Name: Un In vivo La reticolazione Approccio per isolare complessi proteici da Drosophila Embrioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-23T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Scopri l'isolamento di complessi proteici nativi da embrioni di Drosophila mediante reticolazione in vivo con formaldeide. Questo metodo consente di catturare interazioni proteiche transitorie essenziali per le funzioni cellulari.

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Ringraziamo Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler e Jimiao Zheng per il loro aiuto tecnico con questo studio. Questo lavoro è stato supportato da NSF Career Grant MCB-1054962 a ALA

1. Preparare grande mela Piastre Juice-agar <ol><li> Per fare 4 piastre, aggiungere 375 ml di H 2 O, 11,25 g fly agar e un bar mescolare in un pallone di 1.000 ml. Questo è il Mix A. Autoclave Mix A con il coperchio pallone liberamente ricoperto da un ciclo di 30 min-sterilizzazione per le merci liquide. </li><li> Aggiungere 125 ml di succo di mela, 12,5 g di zucchero da tavola e un ancoretta ad un bicchiere da 500 ml. Questo è Mix B. calore Mix B su una piattaforma riscaldata sotto agitazione e mantenere la temperatura a circa 70 ° C fino alla autoclave di Mix A è terminata. </li><li> Al completamento di Mix A autoclave, trasferire Mix B Mix A. Continuate a mescolare il composto unito delicatamente e lasciate raffreddare per 15 minuti. Evitare di raffreddamento e la solidificazione agar portato prima dell&#39;aggiunta di conservante. </li><li> Prova del 10% (peso / volume) metil 4-idrossibenzoato soluzione in etanolo. Questo agirà come conservante. Aggiungere 3,75 ml della soluzione alla miscela succo-agar mela sopra. Continuate a mescolare per another 5 min. </li><li> Versare 125 ml di succo di mela miscela-agar con conservanti in ciascuna di plastica 300 centimetri 2 o lastra di polistirolo. Lasciate raffreddare a temperatura ambiente e solidificare. Evitare la formazione di bolle d&#39;aria durante il versamento. Nota: Le piastre di agar succo di mela sono pronti per l&#39;uso immediato. Coprire le piastre utilizzate con impacchi chiari e conservare a 4 ° C per un massimo di una settimana. </li></ol> 2. Drosophila Embryo raccolta e il trattamento pre-reticolazione <ol><li> Caricare una gabbia popolazione con circa 40.000 a 50.000 mosche da cui verranno raccolti embrioni. </li><li> Fare due piastre contenenti ciascuno 125 ml di farina di mais-melassa standard, medie 12 e cospargere di circa 4 g di lievito di birra essiccato su ogni piatto. Mettere questi piatti nella gabbia della popolazione in un incubatore a 25 ° C per 48 ore per ingrassare le mosche. </li><li> Warm 2 piastre di succo di mela-agar a 25 ° C. Cospargere circa 1 g di lievito di birra essiccato su ognipiatto. Posizionare le 2 piastre nella gabbia popolazione di iniziare a raccogliere 0-1 embrioni hr-old. </li><li> Estrarre le piastre alla fine dell&#39;insieme 1 hr. Sostituire con 2 nuove piastre se è necessario un altro giro di raccolta. </li><li> Aggiungere acqua sufficiente a coprire le piastre e risospendere gli embrioni delicatamente con un pennello fine. Versare gli embrioni risospeso attraverso un setaccio a doppio strato, fatto di rete metallica in acciaio inox. Nota: Lo strato superiore è realizzato in dimensioni medie dei pori (850 micron), maglia che raccoglie gran parte della mosca mentre lascia passare embrioni. Lo strato inferiore è realizzata in maglia fine (75 micron), che raccoglie gli embrioni pur lasciando passare lievito e acqua. </li><li> Usare il pennello ammenda di trasferire gli embrioni raccolti in un cestino di raccolta realizzato con un tubo da 50 ml e rete di nylon fine. Sciacquare gli embrioni brevemente con acqua, quindi asciugare la rete su carta assorbente per asciugare. </li><li> Immergere gli embrioni nel 50% di candeggina con agitando delicatamente per 3 min. Risciacquare approfonditaly con acqua per rimuovere qualsiasi residuo di candeggina. Asciugare la rete su carta assorbente per asciugare. </li><li> Immergere gli embrioni dechorionated in isopropanolo con leggera agitazione per 15 secondi o fino a quando la ripartizione dei cespi multi-embrione (questo non dovrebbe richiedere più di 30 secondi). Asciugare la rete su carta assorbente per asciugare completamente. </li><li> Immergere gli embrioni in esano per 5 minuti mentre usando una pipetta per lo streaming eptano negli embrioni per tenerli risospeso. Asciugare la rete su carta assorbente per asciugare. </li><li> Lavare gli embrioni con i flussi di