Name: Lutilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Scopri come valutare la risposta immunitaria nei topi mediante somministrazione orofaringea di LPS e lavaggio broncoalveolare. Questa tecnica permette analisi accurate delle risposte infiammatorie polmonari.

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Gli autori ringraziano il Regional College VA-MD di medicina veterinaria per fornire assistenza di base e tecnico per questo progetto. Questo lavoro è supportato da un NIH Career Development Award (K01DK092355).

Tutti gli studi sono stati condotti sotto l&#39;approvazione del Comitato Istituzionale Cura ed uso (IACUC) per Virginia Tech e secondo il National Institutes of Health Guide per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. 1. Endotracheale (it) inoculazione di LPS tramite Amministrazione orofaringea <ol><li> Assicurarsi che ogni animale è identificato in modo univoco utilizzando un punzone orecchio, marchio auricolare, o altro metodo istituzionalmente approvato. </li><li> Registrare il peso corporeo iniziale e la temperatura corporea per ogni animale. </li><li> Preparare il brodo di lavoro di LPS. Ciascun topo riceverà una dose di 50 microlitri di 1 mg / kg di LPS in 1x tampone fosfato salino (PBS). Animali trattati Mock riceveranno una dose di 50 ml di 1x PBS. </li><li> Preparare una camera adeguato per la somministrazione di isoflurano utilizzando il seguente metodo goccia. Linee guida istituzionali variano per quanto riguarda l&#39;uso di isoflurano e di altri agenti anestetici e prima initiatzione eventuali studi, le persone devono contattare il Dipartimento della loro istituzione di animali Cura / Welfare per assicurare le tutte le linee guida siano adeguatamente soddisfatte. Se il metodo goccia dell&#39;isoflurano non è un&#39;opzione, altri agenti anestetici sono alternative accettabili. <ol><li> In un armadietto di sicurezza appropriato, applicare circa 3 ml di isoflurano per un tovagliolo di carta assorbente piegato e posto sul fondo di un bicchiere da 500 ml. </li><li> Mettere un piccolo pezzo di foglio di alluminio sulla parte superiore del tovagliolo di carta e coprire il becher con un coperchio trasparente. </li></ol></li><li> Preparare gli strumenti e reagenti che verranno utilizzati durante la esso inoculazione. Posizionare l&#39;elastico che garantirà gli animali testa sul cavalletto intubazione. Questa procedura richiede un paio di pinze diritte, una coppia di pinze inclinate o curve, e una pipetta p200 con punte. </li><li> Carico 50 ml di LPS nel puntale e posto in un luogo facilmente raggiungibile, accanto allo stand intubazione. </li><li> Anestetizzare il mouseponendo l&#39;animale nella camera di isoflurano e coprendo la camera col coperchio trasparente. Osservare modelli di respirazione dell&#39;animale, che sarà rapida e superficiale quando in primo luogo posto nella camera. L&#39;animale sarà sufficientemente anestetizzati quando i tassi di respirazione avvicinano 1 respiro / 2 sec, che di solito è raggiungibile in 30 secondi di mettere nella camera. Il mouse deve essere anestetizzato come indicato nel protocollo animali approvato con il metodo goccia isoflurano. </li><li> Rimuovere il mouse anestetizzato dalla camera e sospendere l&#39;animale sul intubazione stare dai suoi incisivi anteriori. Assicurare che l&#39;animale è trattenuto in modo sicuro e la bocca e la lingua sono accessibili. </li><li> Garantire delicatamente la lingua con le pinze diritte. Afferrare la linguetta con le pinze ad angolo e tirare delicatamente fuori dalla bocca fino a quando una leggera resistenza. Questa azione è sufficiente a bloccare l&#39;epiglottide e accedere alla trachea. </li><li> Mentre si continua a tenere la lingua inposizione estesa, somministrare la dose da 50 ml di LPS nella parte posteriore della gola e coprire immediatamente narici dell&#39;animale con un dito guantato. L&#39;LPS sarà visibile nella parte posteriore della gola finché il mouse inala. </li><li> Continuare a coprire le narici e tenere la lingua esteso per 5-10 respiri supplementari. </li><li> Rimuovere il mouse dal supporto intubazione e posizionare l&#39;animale torna in una nuova gabbia fino a quando non recupera dall&#39;anestesia. </li><li> Controllo marker associati alla progressione della malattia. Il peso corporeo e la temperatura corporea devono essere monitorati ogni 4-8 ore per la durata dello studio. Allo stesso modo, valutare le caratteristiche comportamentali e dei sintomi clinici associati a un aumento della morbilità. </li><li> Per valutare la progressione della malattia, topi raccolto in specifici punti temporali successivi l&#39;esposizione LPS. Punti temporali tipici per la raccolta a seguito di esposizione LPS includono 0, 6, 12, 18, 24, e 48 hr. Per valutare il recupero e la sopravvivenza, valutare i topi per 7 bisys post-inoculazione. </li></ol> 2. Siero e di lavaggio broncoalveolare Fluid (BALF) Collezione <ol><li> Sacrifica il mouse utilizzando un metodo istituzionalmente riconosciuto. </li><li> Mettere l&#39;animale sul dorso e assicurarlo ad un bordo necroscopia, idealmente 0,5 in (1,27 cm) di altezza. </li><li> Bagnare l&#39;intero mouse con il 70% di etanolo. </li><li> Usando una siringa da 1 ml con un ago 27 G, condurre una puntura cardiaca prima di effettuare qualsiasi incisioni. Dovrebbe essere possibile ritirare 500-800 microlitri di sangue intero da un singolo mouse. </li><li> Rimuovere l&#39;ago dalla siringa e trasferire il sangue intero di un prelabeled provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Per