Trascrizione e metabolita Profiling per la valutazione del Tabacco Albero e pioppo come materia prima per l'industria con sede a Bio

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire e ottimizzare i dati di sequenziamento dei metaboliti e dell'RNA dal materiale fogliare degli alberi di tabacco per stime orientate alla biologia dei sistemi. Ciò si ottiene raccogliendo prima il materiale biologico di una serie di foglie in via di sviluppo. La seconda fase consiste nell'eseguire l'estrazione del materiale utilizzando i solventi appropriati in funzione dell'analisi successiva.

Successivamente, i metaboliti e gli idrocarburi vengono misurati mediante gascromatografia, spettrometria di massa o GCMS e i trascritti vengono analizzati utilizzando l'acquisizione di dati di sequenziamento dell'RNA. In definitiva, la combinazione di profilazione dei metaboliti e profilazione trascrizionale tramite sequenziamento dell'RNA viene utilizzata per mostrare come le foglie degli alberi di tabacco sviluppino idrocarburi a catena lunga e altri composti importanti. Questo metodo può essere utilizzato per identificare e quantificare importanti metaboliti utili prodotti nelle foglie dell'albero del tabacco.

Anche se questo metodo può fornire informazioni sul metaboloma dell'albero del tabacco. Può essere utilizzato anche per altri sistemi come il tabacco o specie affini. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché le foglie dell'albero del tabacco sono difficili da estrarre un buon RNA.

In questo video multi Bioo PRO, vedrai i membri del gruppo FERNA estrarre e profilare metabolizzare. Utilizzando GCMS, vedrai anche un membro del gruppo Fraser estrarre idrocarburi e anche un membro del mio gruppo che estrarrà l'RNA per il sequenziamento dell'RNA Inizia coltivando piante di neko Oceana Glauca in vasi di 30 centimetri di diametro contenenti M due substrati di coltivazione professionali come dettagliato nel protocollo di testo per preparare i metaboliti primari, Raccogliere le foglie e gli steli della pianta e congelare il materiale immediatamente liofilizzare i materiali vegetali congelati mediante liofilizzazione per tre giorni, quindi macinare i campioni liofilizzati mediante mulino a miscelatore con sfere di metallo, aliquotare i materiali secchi macinati fini risultanti in una provetta da centrifuga da due millilitri o in una fiala di vetro. Successivamente, aliquotare 10 milligrammi di foglia o 20 milligrammi di materiale vegetale secco macinato a stelo in tubi a fondo tondo con tappo a vite da due millilitri.

Aggiungere 1,4 millilitri di metanolo al 100% e agitare per 10 secondi. Quindi aggiungere 60 microlitri di atol rib come standard quantitativo interno prima del vortex. Per altri 10 secondi, aggiungere una sfera in acciaio inossidabile e omogeneizzare il materiale con un vibromulino per due minuti a 25 hertz dopo la centrifugazione per 10 minuti.

A 11.000 volte la gravità, trasferire il surnatante in una fiala di vetro. Aggiungere 750 microlitri di cloroformio e 1,5 millilitri di acqua prima di far girare la miscela per 10 secondi. Quindi trasferire 150 microlitri dalla fase superiore in una provetta da centrifuga fresca da 1,5 millilitri.

Quindi, asciugare i campioni utilizzando uno speed vac. È imperativo che i campioni siano ridotti a secco per un periodo compreso tra tre e 24 ore fino a quando non è presente alcun liquido residuo. Una volta asciutto, aggiungere 40 microlitri di metina cloridrato.

Quindi agitare la miscela in uno shaker orizzontale per due ore a 37 gradi Celsius. Aggiungere 70 microlitri di miscela M-S-T-F-A prima di agitare nuovamente per due ore a 37 gradi Celsius. Centrifugare le gocce sul coperchio con una breve centrifugazione prima di trasferire il liquido in fiale di vetro adatte all'analisi GC MS.

Seguendo GCMS, analizzare i dati configurando il software per l'analisi dei dati di spettrometria di massa e selezionando l'analisi dei dati da elaborare. Preparare una tabella dei picchi di interesse rilevati in base alla classe composta. Identificare i picchi mediante coalizione di composti standard, successivamente annotare i picchi rilevati utilizzando l'analisi della spettrometria di massa, gli algoritmi di caratterizzazione strutturale, l'indagine della letteratura e la ricerca nel database dei metaboliti per l'estrazione degli idrocarburi.

