Name: Colorazione istochimica di Arabidopsis thaliana Cellula secondaria Elementi da parete (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Scopri le tecniche di colorazione istochimica per visualizzare gli elementi della parete cellulare secondaria in Arabidopsis thaliana. Questo metodo consente di analizzare la composizione dei tessuti legnosi nei gambi delle piante.

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Siamo grati a Sabin Russell per l&#39;assistenza editing. Questo lavoro è stato parte del DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org), sostenuto dal Dipartimento dell&#39;Energia degli Stati Uniti, Office of Science, Ufficio di Ricerca Biologica e Ambientale, attraverso il contratto di DE-AC02-05CH11231 tra il Lawrence Berkeley National Laboratory e il Dipartimento dell&#39;Energia degli Stati Uniti.

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<li>Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mutant+defective+in+the+general+phenylpropanoid+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway.</a> The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).</li>
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Gli autori non hanno conflitti finanziari da rivelare.

Sezioni di gambo A. thaliana sono ampiamente utilizzati per studiare l&#39;organizzazione delle cellule nella parete cellulare secondaria e di esaminare qualitativamente le differenze tra wild type e piante transgeniche. Le tecniche comunemente utilizzate per sezionare i campioni sono di taglio diretto a mano; o quando i campioni sono incorporati in agarosio o fissativo, sezionamento può essere fatto con un vibratomo o microtomo. In contrasto con il taglio manuale, gli ultimi due permettono riducendo il rischio...

La parete cellulare vegetale in possesso di una pletora di informazioni nelle sue varie componenti: la lignina, cellulosa, emicellulosa (silano, glucuronoxylan, xyloglucan, arabinoxilano collegamento misto glucano, o glucomannano), e pectina. Tecniche istologiche forniscono importanti indicazioni visive a studiare le differenze all&#39;interno delle pareti cellulari secondarie a livello organizzativo e cellulari. Varie tecniche istologiche sono stati sviluppati e sono disponibili in letteratura, ma queste tecniche può essere difficile e per principianti richiede tempo perché i protocolli molto dettagliate con semplici istruzioni visive sono quasi mai disponibili. L&#39;obiettivo di questo studio è quello di fornire semplici linee guida per tecniche di colorazione istologiche di ottenere immagini di alta qualità. Sezionare il tessuto stelo è il primo passo nella visualizzazione delle pareti cellulari e forme cellulari. Anche se le sezioni tagliate a mano sono poco costosi e richiedono meno tempo per preparare, l&#39;uso di un vibratome offre coerenza eproduce immagini di alta qualità. Utilizzando una vibratome permette di produrre una migliore qualità dei dati generando anche sezioni con lo stesso spessore, che aiuta a produrre immagini nitide e riduce significativamente il rischio di produrre differenze inesatti tra campioni che deriverebbe semplicemente da una cattiva preparazione del campione. Utilizzando resine di fissare campioni freschi può essere una sfida per principianti e può essere ancora molto tempo, anche per gli esperti quando l&#39;analisi deve essere fatto in fretta. Inoltre, diventa impossibile misurare qualsiasi attività biologica con il campione quando è stato incorporato in una resina. Una semplice tecnica che impiega uno stampo agarosio e fatta in casa è utile per l&#39;incorporamento tessuti dello stelo, e può anche essere utilizzato in altre applicazioni che richiedono dissezione dei tessuti molli. Rispetto al incorporamento esemplari in resina, questo metodo ha il vantaggio di mantenere i tessuti vivi e riducendo la manipolazione dei campioni. Sezionamento dei tessuti attraverso un vibratome è molto preciso e genera homogensezioni unità organizzative, che, a seconda della porta dello studio, possono poi essere utilizzati con diverse tecniche di colorazione diverse. I metodi più semplici per visualizzare lignina e altri aromatici impiegano raggi ultravioletti (UV). Eccitazione delle molecole aromatiche basate sulla luce UV è una vecchia tecnica, ma è ancora uno dei metodi più veloci per la visualizzazione di lignina. Tuttavia, la visualizzazione UV in realtà non è l&#39;ideale per il rilevamento della lignina, perché la luce UV ecciterà altri aromatici. La lignina è costituito principalmente da tre blocchi, i monolignols (alcoli hydroxycinnamyl: alcool coniferilico, alcol sinapyl, e alcool p-coumaryl) 1-3. Macchia Phloroglucinol può fornire indizi per la misura di cinnamaldehydes presenti nello xilema, fibre e tessuti tracheali 4. Phloroglucinol è un buon indicatore di cinnamaldehydes generali e può distinguere tra cinnamaldehydes e altri composti aromatici. I monomeri alcol sinapyl possono essere rilevatie differenziato dall&#39;uso di macchia Maule. Blu di toluidina O è un colorante policromatico e quindi ha la capacità di macchiare diversi elementi della parete cellulare in diversi colori 5,6. L&#39;uso primario di blu di toluidina O è rilevare pectina e lignina 5,6. Il vantaggio di usare blu di toluidina O è che molti elementi della parete cellulare possono essere visualizzati in un unico passaggio. Sia calcofluor bianco e congo rosso sono facili da lavorare e può essere utilizzato per visualizzare cellulosa. Macchie bianche calcofluor cellulosa, callosio, e altri β-glucani non sostituiti o debolmente sostituiti 6-9, mentre congo macchie rosse direttamente al β-(1 → 4)-glucani e in particolare alla cellulosa 10,11. L&#39;obiettivo di questo studio è fornire semplici linee guida per l&#39;utilizzo delle tecniche di colorazione di cui sopra per ottenere immagini di alta qualità da A. thaliana steli.

