Preparazione della neuronali Co-culture con precisione singola cella
20 maggio 2014
Sono descritti protocolli per singolo neurone microfluidica arraying e mascheramento acqua per il patterning plasma in-chip di rivestimenti biomateriale. Co-colture altamente interconnessi possono essere preparati utilizzando gli ingressi di cellule minimali.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di disporre singoli neuroni in due compartimenti microfluidici per la preparazione di una co-coltura neuronale connessa. Ciò si ottiene stampando prima la replica del dispositivo microfluidico in PDMS e incapsulando il dispositivo mediante incollaggio al plasma. Il secondo passo consiste nel modellare la polilisina all'interno del dispositivo microfluidico.
Ciò si ottiene riempiendo il dispositivo con polilisina, consentendo la formazione di una massa d'acqua per evaporazione e quindi utilizzando un trattamento al plasma per rimuovere la polilisina esposta per creare il modello di biomateriale. Successivamente, utilizzare una siringa per aspirare i neuroni attraverso il circuito microfluidico per l'array di singoli neuroni. Il dispositivo viene inserito nell'incubatore di coltura tissutale per le escrescenze di neuriti per estendere e collegare le due popolazioni di neuroni.
La fase finale prevede l'utilizzo di una pompa di aspirazione per trattare selettivamente un compartimento e monitorare la propagazione dei materiali e la patologia all'interno del circuito neuronale. A dimostrare la procedura saranno Yayu Chang e Sarada del laboratorio dell'ISIS. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente, come la camera dei componenti PDMS disponibile in commercio, è che la co-coltura neuronale viene preparata con la posizione di una singola cellula per l'analisi di singoli algoritmi neurologici.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze. Ad esempio, qual è il meccanismo alla base della propagazione degli aggregati di torre iperfosfo-correlati nella malattia di Alzheimer o come infettare l'organismo si diffonde in tutto il cervello? La tecnica è ideale per applicazioni ad alto rendimento, poiché sono necessarie solo poche centinaia di neuroni per ogni condizione sperimentale.
Iniziare la procedura mescolando accuratamente il prepolimero PDMS con l'agente indurente in un rapporto di 10 a uno. Successivamente, degassare la miscela in un essiccatore sottovuoto per tipicamente 20 minuti. Quindi posizionare il wafer SU eight microstrutturato a due strati su una piastra riscaldante a 80 gradi Celsius e allineare i telai in polimero a ciascun dispositivo sul wafer.
Versare il PDMS nel telaio e attendere un'ora per garantire la completa polimerizzazione termica. Una volta indurito, rimuovere la cialda dalla piastra calda e lasciarla raffreddare su una superficie piana. Successivamente, indossando gli occhiali protettivi, utilizzare un bisturi rigido per sollevare delicatamente la montatura e il PDMS dal wafer da un angolo.
Rimuovere lo stampo PDMS dal telaio e utilizzare un paio di forbici per tagliare il dispositivo. Applicare il PDMS rimanente sull'intero wafer per proteggerlo durante lo stoccaggio. Dopo aver staccato questo strato PDMS dal wafer, tutti i contaminanti particellari vengono rimossi dalla superficie in vista di un ripetuto stampaggio PDMS.
Ora prepara le sei porte di interfaccia utilizzando un punzone per biopsia da tre millimetri con le caratteristiche microstrutturate rivolte verso l'alto per facilitare l'allineamento delle porte con i canali microfluidici. Ispezionare il dispositivo per verificare la presenza di particelle e rimuoverle con nastro adesivo reversibile. Quindi, preparare un sottile strato PDMS montato su un vetrino di vetro versando una piccola quantità della miscela di agente indurente PDMS sulla piastra di Petri.
Premere un vetrino coprioggetto sullo strato PDMS. Posizionarlo sulla piastra calda e polimerizzarlo termicamente per circa 10 minuti. Poco dopo il raffreddamento e indossando gli occhiali di sicurezza, utilizzare un bisturi per premiare il vetrino coprioggetti.
Doppio strato PDMS dalla piastra di Petri per incapsulare il dispositivo. È necessario un buon legame P-D-M-S-P-D-M-S. Posizionare il doppio strato PDMS e il dispositivo microfluidico nel forno al plasma per 40 secondi.
