Nucleosidi trifosfati - Dalla sintesi di biochimica Caratterizzazione

L'obiettivo generale di questo video è quello di dimostrare la procedura dalla sintesi dei fosfati nucleosidici modificati alla loro completa caratterizzazione biochimica. Ciò si ottiene convertendo prima il precursore nucleosidico adeguatamente protetto nel corrispondente trifosfato mediante l'applicazione di una procedura in quattro fasi in un solo vaso. Il secondo passo consiste nel purificare il trifosfato risultante prima mediante precipitazione e poi mediante cromatografia liquida ad alta prestazione in fase inversa.

Successivamente, l'analogo del trifosfato è caratterizzato da risonanza magnetica nucleare e tempo di ionizzazione a ionizzazione laser assistita da matrice o NMR e maloff per garantire un'elevata purezza. La fase finale è costituita dalle reazioni di estensione del primer e dalle reazioni terminali di polimerizzazione della desossinucleotide transferasi o TDT. Infine, i prodotti di reazione, e quindi l'accettazione del trifosfato al substrato, vengono analizzati mediante elettroforesi su gel.

Il vantaggio di questo metodo rispetto ad altre strategie sintetiche come l'approccio di Borge, è che si formano meno prodotti collaterali e quindi la purificazione è più facile. In generale, le persone che non conoscono questa tecnica avranno difficoltà in quanto si tratta di una procedura piuttosto lunga e intricata che richiede conoscenze in più campi. Abbiamo avuto l'idea di filmare questo metodo per la prima volta quando abbiamo sintetizzato fosfati modificati e abbiamo trovato piuttosto difficile trovare una procedura dettagliata.

Un altro vantaggio di questo metodo è che può essere utilizzato per affrontare altre questioni nel campo degli acidi nucleici modificati. Infatti, può essere utilizzato per selezionare enzimi di DNA che catalizzano un'ampia gamma di reazioni. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per l'etichettatura funzionale degli acidi nucleici.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di sintesi e purificazione sono difficili da apprendere perché i trifosfati sono derivati polari e attivati che devono essere maneggiati con cura. Per cominciare, evaporare due volte il nucleoside protetto da ossidrile a tre prime con due millilitri di purina anidra prima di essiccare sotto vuoto per una notte. Allo stesso tempo, il pirofosfato di ammonio tribunale secco sotto vuoto durante la notte del giorno successivo ha sciolto il nucleoside in un minimo di 200 microlitri di piridina secca.

Quindi aggiungere 400 microlitri di diossano secco come solvente COS. Infine, aggiungere il triderivato del fosforo ciclico e lasciarlo reagire a temperatura ambiente per 45 minuti. Successivamente, preparare una soluzione di pirofosfato di butile ammonio secco in 170 microlitri di dimetilformammide secca e 58 microlitri di tributiliammina appena distillata.

Aggiungere la soluzione risultante alla miscela di reazione e lasciarla reagire a temperatura ambiente per 45 minuti. Quindi preparare una soluzione di 160 micromolari di iodio in 980 microlitri di purina e 20 microlitri di acqua. Aggiungere la soluzione alla miscela di reazione.

Al fine di ossidare il centro dell'alfa fosforo. Lasciare mescolare la soluzione scura risultante a temperatura ambiente per 30 minuti. Utilizzare una soluzione acquosa al 10% di sodio tio solfato per spegnere lo iodio in eccesso.

Rimuovere il solvente sotto vuoto. Quindi aggiungere cinque millilitri di acqua e lasciare riposare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti per idrolizzare la moty tri fosfato ciclica. In questa fase, i gruppi di protezione vengono solitamente rimossi.

Di conseguenza, aggiungere il 30% di idrossido di imodio al campione grezzo. Mescolare per 1,5 ore a temperatura ambiente prima di rimuovere il solvente sotto vuoto. Quindi, aggiungere due millilitri di acqua e dividere il composto in tubi.

Aggiungere 12 millilitri di una soluzione al 2% di sodio per clorato in acetone e centrifugare per 30 minuti prima di ripetere la procedura. Ancora una volta. I reagenti utilizzati nella sintesi del trifosfato precipiteranno formando un residuo oleoso e consentendo la separazione dei solventi, semplificando così la conseguente purificazione HPLC in fase inversa sostanzialmente dopo l'essiccazione all'aria del residuo oleoso.

Registrare uno spettro NMR P 31 del campione grezzo secondo le procedure standard. Successivamente NMR ha sciolto il residuo oleoso in quattro millilitri di acqua distillata. Iniziare la purificazione HPLC con la preparazione di 50 millimolari di bicarbonato di trietilammonio in acqua ultrapura come EENT A e in 50% di acetil nitrile come eent B come dettagliato nel protocollo di testo, Degassare entrambi gli EENT sotto vuoto e agitare per 20 minuti.

Preparare un campione analitico sciogliendo 10 microlitri di trifosfato grezzo in 300 microlitri di acqua distillata. Quindi utilizzando una sfumatura che va da 0%B a 100%B in 40 minuti. Iniettare il campione in un sistema HPLC dotato di una colonna semi-preparativa di fase C 18

Regolare il programma HPLC in base al tempo di ritenzione del trifosfato e del difosfato. Purificare la miscela grezza utilizzando queste condizioni e rimuovendo le frazioni precoci che potrebbero contenere del difosfato, unire tutte le frazioni che contengono il prodotto e liofilizzare. Quindi coevaporare più volte con acqua ultrapura.