la raccolta del siero, permettono il sangue intero a coagulare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Oltre alla raccolta siero, questa procedura può anche essere modificato incorporando un anticoagulante nel tubo e siringa, prima di raccogliere il sangue intero, per studiare cellule immunitarie circolanti. </li><li> Effettuare una incisione orizzontale aattraversare la lunghezza della cavità peritoneale e una incisione verticale dalla cavità peritoneale alla mascella inferiore del mouse. </li><li> Utilizzando pinze, afferrare entrambi i lati della incisione e tirare delicatamente la pelle dalla cavità peritoneale e toracica sottostanti. </li><li> Fare una grande incisione lungo la lunghezza della cavità peritoneale dai genitali allo sterno, avendo cura di evitare di tagliare il diaframma. Spostare delicatamente l&#39;intestino nella cavità peritoneale per consentire l&#39;accesso a uno dei reni. </li><li> Tagliare la vena renale che porta al rene per servire come un punto di drenaggio per perfusione. </li><li> Nick diaframma usando forbici, avendo cura di evitare i polmoni e il cuore, per esporre il lato sinistro del cuore. </li><li> Perfusione manualmente cuore utilizzando una siringa da 10 ml con un ago 27 G e soluzione PBS 1x. Evitare di applicare una forza eccessiva durante la perfusione per garantire che la soluzione salina non è costretto nei polmoni. Il sangue residuo deve defluire dalla incisione della vena porta.</li><li> Tagliare con cautela la cassa toracica lungo lo sterno usando contundenti / forbici spuntate, avendo cura di evitare di tagliare il cuore ei polmoni. Accidentalmente taglio polmoni durante questa procedura riduce significativamente la quantità di BALF raccolti e si tradurrà in una incapacità di gonfiare correttamente polmoni con fissativo. </li><li> Isolare delicatamente il cuore ed i polmoni di distanza dalla gabbia toracica con pinze. Tagliare con cautela ogni sezione della gabbia toracica con le forbici smussate / smussato il più vicino alla colonna vertebrale come possibile e rimuovere completamente entrambe le sezioni. </li><li> Separare le ghiandole salivari con pinze o rimuoverli con le forbici, per esporre la trachea. </li><li> Tagliare con cura i muscoli che si sovrappongono la trachea con le forbici. È essenziale che la trachea non essere tagliata durante questo processo. </li><li> Utilizzando le forbici, separare la clavicola sovrastante la trachea. </li><li> Afferrare il timo con pinze e sollevare il tessuto lontano dal cuore. Togliere il timo con le forbici, avendo cura dievitare di tagliare il cuore oi polmoni. </li><li> Fai una piccola incisione orizzontale nella trachea 1-2 anelli sotto la laringe con le forbici angolate (45-90 º angolo, tagliente / sharp). L&#39;incisione dovrebbe essere grande abbastanza per fissare saldamente la cannula. </li><li> Inserire la cannula in modo che l&#39;estremità rastremata estende 2-3 anelli tracheali sotto l&#39;incisione e fissare la cannula in posizione con una sutura di seta. Assicurarsi che la sutura passa tra la trachea e l&#39;esofago ed è ben teso sulla cannula. </li><li> Riempire una siringa da 1 ml di 1 ml di soluzione salina tamponata Hanks (HBSS) e inserire delicatamente la sua luer nella cannula. </li><li> Con un movimento lento, ma costante, iniettare ~ 900 microlitri nella trachea, gonfiando i polmoni, e ritirare immediatamente la HBSS. Posizionare il BALF recuperato in un tubo da 15 ml. </li><li> Ripetere questo lavaggio 2 volte supplementari per raccogliere circa 3 ml di BALF per analisi future. Conservare il BALF su ghiaccio oppure a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol><ol><li> Inserire una siringa da 10 ml in stand inflazione polmone. Assemblare il tubo al luer, il luer al rubinetto, e il rubinetto alla siringa. Assicurarsi che il rubinetto è in posizione chiusa. La siringa 10 ml servirà come un serbatoio a gravità. Il serbatoio deve essere fissato al basamento inflazione 4,75 in sopra l&#39;animale e la parte superiore del serbatoio deve estendersi 10.5 sopra l&#39;animale. </li><li> Riempire la siringa con soluzione neutra formalina tamponata. Assicurarsi che la siringa è completamente riempito con il fissativo. </li><li> Inserire un telo assorbente sotto l&#39;estremità aperta del tubo e aprire il rubinetto per consentire il fissativo per riempire il tubo. Una volta che il fissativo inizia a scorrere dal tubo, chiudere immediatamente il rubinetto e riempire la siringa verso l&#39;alto con fissativo. E &#39;importante che la siringa sia completamente riempito di fornire la giusta quantità di pressione per il gonfiaggio polmonare. </li><li&gt; Passare delicatamente un secondo pezzo di filo di sutura sotto la trachea, circa 1-2 anelli tracheali sotto dell&#39;estremità della cannula. </li><li> Legare un unico nodo sciolto nella sutura; tuttavia, non tirare il nodo stretto. </li><li> Inserire il tubo dalla inflazione del mouse stare nella cannula. </li><li> Aprire il rubinetto e permettono ai polmoni di riempirsi dall&#39;inflazione gravità. </li><li> Una volta che i polmoni raggiungono il loro massimo livello di inflazione, tirare la sutura stretto e legare un secondo nodo. </li><li> Chiudere il rubinetto e rimuovere il tubo dalla cannula. </li><li> Rimuovere delicatamente la cannula dalla trachea afferrando la sutura con un paio di pinze e tenendo la cannula con le dita. Saldamente tirare la sutura verso la cavità toracica e la cannula indietro verso il naso del mouse. </li><li> Afferrare la trachea o le suture con una pinza e