un potenziale di bioconversione a valle. Tuttavia, la natura recalcitrante delle risorse lignocellulosiche, i suoi derivati chimici che costituiscono la maggior parte del carbonio organico disponibile all'interno del black liquor e il suo pH basico presentano sfide per la biodegradazione microbica di questo materiale di scarto. I metodi per la raccolta e la modifica del black liquor per la crescita microbica mirano all'utilizzo di questi scarti di polpa per convertire la lignina, gli acidi organici e i sottoprodotti della degradazione dei polisaccaridi in sostanze chimiche preziose. Le tecniche di estrazione della lignocellulosa presentate forniscono un metodo riproducibile per la preparazione di substrati di crescita della lignocellulosa per comprendere le capacità metaboliche dei microrganismi in coltura. L'uso della gascromatografia-spettrometria di massa consente l'identificazione e la quantificazione dei prodotti di fermentazione derivanti dalla crescita di microrganismi sugli scarti della pasta di legno. Questi metodi, se usati insieme, possono facilitare la determinazione dell'attività metabolica dei microrganismi con il potenziale di produrre prodotti di fermentazione che fornirebbero un valore maggiore al sistema di spappolamento e ridurrebbero gli sprechi di effluenti, aumentando così i potenziali profitti della macinazione della carta e offrendo ulteriori usi per il liquor nero.

La raccolta e la modifica del licore nero generato nel processo di cottura kraft (Figura 1) permetterà di utilizzare questo residuo di lavorazione per determinare la capacità di biodegradazione di un singolo isolato batterico o di una coltura mista. Figura 2 mostra la crescita aerobica misurata mediante densità ottica dell'isolato microbico ambientale coltivato in terreno LB da solo e in terreno LB arricchito con il 10% di licore nero neutralizzato. Questi risultati indicano che questo b...

I rifiuti industriali possono essere raccolti e modificati per analizzare la crescita microbica. Le tecniche di estrazione della lignocellulosa forniscono componenti per analizzare la capacità di biodegradazione specifica. La gascromatografia-spettrometria di massa identifica i prodotti di fermentazione di microrganismi cresciuti sugli scarti della pasta di legno. Questi metodi determinano la capacità metabolica dei microrganismi di degradare gli scarti della pasta di legno.

Metodi per facilitare la crescita microbica sui flussi di rifiuti delle cartiere e caratterizzazione del potenziale di biodegradazione dei microbi coltivati