Immergere circa 200 milligrammi di foglie di ncoa glauco appena raccolte e insolventi per 2-20 minuti, rimuovere le foglie e asciugare completamente i solventi mediante evaporazione rotativa. Quindi risospendere i campioni in un millilitro di esano di grado HPLC. Procedere con l'esecuzione dell'analisi GCM dei campioni utilizzando i parametri descritti nel protocollo di testo.

Inizialmente elaborare i componenti del cromatogramma utilizzando un MS automatizzato. Sistema di deconvoluzione e identificazione e il NIST 98 MS. Biblioteca. Confermare l'identificazione degli idrocarburi saturi dell'acan a catena lunga confrontando i tempi di ritenzione e i modelli di frammentazione classici con gli standard autentici noti. Successivamente, determinare quantitativamente gli idrocarburi confrontando le aree di picco integrate con le curve dose-risposta.

Costruito da standard autentici, calcola le medie e l'errore standard delle medie utilizzando il software Excel. Questo protocollo combina l'estrazione dell'RNA TRIOL con un kit RN easy per ottenere una macinazione di RNA di alta qualità di 100 milligrammi di materiale vegetale congelato in provette da centrifuga da due millilitri con una sfera di metallo da un mulino miscelatore. Dopo l'omogeneizzazione del campione, aggiungere un millilitro di triolo dopo aver centrifugato il materiale per 10 minuti a 12.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius.

Trasferire il surnatante in una nuova provetta di reazione. Aggiungere 200 microlitri di cloroformio e capovolgere la provetta più volte prima di incubare per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo aver centrifugato la miscela per 15 minuti.

Come in precedenza, trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta di reazione. Aggiungere circa 2,5 volumi di etanolo. Capovolgere la provetta più volte e incubare per 30 minuti a meno 80 gradi Celsius.

Quindi, spostare il campione, compreso l'eventuale precipitato, in una colonna di rotazione. Centrifugare la colonna per 15 secondi a 8.000 volte la gravità e scartare il flusso attraverso. Aggiungere 700 microlitri di tampone di lavaggio RW one, fornito nel kit di estrazione, alla colonna di centrifuga e alla centrifuga.

Anche in questo caso, dopo aver scartato il flusso, aggiungere alla colonna di centrifuga 500 microlitri del secondo tampone di lavaggio, RPE fornito anche dal kit. Centrifugare nuovamente la colonna ed eliminare il flusso prima di aggiungere altro RPE tampone e centrifugare. Come prima, posizionare la colonna di centrifuga in una nuova provetta di reazione da 1,5 millilitri e aggiungere 50 microlitri di centrifuga ad acqua libera di RNA, la colonna per un minuto a 8.000 volte la gravità per eluire l'RNA.

Rimuovere il DNA residuo utilizzando un kit privo di DNA secondo le istruzioni del produttore. Come passaggio finale, determinare la qualità dell'RNA. L'RNA dovrebbe avere numeri di integrità dell'RNA superiori a otto prima di inviare l'RNA per il sequenziamento di nuova generazione.

Il profilo HPLC mostra un risultato rappresentativo dell'analisi isoprenoide degli estratti di foglie di ncoa glauca. I diversi ISOPRENOIDI di C 40 e superiori sono stati rilevati utilizzando un rivelatore a matrice di fotodiodi. I picchi sono stati annotati sulla base della cromatografia del codice e del confronto spettrale tra standard autentici.

I due cromatogrammi MS sono il risultato dell'analisi dei metaboliti primari di ncoa, foglia di glauco e materiale dello stelo. Viene anche fornito lo spettro MS di un picco corrispondente alla serina, come esempio, viene mostrato l'output rappresentativo del bioanalizzatore utilizzato per determinare la qualità dell'RNA. I due picchi principali nel cromatogramma corrispondono a 18 s e 25 s ribosomi, RNA che indica l'RNA intatto in questo campione.

Ulteriori picchi di RNA ribosomiale frammentato apparirebbero in caso di RNA parzialmente o fortemente degradato Una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita rapidamente ed è compatibile con l'analisi di altri metaboliti Seguendo questa procedura. Altri metodi, come la PCR in tempo reale, o altri metodi di analisi dell'RNA, possono essere utilizzati per rispondere a domande aggiuntive come la produzione di piccoli RNA o l'espressione di geni specifici.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'ottima comprensione su come estrarre e valutare i dati sui metaboliti dall'albero del tabacco.