sollevare la trachea lontano dalla cavità del collo. </li><li> Sever caudale trachea alla sutura legato con le forbici spuntate. </li><li> Una volta che la tracheostomiaa è libero dai tessuti sottostanti, cominciano a tirare la trachea lontano dal mouse. Sollevare delicatamente i polmoni dalla cavità toracica. </li><li> Tagliare con cautela il tessuto connettivo che tiene i polmoni nella cavità toracica. Continuare a tirare la trachea lontano dal corpo del mouse e applicare una forza costante verso l&#39;alto mentre il taglio dei collegamenti sottostanti. Fare attenzione a non tagliare i polmoni. Si noti che il cuore deve essere lasciato attaccato ai polmoni utilizzando questo metodo. </li><li> Una volta che i polmoni sono stati rimossi, metterli in 10 ml di formalina. </li><li> Rimuovere una sezione di coda di topo per la genotipizzazione. </li><li> Smaltire la carcassa del mouse seguendo le linee guida istituzionali appropriati. </li></ol> 4. Valutazione citochine <ol><li> Centrifugare il sangue intero, raccolto sotto passo 2.5, a 12.000 xg per 5 min a isolare il siero. Trasferire il siero di un prelabeled 1,5 ml provetta da microcentrifuga e conservare a -80 ° C. </li><li> Valutare il Serui livelli di citochine m di ELISA o un kit simile. Diluire il siero 1:05-01:20 in un tampone di diluizione appropriata, a seconda del dosaggio, seguendo le istruzioni del fabbricante. Le diluizioni devono essere empiricamente determinato prima di eseguire la maggior parte dei campioni. </li><li> A causa del basso volume di siero raccolti, ridurre il volume del campione caricato sulla piastra ELISA metà. Ad esempio, la maggior parte dei test ELISA commerciali utilizzano 100 volumi microlitri di standard e campioni. Per conservare i campioni, carico 50 ml di standard e siero diluito per bene. </li><li> Centrifugare la BALF in una centrifuga da tavolo refrigerata a 200 xg per 5 min. Trasferire il surnatante libero cella in due prelabeled provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -80 ° C. </li><li> Valutare citochine BALF da ELISA o un kit simile senza diluire. </li><li> Conservare siero inutilizzato e BALF a -80 ° C. </li></ol> 5. La colorazione differenziale e BAL Cellularità valutazione <ol><li> Dopo BALF centrifugazione e rimozione completa HBSS, la lisi dei globuli rossi pellet con soluzione salina ipotonica. Risospendere le cellule in 900 ml di acqua distillata. Aggiungere immediatamente 100 ml di 10x PBS. </li><li> Lisi singolarmente ogni campione. Se i campioni contengono quantità eccessive di globuli rossi, le cellule possono essere in pellet nella centrifuga da tavolo a 400 xg per 5 min e il protocollo sangue rosso lisi cellulare può essere ripetuto. </li><li> Determinare la cellularità BALF totale della sospensione 1 ml utilizzando un emocitometro sotto 10X o 20 ingrandimenti con Trypan Blue colorazione. Valutare e presentare questi dati come cellule / ml. </li><li> Preparare i materiali per la cytospin e colorazione differenziale. Etichettare vetrini da microscopio standard, con una matita o una penna resistente ai solventi. Fissare le diapositive in una staffa cytospin e imbuto. Fissare il gruppo di scorrimento nel rotore cytospin. </li><li> Cytospin 150 ml di BALF a 100 xg per 5 min. Se la densità cellulare è troppo grande per efficacementevalutare la morfologia cellulare, ridurre il volume filata giù sui fogli. Lasciare i vetrini all&#39;aria secca durante la notte. </li><li> Macchia differenziale le diapositive seguendo i protocolli manufatti. Lasciare i vetrini all&#39;aria secca durante la notte. I vetrini coprioggetto utilizzando Permount e valutare i vetrini con un microscopio dotato di un obiettivo 20X e 40X. </li><li> Raccogliere le restanti cellule per analisi successive, come FACS, microscopia elettronica, microscopia confocale, estrazione di RNA per la valutazione dell&#39;espressione genica, e / o estrazione di proteine ​​per western blot. </li></ol> 6. Valutazione Istopatologia <ol><li> Preparare i polmoni per la valutazione istopatologica. Dopo 24-48 ore di fissazione in formalina, ventralmente orientare l&#39;intero polmoni gonfiati ed inclusi in paraffina. Tagliare i blocchi risultanti per esporre la principale vie di conduzione. </li><li> Per migliorare la precisione di punteggio, posizionare i polmoni nella stessa posizione e tagliare ogni blocco di cedere la visualizzazione longitudinale massima di tegli intrapolmonare principale vie aeree assiale. Da questo punto, tagliate 5 micron sezioni seriali e macchia con ematossilina ed eosina (H &amp; E). Sezioni aggiuntive possono essere tagliati e preparati per l&#39;ibridazione in situ utilizzando protocolli standard. </li><li> Valutare istopatologia utilizzando un sistema di punteggio semiquantitativo basato sui seguenti parametri infiammatori, intaccate tra 0 (assente) e 3 (grave): mononucleare polimorfonucleati e infiltrazione di cellule; Airway iperplasia delle cellule epiteliali e lesioni; stravaso; perivascolare e cuffing peribroncheolar; e la percentuale del polmone coinvolto con infiammazione. Polmone esame istopatologico dovrebbe essere valutato da un esperto patologo. </li><li> Media di tutti i punteggi dei parametri per generare un punteggio totale istopatologia o utilizzare i punteggi individuali per quantificare aspetti specifici della progressione della malattia. Condurre tutti segnando in doppio cieco, con revisori cieco sia il genotipo e il trattamento. Questo sistema di punteggio è stato precedente ay descritto 6,7,10. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