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare la capacità di un microorganismo o di un consorzio microbico di utilizzare il residuo di lavorazione noto come licore nero come fonte per la crescita, identificare le componenti del licore nero utilizzate per la crescita e individuare i prodotti generati dal metabolismo microbico di questo residuo di lavorazione. Questo viene ottenuto raccogliendo il licore nero derivante dalla lavorazione e preparandolo per l'uso come componente di un terreno di coltura. Come secondo passaggio, vengono estratte le componenti lignocellulosiche, che vengono utilizzate per determinare i requisiti del microorganismo in termini di fonte di carbonio.Successivamente, i mezzi di coltura vengono preparati, inoculati e analizzati per la crescita microbica al fine di determinare la capacità dei microrganismi di svilupparsi sul licore nero e sui suoi componenti. I risultati mostrano l'utilizzo del licore nero come unica fonte di carbonio per la crescita e la sintesi di prodotti metabolici da parte dell'isolato microbico ambientale, sulla base della crescita osservata su piastre di agar con mezzo minimo e mediante GCMS. L'idea iniziale di questo metodo è emersa durante una discussione sulla possibilità che alcuni microrganismi potessero svilupparsi sui residui di lavorazione della pasta di legno e che potessimo isolare tali microrganismi direttamente da un impianto di produzione della carta.Il principale vantaggio della tecnica di estrazione della zignal cellulosa rispetto ai metodi esistenti oggi, come la candeggiatura con idrossido di sodio, è che la candeggiatura con cloruro di sodio offre un'alta e maggiore purezza. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Infatti, i passaggi di preparazione della cellulosa Theo e dei campioni per GCMS sono difficili da apprendere, a causa del numero di operazioni richieste e della necessità di valutazioni visive per verificare il completamento del processo.Questo metodo non solo può fornire informazioni sulla degradazione microbica del licore nero, ma può anche essere applicato a flussi di rifiuti industriali contenenti materiali di cellulosa Magno, come residui colturali, residui forestali e rifiuti solidi urbani. Per iniziare questa procedura, raccogliere il campione di licore nero dal rubinetto di scarico collegato al digestore artigianale in una bottiglia di vetro sterile, e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere al passaggio successivo. Quindi aggiungere 100 millilitri del campione di licore nero in un becher da 500 millilitri dotato di una barretta magnetica e mescolare il campione a velocità media.Neutralizzare il licore nero aggiungendo acido fosforico goccia a goccia fino a quando diventa viscoso. Successivamente, trasferire tutta la soluzione di licore nero in provette coniche da 50 millilitri e centrifugare i campioni a 9.300 G per 30 minuti. Per separare i carboidrati, inserire cinque grammi di switchgrass macinato con granulometria di un millimetro o inferiore e un bacchetta magnetica in un matraccio da 500 millilitri.Quindi aggiungere 200 millilitri di acqua distillata, 7,5 grammi di clorito di sodio e 2,5 millilitri di acido acetico glaciale. Posizionare il pallone in un bagno d'olio posto su un agitatore magnetico alla temperatura di 80 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, aggiungere ulteriori 7,5 grammi di cloruro di sodio e 2,5 millilitri di acido acetico glaciale al pallone.Continuare a mescolare a 80 gradi Celsius per 30 minuti dopo aver ripetuto il passaggio precedente due volte. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente. Quindi filtrarla attraverso un imbuto di Büchner sotto vuoto per isolare il materiale solido.Lavare il materiale solido tre volte con 100 millilitri di acqua distillata. Successivamente, raccogliere un grammo del materiale solido e posizionarlo su un foglio pulito di carta da filtro. Lasciare asciugare il solido a 50 gradi Celsius per tutta la notte.Dopo aver rimosso il campione dal forno il giorno seguente, trasferirlo in un vial di conservazione etichettato come cella cava. Aggiungere il materiale solido rimanente in un matraccio da 500 millilitri contenente 250 millilitri di idrossido di sodio al 10%, quindi chiudere il matraccio con il tappo. Collocare la soluzione in un incubatore a 70 gradi Celsius per un'ora con agitazione a 250 giri al minuto.Successivamente, lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, isolare il materiale solido mediante filtrazione a vuoto utilizzando un imbuto di Büchner. Una volta che il