Name: Colorazione istochimica di Arabidopsis thaliana Cellula secondaria Elementi da parete (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Scopri le tecniche di colorazione istochimica per visualizzare gli elementi della parete cellulare secondaria in Arabidopsis thaliana. Questo metodo consente di analizzare la composizione dei tessuti legnosi nei gambi delle piante.

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Siamo grati a Sabin Russell per l&#39;assistenza editing. Questo lavoro è stato parte del DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org), sostenuto dal Dipartimento dell&#39;Energia degli Stati Uniti, Office of Science, Ufficio di Ricerca Biologica e Ambientale, attraverso il contratto di DE-AC02-05CH11231 tra il Lawrence Berkeley National Laboratory e il Dipartimento dell&#39;Energia degli Stati Uniti.

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Gli autori non hanno conflitti finanziari da rivelare.

Sezioni di gambo A. thaliana sono ampiamente utilizzati per studiare l&#39;organizzazione delle cellule nella parete cellulare secondaria e di esaminare qualitativamente le differenze tra wild type e piante transgeniche. Le tecniche comunemente utilizzate per sezionare i campioni sono di taglio diretto a mano; o quando i campioni sono incorporati in agarosio o fissativo, sezionamento può essere fatto con un vibratomo o microtomo. In contrasto con il taglio manuale, gli ultimi due permettono riducendo il rischio...

La parete cellulare vegetale in possesso di una pletora di informazioni nelle sue varie componenti: la lignina, cellulosa, emicellulosa (silano, glucuronoxylan, xyloglucan, arabinoxilano collegamento misto glucano, o glucomannano), e pectina. Tecniche istologiche forniscono importanti indicazioni visive a studiare le differenze all&#39;interno delle pareti cellulari secondarie a livello organizzativo e cellulari. Varie tecniche istologiche sono stati sviluppati e sono disponibili in letteratura, ma queste tecniche può essere difficile e per principianti richiede tempo perché i protocolli molto dettagliate con semplici istruzioni visive sono quasi mai disponibili. L&#39;obiettivo di questo studio è quello di fornire semplici linee guida per tecniche di colorazione istologiche di ottenere immagini di alta qualità. Sezionare il tessuto stelo è il primo passo nella visualizzazione delle pareti cellulari e forme cellulari. Anche se le sezioni tagliate a mano sono poco costosi e richiedono meno tempo per preparare, l&#39;uso di un vibratome offre coerenza eproduce immagini di alta qualità. Utilizzando una vibratome permette di produrre una migliore qualità dei dati generando anche sezioni con lo stesso spessore, che aiuta a produrre immagini nitide e riduce significativamente il rischio di produrre differenze inesatti tra campioni che deriverebbe semplicemente da una cattiva preparazione del campione. Utilizzando resine di fissare campioni freschi può essere una sfida per principianti e può essere ancora molto tempo, anche per gli esperti quando l&#39;analisi deve essere fatto in fretta. Inoltre, diventa impossibile misurare qualsiasi attività biologica con il campione quando è stato incorporato in una resina. Una semplice tecnica che impiega uno stampo agarosio e fatta in casa è utile per l&#39;incorporamento tessuti dello stelo, e può anche essere utilizzato in altre applicazioni che richiedono dissezione dei tessuti molli. Rispetto al incorporamento esemplari in resina, questo metodo ha il vantaggio di mantenere i tessuti vivi e riducendo la manipolazione dei campioni. Sezionamento dei tessuti attraverso un vibratome è molto preciso e genera homogensezioni unità organizzative, che, a seconda della porta dello studio, possono poi essere utilizzati con diverse tecniche di colorazione diverse. I metodi più semplici per visualizzare lignina e altri aromatici impiegano raggi ultravioletti (UV). Eccitazione delle molecole aromatiche basate sulla luce UV è una vecchia tecnica, ma è ancora uno dei metodi più veloci per la visualizzazione di lignina. Tuttavia, la visualizzazione UV in realtà non è l&#39;ideale per il rilevamento della lignina, perché la luce UV ecciterà altri aromatici. La lignina è costituito principalmente da tre blocchi, i monolignols (alcoli hydroxycinnamyl: alcool coniferilico, alcol sinapyl, e alcool p-coumaryl) 1-3. Macchia Phloroglucinol può fornire indizi per la misura di cinnamaldehydes presenti nello xilema, fibre e tessuti tracheali 4. Phloroglucinol è un buon indicatore di cinnamaldehydes generali e può distinguere tra cinnamaldehydes e altri composti aromatici. I monomeri alcol sinapyl possono essere rilevatie differenziato dall&#39;uso di macchia Maule. Blu di toluidina O è un colorante policromatico e quindi ha la capacità di macchiare diversi elementi della parete cellulare in diversi colori 5,6. L&#39;uso primario di blu di toluidina O è rilevare pectina e lignina 5,6. Il vantaggio di usare blu di toluidina O è che molti elementi della parete cellulare possono essere visualizzati in un unico passaggio. Sia calcofluor bianco e congo rosso sono facili da lavorare e può essere utilizzato per visualizzare cellulosa. Macchie bianche calcofluor cellulosa, callosio, e altri β-glucani non sostituiti o debolmente sostituiti 6-9, mentre congo macchie rosse direttamente al β-(1 → 4)-glucani e in particolare alla cellulosa 10,11. L&#39;obiettivo di questo studio è fornire semplici linee guida per l&#39;utilizzo delle tecniche di colorazione di cui sopra per ottenere immagini di alta qualità da A. thaliana steli.