I passaggi più critici per valutare correttamente la risposta immunitaria nei polmoni del mouse è il seguente: 1) scegliere il ceppo del mouse appropriato e sesso per il modello in corso di valutazione; 2) ottimizzare la consegna PAMP ai polmoni; 3) raccogliere ed elaborare correttamente il BALF; e 4) correttamente correggere e preparare i polmoni per le valutazioni istopatologiche. La scelta del ceppo di topo è un fattore importante per la valutazione della risposta immunitaria dell&#39;osp...

Infezioni polmonari associate a batteri patogeni specie sono una causa comune di morbilità e mortalità a livello mondiale. Determinare i meccanismi che guidano la risposta immunitaria a questi agenti patogeni promuoverà lo sviluppo di strategie di prevenzione e nuovi agenti terapeutici che attenuare l&#39;impatto di queste infezioni. L&#39;obiettivo generale del protocollo qui descritto è di fornire all&#39;utente un metodo flessibile per valutare l&#39;host risposta immunitaria innata all&#39;infezione patogeno utilizzando un modello patogeno associato molecolare (PAMP) come surrogato batteri vivi. La maggior parte degli studi precedenti che valutano l&#39;host innata risposta immunitaria ai batteri si sono concentrati su modelli peritoneali causa della relativa facilità di esecuzione. Anche se questi modelli sono molto utili e hanno portato a significativi progressi nel campo delle interazioni ospite-patogeno e infiammazione sistemica, i dati generati da questi modelli non sono sempre appropriati per gli studi involving il sistema respiratorio. Qui, un modello polmonare di infiammazione polmonare acuta si propone come un ampliamento pratico e clinicamente rilevante delle intraperitoneale (ip) modelli ad iniezione classici. La tecnica proposta consente la valutazione locale della risposta immunitaria innata in un sistema modello specifico organo. I metodi qui descritti sono progettati per fornire una tecnica semplice e robusto per consentire agli utenti di valutare la risposta immunitaria a LPS, che è un PAMP comune. I metodi sono basati su endotracheale (it) instillazione di LPS, che induce una risposta immunitaria innata robusto nei polmoni dei topi e imita molte delle caratteristiche fisiopatologiche osservate in pazienti umani affetti da infezioni respiratorie e danno polmonare acuto 1. Un vantaggio principale di questa tecnica è che permette all&#39;utente di valutare la risposta immunitaria senza i fattori di confusione e problemi di sicurezza associati alla realizzazione di studi in vivoutilizzando batteri vivi. Allo stesso modo, la via orofaringea che la somministrazione di esposizione descritto in questo protocollo ha vantaggi significativi rispetto ad altre tecniche comunemente utilizzate, tra cui intranasale (in) amministrazione e l&#39;amministrazione è chirurgica. Ad esempio, la somministrazione è orofaringea permette dosaggio in vasca relativamente accurato e deposizione polmonare rispetto al somministrazione, che soffre tipicamente da una maggiore variabilità di deposizione polmonare dovuta alla perdita di agenti nella cavità nasale e dei seni 2-4. L&#39;instradamento somministrazione elude queste cavità e consente l&#39;accesso diretto alla trachea e vie aeree. Allo stesso modo, l&#39;approccio chirurgico si tratta di un metodo di gestione molto più morboso e richiede una formazione da padroneggiare. I protocolli descritti qui includono anche una descrizione delle tecniche più comuni e marcatori surrogati utilizzati per valutare la progressione infiammazione e terminare con un protocollo che descrive le tecniche adeguate per la preparazione del luNGS per la valutazione istopatologica. Questi protocolli sono focalizzati sulla riduzione del numero di topi richiesti per ciascuno studio massimizzando i dati generati da ogni singolo animale. I protocolli descritti sono estremamente flessibili e possono essere facilmente modificati per valutare una diversa PAMPs gamma e modelli molecolari di danno associato (smorza). Inoltre, con alcune modifiche supplementari, questi protocolli possono essere applicati anche a studi che hanno valutato la progressione della malattia delle vie respiratorie allergiche o interazioni ospite-patogeno con batteri vivi, virus o funghi 5-10.