Soluzione tampone fosfato, pH 7.4 (PBS) contenente 0,1% Triton X-100 (PBST) per 3 min. </li><li> Smontare il cestello di raccolta e trasferire gli embrioni con la maglia di una provetta da 15 ml contenente 10 ml PBST. Capovolgere delicatamente il tubo per lavare gli embrioni fuori la rete. </li><li> Rimuovere la maglia dal tubo. Inserire il tubo in posizione verticale e lasciare gli embrioni si depositano sul fondo della provetta per gravità. Nota: Circa 100-300microlitri di embrioni è previsto per una raccolta 1 ora da una gabbia. </li><li> Rimuovere il PBST e continuare a funzionare reticolazione immediatamente. </li></ol> 3. Nel vivo reticolazione degli embrioni raccolti <ol><li> Preparare 0,2% di formaldeide in PBST immediatamente prima dell&#39;uso. Aggiungere 10 ml di fissativo formaldeide per gli embrioni e incubare a 25 ° C con agitazione su un agitatore rotante per 10 min. Scartare fissativo inutilizzato alla fine della giornata. </li><li> Placare la reazione di reticolazione <ol><li> Al termine della reticolazione, lasciare che gli embrioni si depositano sul fondo della provetta. </li><li> Rimuovere la soluzione di formaldeide. Immediatamente aggiungere 10 ml di 0,25 M glicina in PBST per placare la reazione di reticolazione. Incubare a 25 ° C con agitazione su un agitatore rotante per 5 min. </li><li> Affittare gli embrioni si depositano sul fondo della provetta. Rimuovere la soluzione di abbattimento. Lavare gli embrioni con 10 ml di PBST tre volte. </li><li> Rimuovere completamente il PSoluzione di lavaggio BST con una pipetta. Conservare embrioni a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 4. Proteine ​​preparazione del campione e Immunoprecipitation <ol><li> Omogeneizzare 500 microlitri embrioni reticolati utilizzando un omogeneizzatore Dounce in 2 ml di tampone di lisi (0.5 M urea, 0,01% SDS, 2% Triton X-100, 2 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro [PMSF] e cocktail inibitore di proteasi in PBS). Nota: Eseguire questa e le seguenti operazioni a temperatura ambiente, se non diversamente specificato. </li><li> Trasferire il lisato a 1,5 ml provette da centrifuga e rock delicatamente su una piattaforma rotante per 15 minuti al fine di garantire lisi approfondita. Centrifugare il lisato a 16.000 xg per 5 minuti per far sedimentare i detriti cellulari. Salvare il surnatante in un ambiente pulito tubo da 15 ml. </li><li> Aggiungere 40 microlitri anti-HA agarosio impasto nel surnatante e incubare su piattaforma rotante per 2,5 ore. </li><li> Agglomerare le perline per centrifugazione a 2500 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante ma lasciare approximately 250 microlitri nel tubo. Risospendere le sfere nel surnatante rimanente e trasferire in una colonna di spin 1,5 ml con 10 micron di filtro pori. </li><li> Centrifugare la colonna di spin a 12.000 xg per 10 secondi e scartare il flusso attraverso. </li><li> Lavare le perline aggiungendo 200 microlitri di tampone di lavaggio (0,1 M glicina, 1 M NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,1% Tween-20, in PBS). Centrifugare la colonna a 12.000 xg per 10 secondi e scartare il lavaggio. Ripetere il lavaggio altre due volte. </li><li> Aggiungere 40 microlitri tampone di eluizione (2 mg / ml di HA-peptide in PBS) per le perline e incubare a 37 ° C per 15 minuti con agitazione ogni 5 min. Centrifugare la colonna a 12.000 xg per 10 sec e raccogliere l&#39;eluato. </li><li> Confermare eluizione del complesso mediante analisi western-blot utilizzando anticorpi anti-HA 13. </li></ol>

<ol><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome research. 22, 1813-1831 (2012).</li>
<li>Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA+binding+sites+by+CLIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq.</a> Methods. , (2013).</li>
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<li>Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li>
<li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694(2006).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La formaldeide è stato comunemente usato come reagente di reticolazione per identificare proteina-proteina e le interazioni proteina-acido nucleico. La sua buona solubilità e permeabilità della membrana cellulare, unitamente alla compatibilità con valle procedure di spettrometria di massa, rendono formaldeide un agente candidato ideale per applicazioni di reticolazione intracellulari 3,15-17. In particolare, è stato usato con successo per identificare mRNA associati Vasa, un critico elicasi RNA di cellule ger...