<table><tbody><tr><td>Agarosio</td><td>EMD</td><td>MERC2125</td><td>Numero CAS: 9012-36-6</td></tr><tr><td>Floroglucinolo</td><td>Sigma</td><td>P 3502</td><td>1,3,5-triidrossibenzene [Numero CAS: 108-73-6]</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>EMD</td><td>HX0603-75</td><td>Numero CAS: 7647-01-0</td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio</td><td>EMD</td><td>AX1303-6</td><td>Numero CAS: 1336-21-6</td></tr><tr><td>Blu di toulidina O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td>Cloruro di blutene, cloruro di tolonio [numero CAS 92-31-9]&nbsp;</td></tr><tr><td>Permanganato di potassio</td><td>Sigma</td><td>223468</td><td>numero CAS 7722-64-7&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanolo 190 proof</td><td>KOPTEC</td><td>V1401</td><td>Numero CAS: 64-17-5</td></tr><tr><td>Congo Red</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C6277</td><td>Disodio 3,3'-[[1,1'-bifenil]-4,4'-diilbis(azo)]bis(4-amminonaftalene 1-solfonato) [Numero CAS 573-58-0]</td></tr><tr><td>Sbiancante fluorescente 28/ Calcofluor White Stain</td><td>Sigma</td><td>F3543&nbsp;</td><td>acido 4,4'-bis[[4-[bis(2-idrossietil)ammino]-6-anilino-1,3,5-triazina-2-il]ammino]stilbene-2,2'-disolffonico [numero CAS 4404-43-7]&nbsp;</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica Microtomo a lama vibrante VT1000S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/</td></tr> <tr><td>Razor</td><td>American Safety razor company</td><td>Articolo # 60-0139-0000&nbsp;</td><td>Lama a doppio taglio in acciaio inox (Personna Super)</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga con tappo a vite (2 ml)</td><td>VWR</td><td>16466-044</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga (0,6 ml)</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>Guanto</td><td>Bel-Art</td><td>3800000000</td><td>SCIENCEWARE&nbsp; Hot Hand Protector</td></tr><tr><td>Mitt Adesivo per tessuti</td><td>Ted Pella Inc</td><td>10033</td><td>Negozio a 4 &deg; C o 20 gradi C per 3 mesi o più di conservazione</td></tr><tr><td>Microonde</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD762S</td><td>PELCO Pro CA 44 Adesivo istantaneo per tessuti&nbsp;</td></tr><tr><td>Fotocamera con chip CCD senza otturatore meccanico&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>C4742-95</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera a colori ad alta velocità&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Software per fotocamera QImaging</td><td>MicroPublisher 5.0 RTV</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>&nbsp; Molecular Devices</td><td>MetaMorph versione 7.7.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Immaginare l'analisi</td><td>Adobe&nbsp;</td><td>Occhiali Photoshop CS4</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover, quadrati, n. 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Gli occhiali Cover sono resistenti alla corrosione e uniformemente spessi e piatti. Lo spessore n. 1 è compreso tra 0,13 e 0,17 mm.</td></tr><tr><td>Micro vetrini smerigliati, 1 mm</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75 x 25 mm - 1 mm</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Alcan confezione</td><td>BRNDPM998</td><td></td></tr><tr><td>Cubo filtro TX2 Leica</td><td></td><td>11513851/11513885</td><td>Filtro utilizzato per l'analisi del rosso Congo con una banda passante di 560/40.</td></tr></tbody></table>

colorazione istochimica di<em&gt; arabidopsis thaliana</em&gt; cellula secondaria elementi da parete