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Stock 000664</td><td></td></tr><tr><td>Scala compatta</td><td>Ohaus Scale Corporation</td><td>71142845</td><td></td></tr><tr><td>Termometro rettale per piccoli animali</td><td>Braintree Scientific</td><td>TH 5</td><td></td></tr><tr><td>Sonda rettale per roditori</td><td>Braintree Scientific</td><td>RET 3</td><td></td></tr><tr><td>Ear Punch</td><td>Braintree Scientific</td><td>EP-S 901</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisaccaride da E. coli 0111:B4</td><td>InvivoGen</td><td>LPS-EB</td><td></td></tr><tr><td>1x soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>40032609</td><td></td></tr><tr><td>Somministrazione intratracheale e supporto per gonfiaggio polmonare</td><td>ICAP Produzione</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per intubazione per roditori</td><td>Braintree Scientific</td><td>Forbici RIS 100</td><td></td></tr><tr><td>(smussate/affilate)</td><td>Pinze Fisher Scientific</td><td>13-806-2</td><td></td></tr><tr><td>(diritte)</td><td>Pinze Fisher Scientific</td><td>22-327-379</td><td></td></tr><tr><td>(45&ordm;, curve)</td><td>Forbici Fisher Scientific</td><td>10-275</td><td></td></tr><tr><td>(smussate/smussate)</td><td>Pipette Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>(200 &; l Capacità)</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>BD Medical</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 ml</td><td>BD Medical</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 0,5 pollici Ago</td><td>BD Medical</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga refrigerata</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>Cannule tracheali da 1,2 mm con adattatore Luer</td><td>Harvard Apparatus</td><td>732836</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt</td> Solution <td>Life Technologies</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Sutura chirurgica intrecciata in seta</td><td>Ethicon</td><td>A183</td><td></td></tr><tr><td>Luer to Tube Connector Kit</td><td>Harvard Apparatus</td><td>721406</td><td></td></tr><tr><td>Luer Stopcock</td><td>Kit Harvard Apparatus</td><td>721664</td><td></td></tr><tr><td>Formula di Tygon E-3603 Tubo da laboratorio</td><td>Sigma</td><td>R-3603</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formalina, tampone neutro, 10%</td> <td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-1&beta; Kit ELISA OptEIA</td><td>BD Biosciences</td><td>559603</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-6 Kit ELISA OptEIA</td><td>BD Biosciences</td><td>550950</td><td></td></tr><tr><td>Topo TNF-&alpha; Kit ELISA OptEIA</td><td>BD Biosciences</td><td>560478</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Hausser Scientific</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro Occhiali di copertura</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-021-801</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3008401</td><td></td></tr><tr><td>Clip per imbuto per citologia</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td></td></tr><tr><td>Imbuti per citologia</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-354</td><td></td></tr><tr><td>Schede filtro</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-030-410</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>Occhiali di copertura</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin Citocentrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Diff Kit di colorazione rapida</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>47733150</tr><tr><td>Supporto di montaggio Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;utilizzo di orofaringea intratracheale pamp amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi host

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

La risposta immunitaria agli agenti patogeni è un processo biologico complesso. La maggior parte degli studi in vivo impiegato classico per caratterizzare le interazioni ospite-patogeno approfittano di iniezioni intraperitoneali di selezionare batteri o modelli molecolari patogeni associati (PAMPs) nei topi. Anche se queste tecniche hanno prodotto dati enormi associati con infettiva patobiologia malattia, modelli iniezione intraperitoneale non sono sempre appropriati per studi di interazione ospite-patogeno nel polmone. Utilizzando un polmone modello infiammazione acuta nel topo, è possibile condurre una analisi ad alta risoluzione della risposta immunitaria innata utilizzando lipopolisaccaride (LPS). Qui, descriviamo i metodi per amministrare LPS utilizzando chirurgico orofaringea somministrazione endotracheale, monitorare i parametri clinici associati alla patogenesi della malattia, e utilizzare liquido di lavaggio broncoalveolare di valutare la risposta immunitaria dell&#39;ospite. Le tecniche descrittesono ampiamente applicabile per studiare l&#39;host innata risposta immunitaria ad una gamma diversificata di PAMPs e patogeni. Analogamente, con piccole modifiche, queste tecniche possono essere applicate anche in studi che valutano allergica infiammazione delle vie aeree e nelle applicazioni farmacologiche.