Una volta trattato al plasma, premere entrambe le parti insieme e lasciare che si leghino completamente poco dopo il legame al plasma con la pipetta 0,5 microlitri di polilisina nella porta centrale inferiore. L'intero circuito microfluidico dovrebbe essere riempito per azione capillare in pochi secondi. Quindi lasciare agire per alcuni minuti per rivestire completamente le superfici idrofile PDMS con polilisina.
Quindi, rimuovere la polilisina non legata mediante lavaggio ad aspirazione. Utilizzare un raccordo a quattro vie per collegare la pompa alle tre porte superiori con tubi di uguale lunghezza e avviare l'aspirazione Aggiungere PBS alle tre porte inferiori e lavare per un minuto. Successivamente, staccare il tubo e rimuovere l'eventuale PBS rimanente dalle porte.
Trasferire il dispositivo su un microscopio e riscaldare utilizzando l'illuminazione per aumentare l'evaporazione dalle porte per una rapida formazione di una maschera d'acqua. Ispezionare il dispositivo al microscopio per assicurarsi che il mascheramento dell'acqua sia completo. Quindi inserire i perni in acciaio inossidabile nelle porte per accoppiare il plasma generato da un generatore di scarica a corona portatile nei canali microfluidici vuoti.
Puntare la punta della sorgente di plasma vicino alla punta di uno spillo e del plasma. Trattare il microcanale per un secondo. Successivamente, rimuovere i perni, collegare le tre porte superiori alla pompa.
Avviare l'aspirazione ed erogare il PBS nelle tre porte inferiori. Al fine di disegnare PBS attraverso il circuito microfluidico. Rimuovere tutto il PBS dal circuito microfluidico e lasciare agire per una notte per completare la modellazione del biomateriale.
Qui il modello viene visualizzato utilizzando polilisina marcata con fluoresceina. In questa procedura, adescare il dispositivo con un supporto appropriato aggiungendo 20 microlitri a ciascuna delle tre porte inferiori. Quindi utilizzare l'aspirazione parallela dalle tre porte superiori per riempire rapidamente il circuito microfluidico con i fluidi.
Aggiungere 20 microlitri di una sospensione cellulare disaggregata a ciascuna delle porte inferiori laterali. Utilizzare una siringa per aspirare delicatamente dalle tre porte superiori. L'orango neuronale completo richiede in genere un minuto.
Quindi, utilizzando un prelievo di pipette, i neuroni in eccesso rimangono nelle porte per un anello nei successivi dispositivi microfluidici. Questo esempio mostra come i neuroni sono disposti con precisione a singola cellula. Successivamente, immergere il dispositivo nel terreno e posizionare il dispositivo nell'incubatore affinché le cellule aderiscano completamente al modello di biomateriale entro poche ore.
Come per le colture normali, i terreni devono essere riforniti periodicamente per trattare selettivamente il compartimento di coltura neuronale o il compartimento centrale di neurocrescita. Erogare 20 microlitri della sostanza in esame nella porta inferiore, collegata al canale di interesse e aspirare dalla porta direttamente soprastante. In questo esempio, è stato applicato un trattamento selettivo al compartimento centrale e in questo esempio è stato trattato il compartimento fiancheggiante.
I trattamenti sono stati stabiliti in un minuto e sono stati mantenuti per 60 minuti. Le cocolture neuronali possono quindi essere monitorate per misurare la propagazione dei materiali o la patologia. Una volta padroneggiati, molti dispositivi microfluidici possono essere preparati in una sola mattina.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come preparare le colture neuronali minimaliste nei tuoi laboratori e usarle per studiare i meccanismi alla base della propagazione del materiale e della malattia nel cervello.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo descrive i protocolli per l'arraying di neuroni singoli su microfluidi e il mascheramento dell'acqua per il patterning del plasma in chip di rivestimenti biomateriali. Il metodo consente la preparazione di co-culture altamente interconnesse utilizzando un minimo input di cellule.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Microfluidica
- Coltura cellulare
Sfondo
- I dispositivi microfluidici consentono un controllo preciso sugli ambienti cellulari.