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana è un organismo modello comunemente usato per comprendere e manipolare vari processi cellulari nelle piante, ed è stato ampiamente utilizzato nello studio della formazione della parete cellulare secondaria. La deposizione della parete cellulare secondaria si verifica dopo che la parete cellulare primaria è stata depositata, un processo eseguito esclusivamente da cellule specializzate come quelle che formano i vasi e i tessuti delle fibre. La maggior parte delle pareti cellulari secondarie è composta da cellulosa (40-50%), emicellulosa (25-30%) e lignina (20-30%). Sono state isolate diverse mutazioni che influenzano la biosintesi della parete cellulare secondaria e i mutanti corrispondenti possono o meno mostrare evidenti cambiamenti nella composizione biochimica o nei fenotipi visivi, poiché queste mutazioni potrebbero essere mascherate da risposte compensatorie. Le procedure di colorazione sono state storicamente utilizzate per mostrare le differenze su base cellulare. Questi metodi sono esclusivamente mezzi di analisi visivi; Tuttavia, il loro ruolo nell'analisi rapida e critica è di grande importanza. Il rosso Congo e il bianco calcofluor sono coloranti usati per rilevare i polisaccaridi, mentre il Mäule e il floroglucinolo sono comunemente usati per determinare le differenze nella lignina e il blu di toluidina O è usato per colorare in modo differenziale i polisaccaridi e la lignina. Le tecniche apparentemente semplici di sezionamento, colorazione e imaging possono essere una sfida per i principianti. A partire dalla preparazione del campione utilizzando il modello di A. thaliana, questo studio descrive in dettaglio i protocolli di una varietà di metodologie di colorazione che possono essere facilmente implementate per l'osservazione dell'organizzazione cellulare e tissutale nelle pareti cellulari secondarie delle piante.

Stem Embedding e Sezioni: L&#39;uso dello stampo plastica casalingo per incorporare gli steli in 7% agarosio rivelata facile e veloce (Figura 1). Le due parti (A e B; la figura 1) del sistema flaconcino incorporato rendono semplice per rilasciare facilmente stelo incorporato in agarosio come l&#39;agarosio non si attacca alle parti fiala che sono inerti, mantenendo il sistema pulito. Le fiale possono essere riutilizzati più volte per anni. La comodità di memorizzare stelo incorpo...

La composizione della parete cellulare vegetale varia tra i tipi di tessuto e può includere lignina, cellulosa, emicellulosa e pectina. Sono state sviluppate varie tecniche di colorazione per visualizzare le differenze a livello di tipo cellulare. Questo articolo è una raccolta di tecniche di colorazione della parete cellulare comunemente usate.

Colorazione istochimica di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cellula secondaria Elementi da parete

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

L'obiettivo generale di questa procedura è mostrare la colorazione istochimica degli elementi della parete cellulare secondaria ANA di Arabidopsis. Questo viene ottenuto innanzitutto incorporando il fusto della pianta nell'aros. Successivamente, il fusto incorporato nell'aros viene disincastonato e trasferito su dischi campione, che vengono quindi sezionati in sezioni trasversali STEM utilizzando un vibratomo.Successivamente, i campioni vengono sottoposti a diverse procedure di colorazione istochimica. Infine, mediante microscopia, si evidenziano le modifiche differenziali negli elementi della parete cellulare secondaria ottenute tramite la colorazione istochimica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla parete cellulare, come ad esempio i cambiamenti nei tessuti maculari dei fusti vegetali.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà perché passaggi semplici ma fondamentali menzionati nei protocolli qui riportati non sono stati documentati accuratamente o presentati in modo semplificato in precedenza. Per iniziare, preparare uno stampo fatto in casa per l'inclusione dei piccioli utilizzando provette di plastica. I

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In questo video, descriviamo la tecnica di colorazione Wiesner per colorare la lignina presente nelle cellule vegetali specializzate. Questa tecnica di colorazione aiuta a visualizzare le pareti cellulari lignificate negli steli di Arabidopsis thaliana e aiuta a quantificare la lignificazione nelle pareti cellulari di diversi tipi di cellule.

Colorazione Wiesner per la visualizzazione della lignina: una tecnica per colorare i depositi di lignina presenti negli steli di Arabidopsis thaliana

In questo video, descriviamo la tecnica di colorazione Maule per colorare la lignina siringil-lignina presente nelle cellule vegetali specializzate. Questa tecnica di colorazione aiuta a caratterizzare la distribuzione della lignina nello xilema e nelle fibre interfascicolari.