Valutare la purezza del trifosfato mediante NMR e maloff mediante l'applicazione di protocolli standard. Le rese tipiche ottenute con l'applicazione di questo protocollo si aggirano tra il 30 e il 70% a seconda del substrato per cinque prime e dell'etichettatura del primer. Mescolare il primer e i reagenti come descritto nel protocollo di testo e incubare la reazione di marcatura a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Durante la reazione di etichettatura, preparare una colonna G 10 cidex tappando un puntale per pipetta da un millilitro con lana di vetro siloizzata e riempiendo il puntale con una soluzione G 10. Centrifugare e lavare tre volte con 500 microlitri di acqua bidistillata e un lavaggio finale con 50 microlitri di acqua bidistillata. Dopo l'incubazione della reazione di marcatura, il calore disattiva la chinasi per 10 minuti a 70 gradi Celsius.

Quindi, far passare la miscela di reazione attraverso il G 10. Per rimuovere il gel radioattivo libero, purificare il primer radiomarcato e recuperare mediante l'applicazione del metodo di frantumazione e ammollo, precipitato di etanolo e G 10 desalina l'oligonucleotide eluso. Per la reazione di estensione del primer, combinare una mole PICA di primer radiomarcato, P 10 moli PICA di primer, P uno e 10 moli PICA di dima, T uno su 10 x tampone di reazione e inginocchiarsi in acqua calda.

Quindi raffreddare gradualmente a temperatura ambiente nell'arco di 45 minuti. Metti la provetta sul ghiaccio e aggiungi il fosfato nucleosidico o il cocktail DNTP e un'unità di ghiaccio della DNA polimerasi. Completare la reazione con acqua per un volume totale di 20 microlitri incubare alla temperatura ottimale di lavoro dell'enzima.

Quindi aggiungere 20 microlitri di soluzione di arresto e riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Freddo, i campioni scendono a zero gradi Celsius. Prima di risolvere mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante.

Visualizzare le bande mediante imager fosfoscopico per la polimerizzazione TDT, diluire il primer non marcato a singolo filamento P due e il primer radiomarcato in un microlitro di tampone TDT. Mettere la provetta sul ghiaccio e aggiungere il cocktail DNTP e la TDT polimerasi, quindi incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 microlitri della soluzione di arresto prima di riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti, quindi raffreddare a zero gradi Celsius.

Dopo aver risolto il campione mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide, visualizzare le bande utilizzando un imager fosfo. Qui è mostrato un tipico spettro NMR P 31 grezzo di un DNTP modificato in cui possono essere osservati i segnali caratteristici dei centri del fosforo. Inoltre, i segnali provenienti dal lato difosfato e monofosfato.

In questa fase si osservano sempre prodotti insieme a fosfati più elevati. Di seguito è illustrata l'analisi HPLC in fase inversa della miscela grezza. Il picco principale corrisponde al fosfato a cinque prime, mentre il sottoprodotto principale, il difosfato a cinque prime, mostra un tempo di ritenzione leggermente inferiore.

Infine, dopo un'accurata fase inversa, purificazione HPLC, il DNTP modificato è caratterizzato da NMR e maldi per mostrare qui è lo spettro maloff dell'ide-sulfamidico, analogo DUTP modificato. L'addotto di sodio può essere visto con un sovraccarico di massa di 712,54 e non è presente alcuna traccia di difosfato. Sia gli spettri NMR P 31 che quelli NMR protonici sono cruciali per valutare la purezza del dps modificato.

Poiché la presenza di coloranti indesiderati e mono fosfati fornisce segnali distintivi illustrati, ecco l'esito delle reazioni di estensione primaria con DUTP modificato con trans prolina, istamina modificata DATP e DCTP modificato con acido valerico utilizzati come modifiche solitarie come combinazioni di due DN dps modificati o insieme, insieme a un DGTP naturale solitario. Infine, sono state analizzate reazioni di polimerizzazione mediate da TDT rappresentative con diversi analoghi DUTP modificati con elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante. In questo contesto, il DUTP modificato con cis prolina e il DUTP modificato con peptidi sono i migliori substrati per la TDT.

Poiché le efficienze di tailing sono paragonabili o superiori a quelle del DTTP naturale, il DUTP modificato con urea è un substrato piuttosto scarso in questo contesto. Poiché si disperdono pochi poli, si possono osservare oligonucleotidi di dimensioni più lunghe Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa una settimana se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante tenere presente che i fosfati citrico nucleari sono i mattoni attivati della natura, e quindi è necessario prestare attenzione durante la manipolazione dopo che è stato creato.

I ricercatori nel campo degli acidi nucleici utilizzano questo metodo per esplorare le selezioni combinatorie per generare aberi modificati e acidi nucleici catalitici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare e caratterizzare i fosfati modificati utilizzando la procedura pop in quattro fasi uno, seguita dalla purificazione HPLC in fase inversa e dalle reazioni di estensione primaria. Alcuni dettagli sperimentali che normalmente non si trovano nelle sezioni sperimentali diventeranno evidenti.

Questo metodo può essere utilizzato in combinazione con altre tecniche come la PCR per rispondere a ulteriori domande. Infatti, può essere utilizzato per valutare la compatibilità dei trifosfati modificati con i metodi di selezione in VIO.