- L'arraying di neuroni singoli è cruciale per lo studio delle connessioni neuronali.
- Le tecniche di patterning del plasma migliorano le applicazioni dei biomateriali.
- I sistemi di co-cultura sono importanti per comprendere le interazioni neuronali.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo per l'arraying di neuroni singoli in dispositivi microfluidici.
- Creare co-culture neuronali interconnesse.
- Utilizzare un minimo input di cellule per una sperimentazione efficiente.
Metodi utilizzati
- Stampaggio di replica di dispositivi microfluidici in PDMS.
- Incollaggio al plasma per incapsulare il dispositivo microfluidico.
- Patterning della polilisina all'interno del dispositivo utilizzando il mascheramento dell'acqua.
- Aspirazione dei neuroni attraverso il circuito microfluidico per l'arraying.
Risultati principali
- Arraying di successo di neuroni singoli in compartimenti microfluidici.
- Formazione di prolungamenti neuronali che connettono due popolazioni di neuroni.
- Dimostrazione di una co-cultura efficace con un minimo input di cellule.
- Stabilire un metodo affidabile per il patterning dei biomateriali.
Conclusioni
- I protocolli descritti consentono un efficiente arraying di neuroni singoli.
- È possibile ottenere co-culture interconnesse con risorse minime.
- Questo metodo ha potenziali applicazioni nella ricerca neuronale e nello sviluppo di biomateriali.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput neuroscience research with minimal cellular input, addressing a key bottleneck in studying low-abundance neuronal populations such as dopaminergic substantia nigra neurons. By achieving >85% intercompartment connectivity with single-cell precision, it supports predictive modeling of neuronal circuit dynamics and pathology propagation. The approach enhances translational relevance for target validation in neurodegenerative disease mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of individual neuronal mechanisms underlying protein aggregate propagation in Alzheimer's disease models.
- Operational Value: Reduces cell input requirements from thousands to hundreds per condition, improving assay feasibility for rare primary neurons.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of cell-autonomous and non-cell-autonomous pathways in neurodegeneration.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates highly interconnected co-cultures (>85% connectivity) for reliable quantification of neurite outgrowth and signal transmission.
- Operational Value: Compatible with microfluidic automation and parallel device fabrication for scalable screening campaigns.
- Assay Readiness: Enables standardized biomaterial patterning via water masking and plasma treatment for reproducible neuronal adhesion and guidance.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Models neuronal circuit-level pathology spread relevant to prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.
- Mechanistic De-risking: Allows compartment-specific treatment to isolate drug effects on anterograde vs. retrograde pathology propagation.
- Preclinical Continuity: Supports longitudinal monitoring of material or pathological transfer in human-relevant neuronal systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, enabling target validation through precise neuronal arraying before progressing to mechanistic screening and preclinical validation of disease-modifying candidates.
- Discovery Biology: Supports functional interrogation of neuronal connectivity and pathway-specific responses to therapeutic candidates.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible neurite outgrowth metrics essential for compound effect comparison across conditions.
- Analytics: Enables compartment-specific aspiration and treatment to measure directional propagation of therapeutics or pathological agents.
- Translational Research: Models human-relevant neuronal circuit interactions to de-risk targets involved in trans-synaptic disease spread.
- Enterprise Reuse: PDMS microfluidic devices can be replicated and standardized across labs for consistent neuronal co-culture generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuronal culture models by enabling single-cell resolution and controlled circuit formation.
- Operational Value: Standardizes neuronal patterning and connectivity through microfluidic confinement and plasma-guided biomaterial deposition.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing quantitative, reproducible readouts of neuronal pathway modulation.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on their role in intercellular pathology propagation models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, PDMS handling, and plasma surface treatment.
- Depends on access to plasma ovens, handheld corona discharge generators, and fluorescence microscopy for patterning validation.
- Necessitates standardization of aspiration flow rates and timing for consistent single-neuron loading across devices.
- Adaptation to other neuronal subtypes may require optimization of polylysine concentration and incubation timing.
- Practical limitations include device clogging risk during neuron aspiration and variability in outgrowth efficiency across neuronal types.