Colorazione del maule per la lignina: una tecnica per caratterizzare la distribuzione della lignina nelle sezioni dello stelo di Arabidopsis thaliana

In questo video, dimostriamo il metodo di colorazione del rosso Congo per visualizzare i depositi di cellulosa nelle sezioni dello stelo di Arabidopsis thaliana.

Colorazione con rosso Congo: una tecnica per visualizzare i depositi di cellulosa nelle sezioni del fusto delle piante

In questo video, descriviamo una procedura di colorazione per visualizzare la deposizione di cellulosa all'interno delle pareti cellulari di Arabidopsis thaliana, una pianta ditiledone, utilizzando il bianco calcofluor, che si lega specificamente ai glucani legati alla β, esibendo fluorescenza sotto luce UV.

Colorazione bianca Calcofluor: un metodo semplice per la visualizzazione della fluorescenza indotta dai raggi UV dei depositi di cellulosa nelle pareti cellulari delle sezioni del fusto della pianta Dicot

Questo video dimostra una tecnica di immunocolorazione per localizzare le proteine arabinogalattano (AGP) e le pectine nei tessuti vegetali. Le sezioni di tessuto vegetale fissate e incorporate in resina vengono colorate con anticorpi primari e secondari fluorescenti specifici per AGP e pectina e un colorante fluorescente legante la cellulosa per rivelare la loro colocalizzazione tessuto-specifica nella parete cellulare.

Immunolocalizzazione delle proteine dell'arabinogalattano e delle pectine nei tessuti vegetali

Forniamo qui un protocollo efficiente e affidabile per immunoistochimica, ibridazione in situ fluorescente, colorazione del DNA seguita da quantitativa, immagini ad alta risoluzione di tutto il montaggio di Arabidopsis thaliana ovuli. Questo metodo è stato utilizzato con successo per analizzare modificazioni della cromatina e architettura nucleare.

Un metodo efficiente per quantitativa, analisi singola cella della cromatina Cambiamento e architettura nucleare in tutto il montaggio Ovuli in<em&gt; Arabidopsis</em

In questo protocollo, abbiamo descritte le tecniche per la corretta dissezione di Arabidopsis fiori e silique, alcune tecniche di base di schiarimento e selezionato le procedure per intero-monta le osservazioni delle strutture riproduttive di colorazione.

Intero-monta schiarimento e colorazione delle silique e organi del fiore di Arabidopsis

L'obiettivo di questo protocollo è quello di mostrare come caricare il CFDA in diversi siti delle parti inferiori di Arabidopsis. Presentiamo quindi il modello di distribuzione risultante di CF nei germogli.

Movimento shootward di CFDA Tracer caricato nei tessuti lavello inferiore di Arabidopsis

Questo protocollo descrive in dettaglio come viene fissato il materiale vegetale per l'immunolocalizzazione delle proteine arabinogalactane e delle pectine, incorporato in una resina acrilica idrofila, sezionale e montato su vetrini. Mostriamo che gli epitopi correlati alla parete cellulare verranno rilevati con anticorpi specifici.

Immunolocalizzazione fluorescente delle proteine arabinogalactane e delle pectine nella parete cellulare dei tessuti vegetali

Il presente protocollo descrive un metodo ottimizzato per l'osservazione istologica delle galle indotta da Plasmodiophora brassicae. Le sezioni vibratomo degli ipocotili vengono eliminate prima dell'imaging a fluorescenza per studiare il coinvolgimento dei fattori di trascrizione e dei fitormoni durante la progressione della malattia. Questo protocollo supera i limiti di incorporamento della resina, consentendo la visualizzazione nelle piante di proteine fluorescenti.

Combinazione di microscopia a compensazione e fluorescenza per visualizzare i cambiamenti nell'espressione genica e le risposte fisiologiche a Plasmodiophora brassicae

Questo protocollo descrive la preparazione di campioni intatti dello strato cellulare dell'endosperma nei semi di Arabidopsis thaliana . Il metodo richiede solo le comuni attrezzature di laboratorio, come un ago per iniezione e una pinza di precisione, e consente l'imaging fluorescente ad alta risoluzione delle cellule dell'endosperma sia nei semi in via di sviluppo che in quelli maturi.

Preparazione del tessuto intatto per l'analisi microscopica dello strato cellulare dell'endosperma nei semi di Arabidopsis in via di sviluppo e maturi

Scopri le tecniche di colorazione istochimica per visualizzare gli elementi della parete cellulare secondaria in Arabidopsis thaliana. Questo metodo consente di analizzare la composizione dei tessuti legnosi nei gambi delle piante.

Colorazione istochimica di

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