<table><tbody><tr><td>Agarosio</td><td>EMD</td><td>MERC2125</td><td>Numero CAS: 9012-36-6</td></tr><tr><td>Floroglucinolo</td><td>Sigma</td><td>P 3502</td><td>1,3,5-triidrossibenzene [Numero CAS: 108-73-6]</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>EMD</td><td>HX0603-75</td><td>Numero CAS: 7647-01-0</td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio</td><td>EMD</td><td>AX1303-6</td><td>Numero CAS: 1336-21-6</td></tr><tr><td>Blu di toulidina O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td>Cloruro di blutene, cloruro di tolonio [numero CAS 92-31-9]&nbsp;</td></tr><tr><td>Permanganato di potassio</td><td>Sigma</td><td>223468</td><td>numero CAS 7722-64-7&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanolo 190 proof</td><td>KOPTEC</td><td>V1401</td><td>Numero CAS: 64-17-5</td></tr><tr><td>Congo Red</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C6277</td><td>Disodio 3,3'-[[1,1'-bifenil]-4,4'-diilbis(azo)]bis(4-amminonaftalene 1-solfonato) [Numero CAS 573-58-0]</td></tr><tr><td>Sbiancante fluorescente 28/ Calcofluor White Stain</td><td>Sigma</td><td>F3543&nbsp;</td><td>acido 4,4'-bis[[4-[bis(2-idrossietil)ammino]-6-anilino-1,3,5-triazina-2-il]ammino]stilbene-2,2'-disolffonico [numero CAS 4404-43-7]&nbsp;</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica Microtomo a lama vibrante VT1000S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/</td></tr> <tr><td>Razor</td><td>American Safety razor company</td><td>Articolo # 60-0139-0000&nbsp;</td><td>Lama a doppio taglio in acciaio inox (Personna Super)</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga con tappo a vite (2 ml)</td><td>VWR</td><td>16466-044</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga (0,6 ml)</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>Guanto</td><td>Bel-Art</td><td>3800000000</td><td>SCIENCEWARE&nbsp; Hot Hand Protector</td></tr><tr><td>Mitt Adesivo per tessuti</td><td>Ted Pella Inc</td><td>10033</td><td>Negozio a 4 &deg; C o 20 gradi C per 3 mesi o più di conservazione</td></tr><tr><td>Microonde</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD762S</td><td>PELCO Pro CA 44 Adesivo istantaneo per tessuti&nbsp;</td></tr><tr><td>Fotocamera con chip CCD senza otturatore meccanico&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>C4742-95</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera a colori ad alta velocità&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Software per fotocamera QImaging</td><td>MicroPublisher 5.0 RTV</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>&nbsp; Molecular Devices</td><td>MetaMorph versione 7.7.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Immaginare l'analisi</td><td>Adobe&nbsp;</td><td>Occhiali Photoshop CS4</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover, quadrati, n. 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Gli occhiali Cover sono resistenti alla corrosione e uniformemente spessi e piatti. Lo spessore n. 1 è compreso tra 0,13 e 0,17 mm.</td></tr><tr><td>Micro vetrini smerigliati, 1 mm</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75 x 25 mm - 1 mm</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Alcan confezione</td><td>BRNDPM998</td><td></td></tr><tr><td>Cubo filtro TX2 Leica</td><td></td><td>11513851/11513885</td><td>Filtro utilizzato per l'analisi del rosso Congo con una banda passante di 560/40.</td></tr></tbody></table>

colorazione istochimica di<em&gt; arabidopsis thaliana</em&gt; cellula secondaria elementi da parete