Le pareti cellulari di batteri gram-negativi sono composti da LPS, che è molto abbondante nell&#39;ambiente. L&#39;inalazione di LPS in popolazioni umane sensibili aggrava reattività delle vie aeree ed è capace di innescare un response11 immunitaria robusta. LPS è anche un PAMP comune utilizzato in modelli murini per suscitare una risposta immunitaria innata robusta. Nel protocollo qui descritto, i topi hanno ricevuto una dose di LPS è isolato da E. coli (sierotipo 0111: B4) utilizzando l&#39;amministrazione si...

La risposta immunitaria dell&#39;ospite all&#39;infezione patogeno è un processo strettamente regolata. Utilizzando un polmone modello di esposizione lipopolisaccaride nei topi, è possibile effettuare valutazioni ad alta risoluzione dei complessi meccanismi associati alla patogenesi della malattia.

L&#39;utilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è dimostrare l'utilizzo dell'amministrazione orofaringea intratracheale di LPS e della lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria dell'ospite nei topi. Questo viene ottenuto innanzitutto inoculando il topo con LPS mediante somministrazione orofaringea. Nel secondo passaggio, viene inserito un cannula tracheale e il liquido di lavaggio broncoalveolare viene quindi raccolto attraverso la cannula per valutare la risposta infiammatoria locale.Nell'ultimo passaggio, i polmoni vengono gonfiati con formalina per la valutazione istopatologica. Infine, il profilo delle citochine dell'intestino e l'istopatologia del polmone possono essere analizzati per valutare la risposta immunitaria dell'ospite all'LPS. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'amministrazione intranasale e l'amministrazione intratracheale chirurgica, è che questa tecnica è relativamente semplice da eseguire e consente un dosaggio preciso e un deposito polmonare accurato.Per somministrare per via intratracheale, iniettare prima il LPS. Sospendere un topo anestetizzato su un dispositivo per intubazione. Posizionarsi davanti ai suoi incisivi, assicurandosi che l'animale sia saldamente immobilizzato e che bocca e lingua siano accessibili.Fissare delicatamente la lingua con pinze dritte, quindi afferrare la lingua con pinze angolate ed estrarre dolcemente il muscolo dalla bocca fino a percepire una leggera resistenza mentre si tiene la lingua. In questa posizione, somministrare una dose di 50 microlitri di LPS nella parte posteriore della gola e coprire immediatamente le narici dell'animale con un dito guantato per cinque-dieci respiri per raccogliere il liquido dopo il sacrificio. Successivamente, effettuare un'incisione orizzontale lungo tutta la cavità peritoneale e un'incisione verticale dalla cavità peritoneale fino alla mandibola del topo.Quindi afferrare entrambi i lati dell'incisione con la pinza ed estrarre delicatamente la pelle dalle cavità peritoneale e toracica sottostanti. Successivamente, praticare un'ampia incisione lungo tutta la cavità peritoneale, dai genitali fino allo sterno, avendo cura di non tagliare il diaframma. Poi spostare delicatamente l'intestino all'interno della cavità peritoneale per consentire l'accesso a uno dei reni.Tagliare la vena renale che porta al rene, in modo da utilizzarla come punto di drenaggio per la perfusione. Quindi effettuare un'incisione nel diaframma con le forbici, avendo cura di evitare polmoni e cuore. Per esporre il lato sinistro del cuore, utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago da 27 gauge per eseguire manualmente la perfusione del cuore con PBS.Il sangue residuo dovrebbe defluire dall'incisione della vena porta. Quindi utilizzare forbici ottuse per tagliare con attenzione la gabbia toracica lungo lo sterno, avendo cura di non danneggiare il cuore e i polmoni.Isolare delicatamente il cuore e i polmoni, quindi tagliare con cura ogni sezione della gabbia toracica usando forbici smussate il più vicino possibile alla spina dorsale. Dopo aver completamente rimosso entrambe le sezioni delle costole, separare le ghiandole salivari per esporre la trachea e tagliare con attenzione i muscoli sovrastanti la trachea senza recidere la trachea stessa. A questo punto, separare la clavicola e afferrare delicatamente il timo, sollevandolo dal cuore.Quindi rimuovere il timo con le forbici, avendo cura di non tagliare il cuore o i polmoni. Successivamente, utilizzare forbici angolate e affilate per praticare un'incisione orizzontale piccola, ma sufficientemente ampia da fissare saldamente una cannula nella trachea, uno o due anelli sotto la laringe. Inserire quindi una cannula in modo che l'estremità conica si estenda su due o tre anelli tracheali.Sotto l'incisione, passare un punto di sutura in seta tra la trachea e l'esofago, tirando il filo stretto sulla cannula per fissarla. Quindi riempire una siringa da un millilitro con HBSS ed inserire delicatamente l'ago della siringa nella cannula, utilizzando un movimento lento ma costante. Successivamente, iniettare circa 900 microlitri di HBSS nella trachea per gonfiare i polmoni, quindi immediatamente ritirare l'HBSS e trasferire il liquido recuperato in un tubo conico da 15 millilitri.Dopo aver ripetuto il lavaggio altre due volte per raccogliere circa tre millilitri di valvola, conservare la valvola su ghiaccio per dissezionare i polmoni. Per l'analisi istopatologica, inserire una siringa da 10 millilitri in un supporto per gonfiare il polmone e collegare il tubicino alla siringa, la siringa al rubinetto di chiusura e il rubinetto di chiusura alla siringa; verificare che il rubinetto di chiusura sia in posizione chiusa, quindi riempire la siringa con soluzione di formalina neutra tampone. Quando la siringa è completamente riempita con il fissativo, posizionare un panno assorbente sotto l’estremità libera del tubicino e aprire il rubinetto di chiusura per