Isolamento delle assemblee proteine ​​multisubunit e-DNA o RNA-proteina complessi viene effettuata per identificare complessi proteici, loci genomici riconosciuto da proteine ​​regolatrici che legano il DNA o RNA target di proteine ​​leganti RNA. Diversi metodi permettono l&#39;identificazione genoma dei siti del DNA riconosciuti da fattori di trascrizione o proteine ​​della cromatina (ChIP-Seq) 1 e gli obiettivi di RNA associate a un determinato RNA-binding protein (CLIP-ss) 2. Le librerie di cDNA RNA derivati ​​da o bersagli di DNA sono poi profondamente sequenziati. Questi metodi utilizzano chimica o indotto da UV reticolazione a regolarizzare i complessi seguita da immunoprecipitazione (IP) con un anticorpo contro un componente proteica del complesso studiato. Durante lo sviluppo di un organismo, molti complessi proteici formano transitoriamente. Pertanto, è fondamentale per analizzare la composizione e la funzione di questi complessi in vivo per comprendere i meccanismi molecolari che controllano development. Tale analisi in vivo sarebbe superiore al metodo in vitro dato che è praticamente impossibile riprodurre concentrazioni nativi dei componenti interagenti e ambiente biochimico cellulare in vitro. Qui mostriamo un approccio in vivo che usiamo con successo per isolare grandi complessi proteici da embrioni di Drosophila. In questo metodo, complessi proteici negli embrioni viventi sono reticolati con una bassa concentrazione di formaldeide e successivamente complessi proteici di interesse sono isolati da IP con un anticorpo contro un componente noto dei complessi seguita da purificazione gel dei complessi e analisi di spettrometria di massa a identificare i componenti complessi sconosciuti. Poiché formaldeide è in grado di permeare la membrana cellulare e ha un raggio di reticolazione 2.3-2.7 Å 3, complessi proteici possono essere reticolati in vivo e le componenti complessi sono suscettibili di essere vicini l&#39;uno all&#39;altro. In questo articolodescrivere questo metodo usando l&#39;isolamento di Tudor (Tud) complesso proteico come esempio. Tud è una proteina germinale che è essenziale per lo sviluppo della linea germinale 4-7. Questa proteina contiene 11 domini Tud noti per interagire con arginines denaturato o lysines di altri polipeptidi 8-10. In precedenza, abbiamo generato una linea di Drosophila transgenica che esprime HA-tagged funzionale Tud 5 e, quindi, specifici anticorpi anti-HA viene utilizzato per abbattere complesso Tud dopo reticolazione. Oltre a legami crociati tra proteine, formaldeide può generare acido nucleico reticola-proteina e viene usato in esperimenti di ChIP-seq. Inoltre, in Drosophila, in vivo reticolazione con formaldeide ha permesso l&#39;identificazione di un target di RNA di Vasa RNA elicasi proteine ​​11. Mentre in questo articolo descriviamo un metodo per reticolazione in vivo e purria del complessi proteici da embrioni di Drosophila, questo metodo può essere adattato per altri organismi e tessuti.