residuo solido è stato essiccato per tutta la notte in un forno a 50 gradi Celsius, riporlo in un contenitore contrassegnato come cellulosa. Trasferire il filtrato in un matraccio da 500 millilitri e aggiungere 30 millilitri di acido acetico e 250 millilitri di alcol isopropilico, chiudere con tappo e lasciare la soluzione risultante in posa sul banco di lavoro per almeno otto ore a temperatura ambiente.Al termine, trasferire tutta la soluzione in provette coniche da 50 millilitri e centrifugare il campione a 9.300 G per 30 minuti. Dopo la centrifugazione, pipettare con attenzione la soluzione dalle provette coniche e scartarla. Successivamente, lavare i pellet con 30 millilitri di acqua distillata mediante vortex e centrifugare a 9.300 G per 30 minuti.Ripetere questo passaggio 15 volte per lavare accuratamente il pellet. Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante per isolare il pellet da sottoporre a liofilizzazione. Una volta che il campione è stato liofilizzato, collocarlo in un vial etichettato emicellulosa.Per la separazione della lignina, aggiungere cinque grammi di switchgrass macinato con dimensioni di un millimetro o inferiori a una soluzione di 500 millilitri di idrossido di sodio 0,25 molare e al 30% di etanolo. Collocare la sospensione in un incubatore a 75 gradi Celsius con agitazione a 250 giri al minuto per due ore. Dopo aver filtrato la soluzione raffreddata, aggiungere una barretta magnetica al matraccio e posizionarlo su un agitatore regolato a velocità media.Aggiungere l'acido cloridrico concentrato alla filtrata, goccia a goccia, fino a ottenere un pH di due. Lasciare riposare la soluzione tutta la notte a temperatura ambiente. Dopo aver trasferito la soluzione in provette coniche da 50 millilitri, centrifugare i campioni a 9.300 ×g per 30 minuti.Una volta terminato, prelevare attentamente la soluzione dal tubo conico e scartarla. Lavare il precipitato con 30 millilitri di acqua distillata mediante vortex e centrifugare a 9.300 G per 30 minuti. Ripetere questo passaggio 15 volte per lavare accuratamente il precipitato.Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante per isolare il pellet da sottoporre a liofilizzazione. Una volta liofilizzato, collocare il campione in una provetta etichettata come lignina. Aggiungere 50 millilitri di mezzo minimo sterile M9 in un matraccio sterile da 125 millilitri.Quindi aggiungere il 10% in volume della licore nera al mezzo. Per l'inoculo, aggiungere lo 0,1% in volume di una coltura batterica ottenuta dopo una notte di crescita alla miscela, quindi incubare le colture a 37 gradi Celsius in un incubatore sotto agitazione a 200 giri al minuto. Alla fase logaritmica media, trasferire i batteri in una bottiglia sterile sigillata per sieri anaerobici mediante siringa, dopo aver centrifugato le colture batteriche non inoculate e inoculate.Dopo 450 ore di crescita, aggiungere 10 millilitri di ciascun surnatante in provette di vetro separate. Acidificare ciascun surnatante con acido cloridrico concentrato aggiunto goccia a goccia fino a pH da uno a due. Per ogni campione, aggiungere 30 millilitri di acetato di etile al surnatante.Dopo aver chiuso il tubo a sonda, mescolare la soluzione capovolgendo il tubo da quattro a sei volte. Quindi aggiungere da uno a due grammi di solfato di sodio anidro in un tubo a sonda di vetro pulito. Raccogliere con attenzione lo strato organico superiore mediante pipettaggio con la pipetta di Pasteur in vetro monouso.Posizionare lo strato organico nel tubo a saggio contenente il solfato di sodio anidro. Disidratare lo strato organico sul solfato di sodio anidro agitando delicatamente il tubo per mescolare gradualmente. Aggiungere piccole quantità di solfato di sodio anidro e mescolare fino a quando non ci sono più grumi di grandi dimensioni.In seguito, filtrare la soluzione attraverso un imbuto di Büchner sotto vuoto, quindi trasferire la soluzione in un pallone da evaporazione ed evaporare il filtrato utilizzando un evaporatore rotante. Al termine, inserire tre milligrammi dei residui dell'estrazione con acetato di etile in un vial da cromatografia ambrato da due millilitri. Sciogliere il residuo con 100 microlitri di 1,4-diossano e 10 microlitri di piridina.Quindi aggiungere 50 microlitri di una soluzione di B-S-T-F-A con il 1% di cloruro di trimetile al vial. Collocare la soluzione in un incubatore a 60 gradi Celsius con agitazione per 15 minuti. Analizzare il campione mediante GCMS.La raccolta e la modifica del licore nero generato nel processo artigianale di cottura della pasta di legno permetterà, in