permettere al fissativo di riempire il tubicino.Una volta che il fissativo inizia a fluire dal tubo, chiudere immediatamente il rubinetto e riempire nuovamente la siringa fino all'orlo con il fissativo. Quindi passare delicatamente un secondo pezzo di filo di sutura sotto la trachea, approssimativamente di uno o due anelli tracheali, al di sotto dell'estremità della cannula. Fare un nodo semplice e allentato con il filo di sutura e quindi inserire il tubo per l'insufflazione del mouse.Posizionarsi nel cannula. Aprire il rubinetto a tre vie e lasciare che i polmoni si riempiano per inflazione gravitazionale. Una volta che i polmoni hanno raggiunto il livello massimo di inflazione, stringere il punto di sutura e fare un secondo nodo.Chiudere il rubinetto a chiusura rapida e rimuovere il tubo dalla cannula, quindi afferrare il punto di sutura con una pinzetta. Tirare con fermezza il filo di sutura verso la cavità toracica e contemporaneamente estrarre delicatamente la cannula in direzione del naso del topo per rimuoverla. Successivamente, sollevare delicatamente la trachea dalla cavità del collo e utilizzare forbici ottuse per recidere la trachea vicino al nodo del filo di sutura.Una volta liberata la trachea dai tessuti sottostanti, iniziare a staccarla dal corpo del topo e sollevare delicatamente i polmoni dalla cavità toracica. Quindi, tagliare con attenzione il tessuto connettivo che trattiene i polmoni all'interno della cavità toracica esercitando una forza costante verso l'alto, continuando a tirare la trachea lontano dal corpo del topo, avendo cura di non recidere i polmoni. Infine, fissare i polmoni in 10 millilitri di formalina tamponata.In modelli di esposizione a LPS, sia la temperatura corporea che il peso, i nostri marcatori surrogati tipici della morbilità animale e della progressione della malattia, mostrano che la sfida con LPS provoca una diminuzione significativa della temperatura corporea entro le prime sei ore, come illustrato nel grafico, che aumenta gradualmente fino a tornare ai livelli basali nell'arco di 24 ore. Il peso corporeo, invece, diminuisce costantemente nell'arco di 24 ore, raggiungendo un picco e riprendendosi gradualmente nelle successive 48-72 ore. Pertanto, la temperatura corporea rappresenta un marcatore più appropriato per valutare le fasi iniziali dell'insorgenza dell'infiammazione.Sebbene il peso corporeo sia un parametro più affidabile nelle fasi successive della patogenesi e del recupero, l'esposizione delle vie aeree all'LPS provoca un significativo afflusso di leucociti. Nelle prime sei ore, le cellule associate alla risposta immunitaria innata dell'ospite possono essere osservate nella valvola. La cellularità continua quindi ad aumentare nelle successive 24-48 ore, quando la risposta immunitaria raggiunge il picco e successivamente entra in una fase di risoluzione dell'infiammazione. Entro 24 ore, un numero significativo di neutrofili è presente nei polmoni e può essere osservato nella valvola dopo colorazione differenziale.Le valutazioni della cellularità valvolare forniscono una tecnica robusta e quantificabile per caratterizzare le cellule associate alla risposta immunitaria dell'ospite nei polmoni. Questo aumento è coerente con un afflusso significativo di neutrofili nelle vie aeree, nei vasi sanguigni e nel parenchima polmonare. L'istopatologia polmonare può essere efficacemente valutata mediante un sistema di punteggio semi-quantitativo, come osservabile nell'immagine.LPS induce un significativo aumento dell'infiammazione perivascolare, peribronchiolare e parenchimatosa. L'amministrazione di LPS induce alti livelli di mediatori pro-infiammatori locali e sistemici, inclusi diversi citochine associate alla risposta immunitaria innata, come rilevato mediante ELISA. Citochine comunemente sovraespressi nei polmoni dopo l'amministrazione di LPS includono TNF-α, IL-1β e IL-6. I livelli sistemici di citochine possono essere valutati anche nel siero, utilizzando le stesse tecniche dimostrate per le valutazioni intestinali.Il metodo di fissazione per spostamento gravitazionale favorisce condizioni ottimali per la valutazione istopatologica rispetto ai polmoni non insufflati o ai polmoni insufflati manualmente e fissati per gravità. L'insufflazione dimostra caratteristiche uniformi, consentendo una valutazione precisa, una riduzione del danno alveolare, una migliore visualizzazione e valutazioni ad alta risoluzione dell'infiammazione; al contrario, l'insufflazione manuale dei polmoni determina tipicamente aree di insufflazione non uniformi. Queste aree sono spesso parzialmente insufflate, con conseguente collasso del tessuto che viene comunemente scambiato per caratteristiche patologiche da parte di valutatori inesperti.L'insufflazione manuale provoca anche aree dei polmoni che sono sovraespansi, causando spazi alveolari gravemente danneggiati. I polmoni non insufflati mostrano spazi alveolari collassati e aree difficili da risolvere e valutare senza un addestramento approfondito. Analogamente, a causa del collasso dell'organo, questa tecnica non consente la visualizzazione dei polmoni così come appaiono in situ.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indurre e valutare l'infiammazione polmonare acuta mediata da LPS nei topi, utilizzando una semplice procedura non chirurgica di somministrazione orofaringea e tracheale e il prelievo dei tessuti.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Ripetute misurazioni della fisiologia respiratoria e roditori di campionamento di cellule infiammatorie delle vie aeree sono auspicabili, ma generalmente non realizzabili. Qui si descrive un metodo ripetibile per l'intubazione per via orale nei topi che permette misurazioni ripetute di iperreattività delle vie aeree e il campionamento di cellule infiammatorie delle vie aeree.