<table><tbody><tr><td>Drosophila agar</td><td>Lab Scientific (http://www.labscientific.com/)</td><td>FLY-8020-1</td><td>Non sterilizzare in autoclave la miscela di acqua e agar per un periodo di tempo prolungato in quanto causerà la fragilità delle piastre di succo di mela</td></tr><tr><td>Metil 4-idrossibenzoato</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>H5501</td><td>Altro nome: TEGOSEPT</td></tr><tr><td>Popolazione gabbia</td><td>Flystuff ( http://www.flystuff.com/)</td><td>59-104</td><td></td></tr><tr><td>Rete di nylon fine</td><td>Flystuff (http://www.flystuff.com/)</td><td>57-102</td><td>Quando si realizza il cestello di raccolta, tagliare la maglia leggermente più grande dell'apertura del tappo del tubo del falco per garantire una tenuta ermetica</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore a decca</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>D8938-1SET</td><td>Raffreddare l'omogeneizzatore con ghiaccio e prerisciacquare con tampone di lisi fredda prima dell'uso per prevenire la degradazione delle proteine</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)</td><td>4693132001</td><td>PBS potrebbe essere utilizzato per preparare una soluzione madre concentrata di inibitore della proteasi</td></tr><tr><td>Perle di agarosio anti-HA</td><td>MBL international (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>Il kit include anche il peptide HA e le colonne di spin HA-peptide</td></tr><tr><td></td><td>MBL international (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>Preparare a 2 mg/ml con PBS&nbsp;</td></tr><tr><td>Colonna di centrifuga</td><td>MBL international (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>Le colonne di centrifuga sono incluse come parte del kit</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td></td><td></td>BP26324</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Eptano</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>H350-4</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)</td><td>AM9625</td><td>Diluire da 10X a 1X con acqua nanopura prima dell'uso</td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>BioRad (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0724</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>BioRad (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0730</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetanthansulfonilfluoruro Sigma</td><td>(http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>P7626-1G</td><td>Preparare 200 mM di soluzione madre in isopropanolo, quindi diluire alla concentrazione di lavoro di 2 mM in tampone di lisi</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>I8896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 15 ml</td><td>USA Scientific (http://www.usascientific.com/)</td><td>1475-0511</td><td></td></tr><tr><td>Candeggina</td><td>marca</td><td></td> Clorox <td>Diluire con lo stesso volume di acqua nanopura per ottenere il 50% di candeggina</td></tr><tr><td>Provette da 50 ml</td><td>BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Setaccio per lo strato superiore</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>04-884-1AK</td><td></td></tr><tr><td>Setaccio per lo strato inferiore</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>04-884-1BA</td><td></td></tr></tbody></table>

un in vivo la reticolazione approccio per isolare complessi proteici da drosophila embrioni

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Molti processi cellulari sono controllati da complessi proteici multisubunit. Spesso questi complessi formano transitoriamente e richiedono ambiente nativo da montare. Pertanto, per identificare questi complessi proteici funzionali, è importante stabilizzarli in vivo prima lisi cellulare e successiva purificazione. Qui si descrive un metodo utilizzato per isolare grandi complessi proteici in buona fede da embrioni di Drosophila. Questo metodo si basa su embrione permeabilizzazione e stabilizzazione dei complessi all&#39;interno degli embrioni in vivo reticolazione usando una bassa concentrazione di formaldeide, che può facilmente attraversare la membrana cellulare. Successivamente, il complesso proteina di interesse è immunopurified seguita da purificazione gel e analizzato mediante spettrometria di massa. Illustriamo questo metodo utilizzando la purificazione di un complesso proteico Tudor, che è essenziale per lo sviluppo della linea germinale. Tudor è una grande proteina, che contiene più domini Tudor - piccolomoduli che interagiscono con arginine metilate o lysines delle proteine ​​target. Questo metodo può essere adattato per l&#39;isolamento di complessi proteina nativa da organismi e tessuti differenti.

L&#39;efficacia della reticolazione e la purificazione successo del reticolato complesso proteico Tud sono stati analizzati mediante SDS-PAGE su un 3% - 7% gel fase (illustrata in figura 1), seguita da Western blot (Figura 2). Lo scopo di utilizzare il 3% - gel passaggio 7% si basa sulla separazione effettiva del reticolato complesso proteico Tud dalla restante proteina non reticolato Tud e concentrazione del complesso. Nelle nostre condizioni di reticolazio...

Complessi proteici Multi-componenti giocano un ruolo cruciale durante la funzione e lo sviluppo cellulare. Qui si descrive un metodo utilizzato per isolare complessi proteina nativa da embrioni di Drosophila in vivo dopo reticolazione seguita da purificazione dei complessi reticolati per successiva analisi struttura-funzione.