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana è un organismo modello comunemente usato per comprendere e manipolare vari processi cellulari nelle piante, ed è stato ampiamente utilizzato nello studio della formazione della parete cellulare secondaria. La deposizione della parete cellulare secondaria si verifica dopo che la parete cellulare primaria è stata depositata, un processo eseguito esclusivamente da cellule specializzate come quelle che formano i vasi e i tessuti delle fibre. La maggior parte delle pareti cellulari secondarie è composta da cellulosa (40-50%), emicellulosa (25-30%) e lignina (20-30%). Sono state isolate diverse mutazioni che influenzano la biosintesi della parete cellulare secondaria e i mutanti corrispondenti possono o meno mostrare evidenti cambiamenti nella composizione biochimica o nei fenotipi visivi, poiché queste mutazioni potrebbero essere mascherate da risposte compensatorie. Le procedure di colorazione sono state storicamente utilizzate per mostrare le differenze su base cellulare. Questi metodi sono esclusivamente mezzi di analisi visivi; Tuttavia, il loro ruolo nell'analisi rapida e critica è di grande importanza. Il rosso Congo e il bianco calcofluor sono coloranti usati per rilevare i polisaccaridi, mentre il Mäule e il floroglucinolo sono comunemente usati per determinare le differenze nella lignina e il blu di toluidina O è usato per colorare in modo differenziale i polisaccaridi e la lignina. Le tecniche apparentemente semplici di sezionamento, colorazione e imaging possono essere una sfida per i principianti. A partire dalla preparazione del campione utilizzando il modello di A. thaliana, questo studio descrive in dettaglio i protocolli di una varietà di metodologie di colorazione che possono essere facilmente implementate per l'osservazione dell'organizzazione cellulare e tissutale nelle pareti cellulari secondarie delle piante.

Stem Embedding e Sezioni: L&#39;uso dello stampo plastica casalingo per incorporare gli steli in 7% agarosio rivelata facile e veloce (Figura 1). Le due parti (A e B; la figura 1) del sistema flaconcino incorporato rendono semplice per rilasciare facilmente stelo incorporato in agarosio come l&#39;agarosio non si attacca alle parti fiala che sono inerti, mantenendo il sistema pulito. Le fiale possono essere riutilizzati più volte per anni. La comodità di memorizzare stelo incorpo...

La composizione della parete cellulare vegetale varia tra i tipi di tessuto e può includere lignina, cellulosa, emicellulosa e pectina. Sono state sviluppate varie tecniche di colorazione per visualizzare le differenze a livello di tipo cellulare. Questo articolo è una raccolta di tecniche di colorazione della parete cellulare comunemente usate.

Colorazione istochimica di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cellula secondaria Elementi da parete

