Un In vivo La reticolazione Approccio per isolare complessi proteici da Drosophila Embrioni
23 aprile 2014
Complessi proteici Multi-componenti giocano un ruolo cruciale durante la funzione e lo sviluppo cellulare. Qui si descrive un metodo utilizzato per isolare complessi proteina nativa da embrioni di Drosophila in vivo dopo reticolazione seguita da purificazione dei complessi reticolati per successiva analisi struttura-funzione.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere complessi proteici da embrioni di drosophila viventi, utilizzando un approccio di cross-linking in vivo. Questo viene realizzato innanzitutto caricando migliaia di moscerini in una gabbia per popolazioni e raccogliendo embrioni precoci. Successivamente, le proteine vengono stabilizzate in vivo mediante cross-linking con formaldeide, che fissa i complessi proteici interni.
Successivamente, vengono preparati estratti proteici dagli embrioni cross-linkati in modo che i complessi proteici possano essere immunoprecipitati. I risultati identificano i complessi proteici isolati mediante analisi di Western blot. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'isolamento tradizionale di complessi proteici con approcci in vitro, è che questo approccio in vivo ci permette di catturare interazioni proteina-proteina transitorie ma funzionalmente significative, che potrebbero non essere rilevate con i tradizionali metodi in vitro.
La tecnica sarà dimostrata dalla dott.ssa Min Gao, una ricercatrice postdottorato del mio laboratorio. Mescolare prima acqua e agar per moscerini con un agitatore magnetico. Autoclavare questa miscela durante il ciclo di sterilizzazione in autoclave.
Mescolare il saccarosio nel succo di mela e riscaldare a 70 gradi Celsius su una piastra. Successivamente, unire le miscele e lasciarle raffreddare per 15 minuti prima che l'agar si solidifichi. Preparare alcol etilico con metil 4-idrossibenzoato fresco.
Questo è il conservante. Aggiungerlo alla miscela in via di solidificazione e mescolare per cinque minuti. Quindi versare la miscela in piastre di plastica o polistirolo da 300 centimetri quadrati senza formare bolle.
Conservare le piastre a quattro gradi Celsius e utilizzarle entro una settimana. Preparare una gabbia di popolazione contenente da 40 a 50.000 moscerini da cui raccogliere gli embrioni. Applicare due piastre fresche contenenti mais e melassa, con circa quattro grammi di lievito da forno spolverizzati sulla superficie, alla gabbia di popolazione.
Lasciare le mosche vivere su queste piastre per 48 ore a 25 gradi Celsius. Dopo due giorni, spargere circa un grammo di lievito su due piastre di agar al succo di mela e sostituire le piastre nella gabbia di popolazione con queste. Dopo un'ora, sostituire nuovamente le piastre nella gabbia con altre due dello stesso tipo.
Le due piastre di raccolta utilizzate dalle mosche per un'ora verranno caricate con embrioni. Sospendere gli embrioni nell'acqua presente sulla piastra e utilizzare un pennello per aiutare a staccarli. Quindi versarli attraverso un setaccio a doppio strato.
Lo strato superiore è una maglia d'acciaio da 850 micron, mentre lo strato inferiore è una maglia d'acciaio da 75 micron. Gli embrioni si accumuleranno sulla maglia più fine, separandoli dai detriti più grossolani utilizzando un pennello. Trasferire gli embrioni in un contenitore a maglia di nylon fine realizzato con il tappo di un tubo conico da 50 millilitri.
Risciacquare gli embrioni in acqua e asciugarli sulla maglia contro un tovagliolo di carta. Successivamente, immergere gli embrioni in una soluzione di candeggina al 50% per tre minuti. Agitare delicatamente nella candeggina, quindi risciacquare abbondantemente con acqua e asciugare tamponando.
I campioni vengono quindi immersi in isopropanolo per circa 15 secondi. Ruotando delicatamente, questo passaggio rompe gli aggregati embrionali e non dovrebbe richiedere più di 30 secondi. Asciugare leggermente gli embrioni e trasferirli quindi in una soluzione di eptano per cinque minuti.
Pipettare frequentemente l'etano sugli embrioni per evitare che si raggruppino, asciugare gli embrioni tamponando e lavarli in PBST. Dopo aver lavato gli embrioni per tre minuti, trasferirli sulla griglia in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di PBST. Rimuovere la griglia lasciando gli embrioni in soluzione e prelevare tra 100 e 300 microlitri di embrioni.