Un reversibile, metodo non invasivo per le misure di resistenza delle vie aeree e liquido di lavaggio broncoalveolare di campionamento nei topi

Illustriamo non chirurgica consegna dei materiali di prova nei polmoni di topi anestetizzati attraverso la trachea. Questo metodo permette l'esposizione dei polmoni a patogeni batterici e virali, citochine, anticorpi, perline, prodotti chimici o coloranti. Approfondiremo la raccolta ed elaborazione dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante (LDLNs) per la citometria a flusso.

Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

Abbiamo sviluppato un metodo semplice, affidabile e relativamente poco costoso per l'intubazione endotracheale nei topi mediante laringoscopia diretta con un otoscopio con un speculum 2,0 millimetri. Questa tecnica è atraumatica e può essere utilizzato per misurazioni ripetute in esperimenti cronici. Troviamo superiore a tracheostomia o riportato in precedenza tecniche non chirurgiche.

Intubazione endotracheale in Mouse<em&gt; Via</em&gt; Laringoscopia diretta usando un otoscopio

Intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione di reagenti è un eccellente metodo non invasivo per lo studio di malattie respiratorie, come pure un metodo per instillare reagenti terapeutici direttamente nel polmone. Si tratta di un metodo rapido e altamente riproducibile che è adatto per la prova preclinica.

Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio

Mentre lo studio in vitro delle interazioni ospite-patogeno consente la caratterizzazione di specifiche risposte immunitarie, sono necessari modelli in vivo per osservare gli effetti di risposte complesse. Utilizzando l'esposizione a Candida albicans seguita da un'infezione polmonare mediata da Pseudomonas aeruginosa, abbiamo stabilito un modello murino di interazioni microbiche coinvolte nella patogenicità della polmonite associata al ventilatore.

Studiare comunità microbiche<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di interazione ospite-mediata tra<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nei Airways

Dimostriamo la procedura per l'inoculazione intra-tracheale di Haemophilus influenzae nel tratto respiratorio inferiore dei topi. Questo è uno strumento molto utile per studiare le vie di segnalazione che regolano l'infiammazione delle vie aeree nei modelli murini.

Intra-tracheale Amministrazione<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In modelli murini per studiare infiammazione delle vie aeree

Descriviamo in dettaglio la metodologia seguita per confrontare l'efficacia protettiva e la risposta immunitaria polmonare indotta dall'immunizzazione intranasale e sottocutanea con BCG nel modello murino. I nostri risultati mostrano i benefici della vaccinazione polmonare e suggeriscono un ruolo della risposta mediata da IL17 nella protezione indotta dal vaccino.

L&#39;efficacia e la protezione polmonare risposta immunitaria seguito sottocutanea e intranasale BCG Amministrazione nei topi

Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per modellare la polmonite batterica nei topi. Qui, descriviamo un non invasivo, economico, rapido metodo per indurre la polmonite tramite aspirazione (vale a dire, l'inalazione) di un inoculo batterico pipettati in orofaringe. metodi di valle per la valutazione della risposta immunitaria innata polmonare sono anche dettagliata.

Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l&#39;induzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi

Lo stato di salute del polmone si riflette il tipo e il numero di cellule immunitarie che sono presenti nei bronchioli dei polmoni. Descriviamo una tecnica di lavaggio broncoalveolare che consente di isolare e studio delle cellule non aderenti e fattori solubili dal tratto respiratorio inferiore dei topi.

Lavaggio broncoalveolare murini di polmoni per analizzare infiammatoria infiltrazione cellulare

Qui presentiamo un elegante protocollo per la valutazione in vivo di vaccino efficacia e host le risposte immunitarie. Questo protocollo può essere adattato per i modelli di vaccino che studiano virale, batterica o parassitari patogeni.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Qui, proponiamo un protocollo per la somministrazione di lipopolisaccaridi intratracheali (LPS) tramite intubazione endotracheale orofaringea non invasiva. Questo metodo riduce al minimo il trauma della procedura chirurgica per l'animale e fornisce accuratamente LPS alla trachea e quindi ai polmoni.

Instillazione di lipopolisaccaridi intratracheali non invasivi nei topi

Scopri come valutare la risposta immunitaria nei topi mediante somministrazione orofaringea di LPS e lavaggio broncoalveolare. Questa tecnica permette analisi accurate delle risposte infiammatorie polmonari.

Lutilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host (Video) | JoVE Journal

L'utilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host

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