un primo tempo, di utilizzare questo rifiuto di cottura per determinare la capacità di biodegradazione di un singolo isolato batterico o di una coltura mista. Qui viene mostrata la crescita aerobica misurata mediante densità ottica di un ceppo ambientale coltivato in terreno LB e in terreno LB integrato con il 10% di licore nero neutralizzato. Questi risultati indicano che questo batterio è in grado di crescere in presenza di licore nero.La crescita dell'isolato ambientale in terreno LB è più rapida rispetto alla crescita in presenza di licore nero, ma la densità ottica inizia a diminuire dopo 62 ore. Al contrario, la crescita dell'isolato microbico ambientale in presenza di licore nero continua ad aumentare nella densità ottica fino a oltre 230 ore di crescita. La curva di crescita dell'isolato microbico ambientale in presenza di licore nero mostra anche una crescita bifasica, il che suggerisce che il licore nero contiene più di una fonte di carbonio utilizzabile dall'isolato microbico ambientale e che il batterio manifesta una preferenza nell'utilizzo dei nutrienti.Sono necessari ulteriori esperimenti per determinare la sua capacità di utilizzare il licore nero per soddisfare i requisiti di crescita. Si può inoltre valutare la crescita di un batterio su licore nero non neutralizzato oppure determinare l'effetto di concentrazioni crescenti di licore nero sulla crescita. Dopo aver dimostrato la crescita sul licore nero, è possibile analizzare l'utilizzo della fonte di carbonio mediante esperimenti di crescita su terreni minimi.I substrati commerciali che costituiscono i componenti della lignocellulosa possono essere utilizzati come fonti di carbonio nei mezzi minimi. Il protocollo di estrazione della LIGNOCELLULOSE presentato qui fornisce un modello per determinare i requisiti di crescita del batterio mostrato. Qui è illustrata la crescita dell'isolato microbico ambientale su agar M nine, un mezzo minimo integrato con ciascun componente dell'estrazione della lignocellulosa.La presenza di colonie sulle piastre di agar con terreno minimo indica la capacità dell'isolato ambientale di degradare olocellulosa, cellulosa, emicellulosa e lignina, colonie presenti su M nove. La crescita su terreno minimo potrebbe suggerire la capacità dell'isolato ambientale di degradare l'agar piuttosto che le frazioni lignocellulosiche. Le curve di crescita su terreno minimo per colture liquide potrebbero essere utilizzate anche per determinare il tasso specifico di crescita su ciascuna frazione lignocellulosica, in modo che l'agar, che potrebbe rappresentare una fonte di carbonio potenziale, non debba essere aggiunto.L'analisi mediante GCMS di estratti e derivati, colture batteriche, rivela i prodotti metabolici prodotti. Qui è mostrato lo spettro GCMS dei derivati TMS presenti nel campione non inoculato, lo spettro dei derivati TMS prodotti dall'isolato microbico ambientale quando coltivato in condizioni anaerobiche e M nine, mezzo minimo con il 10% di licore nero non neutralizzato, rappresentato in questa sede. Il confronto dei due spettri rivela differenze nei componenti presenti nel mezzo, suggerendo la presenza di prodotti di fermentazione e la degradazione di componenti del licore nero.Un picco con un tempo di ritenzione di 39,34 minuti è apparso nel campione inoculato. Un picco con un tempo di ritenzione di 21,84 minuti è aumentato nel campione inoculato. Un picco con un tempo di ritenzione di 25,79 minuti è diminuito nel campione inoculato.Lo spettro mostrato qui è quello dello standard di guac, utilizzato per identificare il picco con un tempo di ritenzione di 25,79 minuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare se un microorganismo o un consorzio di microorganismi è in grado di degradare il licore nero. Inoltre, seguendo questo protocollo, puoi utilizzare altri metodi come le curve di crescita per rispondere ad ulteriori domande riguardo alla velocità di crescita di un microorganismo o di più microorganismi su diverse concentrazioni di componenti del licore nero o dell'estratto di lignina cellulosa.

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Metodi per facilitare la crescita microbica sui flussi di scarto delle cartiere e caratterizzazione del potenziale di biodegradazione dei microbi coltivati

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Metodi per facilitare la crescita microbica sui flussi di rifiuti delle cartiere e caratterizzazione del potenziale di biodegradazione dei microbi coltivati (Video) | JoVE Journal

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