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

L'obiettivo generale di questa procedura è mostrare la colorazione istochimica degli elementi della parete cellulare secondaria ANA di Arabidopsis. Questo viene ottenuto innanzitutto incorporando il fusto della pianta nell'aros. Successivamente, il fusto incorporato nell'aros viene disincastonato e trasferito su dischi campione, che vengono quindi sezionati in sezioni trasversali STEM utilizzando un vibratomo.Successivamente, i campioni vengono sottoposti a diverse procedure di colorazione istochimica. Infine, mediante microscopia, si evidenziano le modifiche differenziali negli elementi della parete cellulare secondaria ottenute tramite la colorazione istochimica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla parete cellulare, come ad esempio i cambiamenti nei tessuti maculari dei fusti vegetali.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà perché passaggi semplici ma fondamentali menzionati nei protocolli qui riportati non sono stati documentati accuratamente o presentati in modo semplificato in precedenza. Per iniziare, preparare uno stampo fatto in casa per l'inclusione dei piccioli utilizzando provette di plastica. Innanzitutto, utilizzare una lametta per tagliare la parte conica inferiore di una micro provetta con tappo a vite da due millilitri.Questo componente è indicato come parte A, con una puntura di ago per siringa e un foro nel tappo del tubo leggermente più grande del diametro dello stelo da inserire. Successivamente, tagliare mezzo centimetro dalla base di un microtubo da 0,6 millilitri. Questo componente sarà indicato come parte B. Inserire la porzione tagliata di mezzo centimetro del microtubo da 0,6 millilitri nel microtubo da 2 millilitri precedentemente tagliato.Sigillare le due parti utilizzando paraform. Con una lametta, tagliare una sezione del fusto dalla zona di interesse, sciogliere una soluzione al 7% di aros nel microonde a bassa intensità. Una volta che l'aros fuso si sarà raffreddato a circa 50 gradi Celsius, pipettare lentamente cinque millilitri di agros nel modulo di plastica preformato per riempire la provetta.Dopo che l'aeros si è raffreddato per 30-60 secondi ed è diventato semisolido, inserire l'asta nel flaconcino riempito con l'aeros. Quindi posizionare il tappo forato in modo che la punta dell'asta sia trattenuta dal tappo. Lasciare il flaconcino a temperatura ambiente o a quattro gradi Celsius per 10-30 minuti, fino a quando non si è completamente solidificato.Rimuovere lo stampo facendolo scivolare delicatamente fuori dal tubo. Aprire il para film e spingere delicatamente con il pollice il fondo della parte B della talpa per rilasciare l'aros solidificato dalla parte A su un vetrino da microscopio. Taglio scorrevole.Tagliare il fusto inserito negli aros in tre pezzi di circa 1,2 centimetri di lunghezza. Rimuovere e scartare la parte del fusto che non era negli aros. Assicurarsi che il disco del campione sia pulito e completamente asciutto.Utilizzare salviette di carta morbida per rimuovere qualsiasi umidità dal blocco di aros contenente i campioni. Applicare una piccola goccia di adesivo per tessuti sul disco del campione. Posizionare rapidamente il blocco di aros in modo che i campioni siano perpendicolari alla piastra per sezioni trasversali o paralleli alla piastra.Per sezioni trasversali longitudinali, lasciare che l'adesivo fissi il campione al disco del campione a temperatura ambiente o a quattro gradi Celsius per 10-30 minuti. Fissare il disco del campione nella posizione sulla vaschetta tampone o sul canale in modo che il blocco di aros con i tagli sia parallelo alla lama del rasoio. Riempire la vaschetta tampone con acqua distillata a temperatura ambiente fino a quando i campioni sono completamente immersi.Tagliare un rasoio a metà e poi rifilare le estremità con forbici robuste in modo che la lama rimanga completamente piatta. Fissare una delle due metà del rasoio precedentemente tagliato sul portalametta. Impostare l'angolo del portalametta su 84 gradi, la velocità a 0,90 millimetri al secondo e la frequenza a 50 hertz.Tagliare le sezioni ad uno spessore di 100 micron utilizzando la modalità continua. Raccogliere le sezioni utilizzando una pipetta di plastica monouso durante il taglio nel vassoio contenente il tampone. Trasferire alcune sezioni in provette microcentrifuga da due millilitri per la colorazione con fluorol.Trasferire le sezioni di fusto in una provetta per microcentrifuga. Aggiungere un millilitro di soluzione fluorol nella provetta e chiuderla immediatamente. Poiché l'acido cloridrico nel colorante fluoro gluc anol è altamente corrosivo, muovere delicatamente la provetta per assicurare che tutte le sezioni vengano colorate.Trasferire delicatamente i sezioni in una punta di pipetta tagliata e quindi su un vetrino da microscopio. Coprire i sezioni con un coprioggetto. Osservare i sezioni in luce brightfield.La soluzione si asciuga in cinque-dieci minuti causando un deterioramento dei campioni. Pertanto, l'acquisizione delle immagini deve essere completata entro tale periodo di tempo. Per la colorazione con mal, trasferire le sezioni del fusto in una provetta per microcentrifuga.Aggiungere un millilitro della soluzione di permanganato di potassio allo 0,5% al tubo contenente le sezioni. Pipettare delicatamente su e giù la soluzione di permanganato di potassio allo 0,5%, preferibilmente