Un In vivo La reticolazione Approccio per isolare complessi proteici da Drosophila Embrioni

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere complessi proteici da embrioni di drosophila viventi, utilizzando un approccio di cross-linking in vivo. Questo viene realizzato innanzitutto caricando migliaia di moscerini in una gabbia per popolazioni e raccogliendo embrioni precoci. Successivamente, le proteine vengono stabilizzate in vivo mediante cross-linking con formaldeide, che fissa i complessi proteici interni.Successivamente, vengono preparati estratti proteici dagli embrioni cross-linkati in modo che i complessi proteici possano essere immunoprecipitati. I risultati identificano i complessi proteici isolati mediante analisi di Western blot. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'isolamento tradizionale di complessi proteici con approcci in vitro, è che questo approccio in vivo ci permette di catturare interazioni proteina-proteina transitorie ma funzionalmente significative, che potrebbero non essere rilevate con i tradizionali metodi in vitro.La tecnica sarà dimostrata dalla dott.ssa Min Gao, una ricercatrice postdottorato del mio laboratorio. Mescolare prima acqua e agar per moscerini con un agitatore magnetico. Autoclava

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Noi descriviamo un protocollo semplificato per la generazione di "filetto" preparati di embrioni di Drosophila genotipi specifici. Questo protocollo permette l'esecuzione efficiente di una varietà di schermi genetica. Inoltre permette una visualizzazione eccellente delle strutture nell'embrione tardi.

Dissezione di vivere Drosophila Embrioni: Metodi semplificati per lo screening Collezioni Mutant dalla colorazione anticorpale

La cellula permeabile reticolante DSP [dithiobis-(succinimidile propionato)] stabilizza le interazioni transienti e...

Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità

Descriviamo un metodo per separare gli organelli dalla densità del...

In vivo centrifugazione di embrioni di Drosophila

Il cinetocore è dove il SAC inizia il suo segnale di controllo della segregazione mitotica dei cromatidi fratelli. Un metodo è descritto per visualizzare il reclutamento e il fatturato di una delle proteine ​​cinetocoro e il suo coordinamento con il movimento dei cromosomi...

Studiare Checkpoint mitotica illustrando un comportamento dinamico delle proteine ​​cinetocoro e Motion cromosoma in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni sinciziale

Questo protocollo dimostra come Proximity legatura test può essere utilizzato per rilevare in situ interazioni proteina-proteina in Drosophila larvale neuromuscolare giunzione. Con questa tecnica, dischi grandi e Hu-li Shao tai sono presenti per formare un complesso in corrispondenza della zona postsinaptico, un'associazione precedentemente identificato mediante co-immunoprecipitazione.

Rilevamento di In Situ Complessi proteina-proteina del Drosophila Larvale neuromuscolare Junction Utilizzando prossimità legatura Assay

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un approccio semplice e poco costoso per la raccolta di embrioni di Drosophila a media scala (0,5-1 g) e la preparazione di estratti proteici che possono essere utilizzati nelle applicazioni proteomiche a valle, come la spettrometria di massa di purificazione-affinità (AP-MS ).

Preparazione su media scala di<em&gt; Drosophila</em&gt; Estratti di embrioni per esperimenti proteomici

Qui illustriamo come microscopia di localizzazione foto-attivata di singola molecola può essere effettuata sul terminale del nervo motore di un live Drosophila melanogaster terzo instar larva.

In Vivo Singola molecola Tracking al terminale presinaptico nervo motore Drosophila

Questo protocollo dimostra l'uso del saggio di legatura di prossimità per sondare le interazioni proteina-proteina in situ nella germinale C. elegans.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly nella C. elegans Germline utilizzando Proximity Ligation Assay

Presentato qui è un protocollo per microiniettare e contemporaneamente immaginire più embrioni di Drosophila durante lo sviluppo embrionale utilizzando un imager a base di piastre e ad alto contenuto.

Preparazione e microiniezione dell'embrione Drosophila per microscopia a cellule vive eseguita utilizzando un analizzatore automatizzato ad alto contenuto

Nel primo embrione di Drosophila , molti organelli sono mobili. In linea di principio, possono essere ripresi dal vivo tramite specifiche sonde fluorescenti, ma il guscio d'uovo impedisce l'applicazione diretta all'embrione. Questo protocollo descrive come introdurre tali sonde tramite microiniezione e quindi analizzare il movimento degli organelli di massa tramite velocimetria dell'immagine delle particelle .

Visualizzazione del traffico citoscheletro-dipendente di organelli contenenti lipidi in embrioni di Drosophila

Scopri l'isolamento di complessi proteici nativi da embrioni di Drosophila mediante reticolazione in vivo con formaldeide. Questo metodo consente di catturare interazioni proteiche transitorie essenziali per le funzioni cellulari.

Un In vivo La reticolazione Approccio per isolare complessi proteici da Drosophila Embrioni

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