Sedimentare sul fondo, aspirare il PBST e procedere immediatamente con il cross-linking degli embrioni. Aggiungere prima 10 millilitri di formaldeide al 0,2% appena preparata in PBST agli embrioni. Incubare con agitazione delicata a 25 gradi Celsius per 10 minuti.
Dopo 10 minuti di reazione, lasciare affondare gli embrioni ed eliminare la soluzione. Quindi sostituire rapidamente la soluzione con 10 millilitri di glicina 0,25 M in PBST per bloccare la reazione. Lasciare agitare il tubo per altri cinque minuti. Al termine del blocco, rimuovere la soluzione e risciacquare gli embrioni tre volte con 10 millilitri di PBST per ogni risciacquo.
Rimuovere il resto di PBST mediante aspirazione con pipetta e conservare gli embrioni a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo. Utilizzando un omogeneizzatore a mano e due millilitri di buffer di lisi, omogeneizzare 500 microlitri di embrioni cross-linkati. L'operazione richiede circa 15 movimenti con pestello adatto.
Trasferire il lisato in una provetta da microcentrifuga e porla su un agitatore rotante per 15 minuti. Centrifugare quindi il lisato a 16.000 ×g per cinque minuti. Trasferire il soprannatante in un tubo da 15 millilitri.
Il pellet può essere smaltito. Aggiungere ora al soprannatante 40 microlitri della sospensione di anti ha agros beet. Agitare dolcemente per circa 2,5 ore dopo il completamento della coniugazione delle perle.
Centrifugare le perle a 2.500 G per cinque minuti. Lasciare circa 250 microlitri di soprannatante nel tubo e risospendere le perle in esso. Trasferire le perle sospese su un filtro da 10 micron in una colonna centrifuga.
Rimuovere la soluzione con una centrifugazione di dieci secondi a 12.000 G. Lavare le perle sulla colonna con 200 microlitri di tampone di lavaggio e un’altra centrifugazione. Ripetere questo passaggio un totale di tre volte. Quindi aggiungere 40 microlitri di tampone di eluizione alle perle e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti.
Agitare delicatamente il tubo ogni cinque minuti durante questo periodo per raccogliere l'ouit. Centrifugare nuovamente la colonna a 12.000 GS per 10 secondi. L'efficacia della cross-linking e della purificazione dei complessi proteici cross-linkati è stata analizzata mediante elettroforesi SDS su un gel a gradiente del 3-7%, seguita da un western blot. Embryos esprimenti il marcatore HA e la proteina GFP sono stati utilizzati per monitorare il grado di cross-linking e testare diverse concentrazioni di formaldeide per il protocollo.
La maggior parte della GFP negli embrioni trattati non si è cross-linkata, quindi questo non accade. Un complesso casuale di due proteine è stato confrontato con il controllo non cross-linkato. Due proteine che non si sono cross-linkate sono visibili in una banda di 285 kilodalton che migra liberamente.
La proteina due legata a ponte è più pesante e migra meno nel lisato proteico grezzo. Circa la metà della proteina due era legata a ponte con il suo partner interagente in vivo. I partner interagenti eluiti con il peptide HA hanno mostrato sia il complesso che la proteina tubulina libera nella frazione eluita, dopo il lavaggio delle perline.
Dopo la rimozione del SDS, si ottiene un tubulo libero in gran parte da complessi con il tubo. Seguendo questo procedimento, altri metodi come la spettrometria di massa possono essere eseguiti al fine di rispondere ad ulteriori domande relative ai metodi, come ad esempio l'identificazione dei componenti proteici nei complessi isolati.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per isolare complessi proteici nativi da embrioni di Drosophila mediante un approccio di cross-linking in vivo. La tecnica consente di catturare interazioni proteiche transitorie che sono cruciali per le funzioni cellulari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Proteina biochimica
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- I complessi proteici multicomponente sono essenziali per numerose funzioni cellulari.
- I metodi tradizionali possono non rilevare interazioni proteiche transitorie.
- La cross-linking in vivo offre un modo per stabilizzare queste interazioni.
- Gli embrioni di Drosophila costituiscono un modello per lo studio dei complessi proteici.
Scopo dello studio
- Isolare complessi proteici da embrioni vivi di Drosophila.
- Utilizzare l'incrocio incrociato in vivo per catturare interazioni transitorie.
- Analizzare la struttura e la funzione di questi complessi proteici.