senza disturbare le sezioni. Dopo un'incubazione di due minuti e una ripetuta pipettaggio, lasciare in riposo il tubo da microcentrifuga fino a quando tutte le sezioni si saranno depositate.Utilizzando una pipetta da un millilitro, prelevare 700 microlitri di soluzione di permanganato di potassio allo 0,5%, aggiungere 700 microlitri di acqua distillata per risciacquare il permanganato di potassio. Ripetere l'operazione da tre a quattro volte o fino a quando la soluzione acquosa rimane limpida. Dopo aver scartato l'acqua, aggiungere rapidamente un millilitro di acido cloridrico al 3% fino a quando il colore bruno intenso viene eliminato dalle sezioni.Questo può avvenire entro tre a cinque minuti o può richiedere due lavaggi di cinque minuti. Aspirare completamente tutta la soluzione di acido cloridrico al 3% e aggiungere immediatamente un millilitro di soluzione concentrata di idrossido di ammonio. Prima dell'analisi in campo chiaro per la colorazione con rosso Congo, trasferire le sezioni del fusto in una provetta da microcentrifuga e aggiungere un millilitro della soluzione di rosso Congo allo 0,5%.Pipettare delicatamente la soluzione di rosso Congo allo 0,5% su e giù senza disturbare le sezioni. Prima di incubare e lavare le sezioni come descritto nel protocollo, pipettare delicatamente i preparati in una punta di pipetta tagliata e su un vetrino. Quindi coprirli con un coprioggetto.Osservare i campioni al microscopio. Esaminare in fluorescenza con luce blu utilizzando un filtro di emissione a 560 nanometri per la colorazione con calcior bianco. Trasferire le sezioni di fusto in una provetta da microcentrifuga e aggiungere un millilitro della soluzione di calcior bianco allo 0,02%.Pipettare delicatamente la soluzione su e giù. Procedere con l'incubazione e il lavaggio delle sezioni come descritto nel protocollo testuale prima di osservare le sezioni sotto luce UV. Per la colorazione con o-toluidina blu, trasferire le sezioni del fusto in un tubo da microcentrifuga.Quindi aggiungere un millilitro della soluzione di blu di toluidina O 0,02% nel tubo ed eseguire delicatamente alcune pipettature su e giù per mescolare. Successivamente, incubare e lavare le sezioni come descritto nel protocollo testuale prima di osservarle in luce di campo chiaro. Per i dettagli relativi alle impostazioni del microscopio e della fotocamera per l'acquisizione delle immagini, nonché per la procedura di imaging in ultravioletto e in luce di campo chiaro, consultare il protocollo testuale.I composti aromatici, inclusa la lignina nelle cellule, possono essere visualizzati mediante la loro autofluorescenza sotto luce UV. I tessuti di xilema e le fibre interfascicolari mostrano autofluorescenza sotto illuminazione UV, ma non nel midollo, nel parenchima corticale o nell'epidermide, poiché la lignina e i polimeri aromatici vengono depositati durante la formazione della parete cellulare secondaria, mentre la colorazione con fluorol reagisce con i gruppi aldeidici terminali della lignina producendo un colore rosa o fucsia, come osservato sotto illuminazione UV. Una colorazione fucsia è visibile in xilema e fibre interfascicolari, ma è assente nel midollo, nel parenchima corticale e nell'epidermide.Di solito, l'intensità del colore si correla in modo qualitativo al livello di lignificazione. La colorazione con MALS è specifica per rilevare le unità di lignina ingal nelle fibre xilematiche e interfasciali. La colorazione rossa indica la presenza di unità di lignina ingal negli elementi lignificati.Tuttavia, una colorazione rossa più intensa viene osservata nelle fibre rispetto ai tessuti del xilema, il che suggerisce che le fibre contengono un livello maggiore di unità ligniniche di tipo ingal, mentre il xilema è più arricchito di unità ligniniche di tipo gua. Sezioni di fusto colorate con calcior bianco sono state osservate in luce UV e hanno rivelato che l'epidermide, il cortice e il midollo sono state colorate, poiché tutti questi tessuti contengono cellulosa come principale polimero polisaccaridico nelle loro pareti cellulari. Le sezioni colorate con rosso Congo sono state osservate con eccitazione in luce blu e hanno anch'esse colorato l'epidermide, il cortice e il midollo.A differenza del calcior, il rosso Congo colora meglio i polisaccaridi nel xilema e nelle fibre interfascicolari e sembra meno influenzato dalla presenza della lignina odina. L'azzurro O è classificato come un colorante policromatico perché produce un campione multicolore. L'odina azzurro O è un colorante ionico che si lega ai gruppi carichi negativamente e genera colori diversi.Quando il colorante si lega a diversi gruppi ionici nella cellula, la colorazione blu di O delle sezioni trasversali del fusto ha rivelato che il xilema e le fibre interfascicolari sono lignificate poiché mostrano una colorazione verde-blu o blu, il che è in accordo con i risultati ottenuti mediante UV e fluoro glucano. Al contrario, nei tessuti del midollo, del cortex e dell'epidermide si osserva una colorazione verde-blu o blu perché, sebbene non siano lignificati, contengono alcuni polimeri di pectina nelle loro pareti cellulari. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sezionare i fusti delle piante e di come colorare in modo differenziale i vari tessuti presenti nella parete cellulare vegetale utilizzando diversi coloranti istochimici.

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