Metodi Utilizzati
- Caricamento di moscerini in una gabbia di popolazione per raccogliere embrioni precoci.
- Cross-linking in vivo delle proteine con formaldeide.
- Preparazione di estratti proteici da embrioni cross-linkati.
- Immunoprecipitazione di complessi proteici per l'analisi.
Risultati principali
- Identificazione di complessi proteici isolati mediante analisi con Western blot.
- Dimostrazione dell'efficacia del cross-linking in vivo.
- Cattura di interazioni transitorie tra proteine.
- Il confronto con i metodi tradizionali in vitro evidenzia i vantaggi.
Conclusioni
- L'approccio in vivo è superiore per lo studio delle interazioni dinamiche tra proteine.
- Questo metodo può migliorare la comprensione delle funzioni dei complessi proteici.
- Studi futuri potrebbero ampliare questa tecnica ad altri organismi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il catturare interazioni transitorie tra proteine in ambienti cellulari nativi rimane una sfida fondamentale nella validazione degli obiettivi e nella riduzione del rischio meccanicistico. Questo approccio di crosslinking in vivo consente la stabilizzazione di complessi labili direttamente all'interno di embrioni di Drosophila, preservando interazioni fisiologicamente rilevanti che potrebbero andare perdute durante la lisi convenzionale. Il metodo supporta le fasi iniziali della scoperta fornendo una rappresentazione più accurata della composizione endogena dei complessi, migliorando così la fiducia predittiva nella valutazione degli obiettivi successivi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche stabilizzando complessi proteici transitori per l'analisi funzionale.
- Valore operativo: Riduce i falsi negativi nella validazione del target catturando interazioni non rilevate in vitro.
- Valore scientifico: Favorisce la riduzione del rischio biologico preservando l'architettura nativa dei complessi in un sistema modello rilevante per la malattia.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati adatti alla standardizzazione dei saggi e ai test di riproducibilità.
- Valore operativo: Genera output quantitativi mediante immunoprecipitazione e spettrometria di massa per la valutazione affidabile dei composti.
- Valore scientifico: Migliora la prontezza per lo screening fornendo letture di interazione con il bersaglio simili a quelle in condizioni native.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Offre informazioni rilevanti per le malattie isolando complessi da embrioni in via di sviluppo, un modello per processi cellulari conservati.
- Valore operativo: Garantisce la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica mantenendo l'integrità dei complessi.
- Valore scientifico: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico collegando l'interazione con il bersaglio a esiti funzionali nello sviluppo della linea germinale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul target all'identificazione di un composto promettente, in particolare nei casi in cui interazioni transitorie influenzano l'idoneità del target. Complementa lo screening fenotipico fornendo un contesto meccanicistico ai fenotipi osservati.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi isolando complessi nativi in condizioni quasi fisiologiche.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso l'isolamento riproducibile di complessi stabilizzati da crosslinking.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative mediante Western blot e spettrometria di massa per confrontare la composizione dei complessi in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica rivelando reti di interazione conservate in un modello geneticamente accessibile.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per l'isolamento di complessi in diversi tessuti e organismi, una volta adattata.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica negli studi di interazione con il bersaglio.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione e la riproducibilità attraverso passaggi definiti di cross-linking e quenching.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto rivelando interazioni transitorie che potrebbero indicare rilevanza funzionale.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione aggiustata rispetto al rischio basata sulla stabilità del complesso nativo e sulla forza dell'interazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel manipolaggio degli embrioni, nella chimica della cross-linking e nelle tecniche di immunoprecipitazione.
- Presuppone l'accesso a strumentazione per omogeneizzazione, centrifugazione e filtrazione necessaria alla preparazione del lisato.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alla concentrazione di formaldeide, ai tempi di arresto della reazione e alla stringenza dei lavaggi.
- Richiede valutazioni di adattamento quando il metodo viene applicato a tessuti non embrionali o a sistemi modello alternativi.
- Comprende limitazioni pratiche, come il rischio di eccessiva cross-linking a concentrazioni elevate di formaldeide, che potrebbe mascherare epitopi o ostacolare l'eluzione.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Preparing Large Apple Juice Agar Plates
2:04
Collecting Embryos and Pre-crosslinking Treatment
4:35
In vivo Crosslinking
5:34
Preparing Proteins and Immunoprecipitation
7:10
Results: Crosslinked Tud Protein Complex Analysis
8:23
Conclusion
