Name: La misurazione simultanea di pH in endocitosi e citosoliche scomparti nelle cellule viventi usando Microscopia confocale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Scopri come misurare simultaneamente il pH vescicolare e citosolico nelle cellule viventi mediante microscopia confocale. Questo metodo utilizza sonde HPTS e SNF F1 per analizzare la dinamica del pH intracellulare.

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Ringraziamo il Dr. Gilles Dupuis per la lettura critica del manoscritto. 
Finanziamento
Questo lavoro è stato supportato dal Canadian Institutes for Health Research, grant # MOP-126173. C.M.D è membro del Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel, finanziato dal Fonds de la Recherche en Santé (FRSQ).

1. Preparazione di soluzioni per cellulare pH Calibrazione <ol><li> Aggiungere i seguenti composti da cinque tubi 50 ml coniche separati per preparare 5 soluzioni da utilizzare per la calibrazione: <ul><li> NaCl (1 ml di 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0,58 g in 10 ml di H 2 0) </li><li> KCl (6,75 ml di 1 M KCl) (1 M KCl = 0,75 g in 10 ml di H 2 0) </li><li> Glucosio (1 ml di 1 M D-glucosio) (1M D-Glucosio = 1,80 g in 10 ml di H 2 0) </li><li> MgS0 4 (0,05 ml di 1 M MgSO 4) (1 M MgSO 4 = 1,20 g in 10 ml di H 2 0) </li><li> HEPES 20 mM (1 ml di 1M HEPES) (1 M HEPES = 2,38 g in 10 ml di H 2 0) </li><li> CaCl 2 (0,05 ml di 1M CaCl 2) (1 M CaCl 2 = 1,47 g in 10 ml di H 2 0) Preparare tutte le soluzioni a doppia distillata H 2 O (DDH 2 O). </li></ul></li><li> Completare ogni soluzione con 35 ml di DDH 2 O e mescolare con un agitatore magnetico fino a tantoluzione è raggiunto. </li><li> Regolare il pH di ciascuna soluzione con 1 N KOH o 1 N HCl per ottenere valori di pH 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 e 7.5. Poi, regolare il volume con acqua deionizzata fino ad un volume finale di 50 ml. </li><li> Misura 5 mg di nigericin e aggiungerlo a 670 ml di EtOH assoluto per preparare un 10 mM nigericin soluzione stock. Attenzione: nigericin è altamente tossico e deve essere maneggiata con molta cura (guanti, occhiali di protezione e maschera). Miscelare la soluzione per inversione fino a quando il nigericin è completamente sciolto. </li><li> Aggiungere 0,05 ml di nigericin 10 mm (concentrazione finale 10 mM) ad ogni soluzione di taratura. Nigericina è uno ionoforo che aumenta la permeabilità della membrana cellulare e provoca equilibrazione di pH intracellulare ed extracellulare in presenza di una concentrazione depolarizzante di K + extracellulare. </li><li> Soluzioni di taratura possono essere memorizzati fino a 1 mese a 4 ° C </li></ol> 2. Preparazione cellulare <ol><li> Sotto un safet biologicoCappa y, cellule seme in 35 millimetri x 10 millimetri piatti di coltura in 2 ml di terreno di coltura supplementato con 10% di siero fetale bovino e antibiotici. Usare la quantità di cellule necessarie per garantire circa il 50% di confluenza dopo 24 ore. NOTA: Nei nostri esperimenti, usiamo la linea cellulare HT-1080 e la piastra 1 x 10 5 cellule per capsula di Petri. </li><li> Determinare il numero di piatti di coltura necessari per l&#39;esperimento e piastra 5 ulteriori piastre di coltura da utilizzare per la calibrazione. </li><li> Piatti di porre la cultura in un C 5% CO 2 incubatore 37 ° / per almeno 24 ore. </li></ol> 3. Preparazione di sonde pH-sensing <ol><li> Preparare una soluzione madre 1M della sonda pH fluorescente 8-idrossipirene-1, 3,6 acido trisolfonico, sale trisodico (HPTS / pyranine) in DDH 2 0. Questa soluzione deve essere conservato a temperatura ambiente e al riparo dalla luce. </li><li> Preparare una soluzione stock di 1 mM 5 - (e-6)-carbossilico seminaphthorhodafluor acetossimetilico estere acetato (C-SNARF-01:00; chiamato thereaopo SNARF-1) sciogliendo 1 mg di SNARF-1 in 1,76 ml di DMSO. Mescolare accuratamente pipettando ripetuta. SNARF-1 soluzione deve essere conservata a -20 ° C e al riparo dalla luce. </li></ol> 4. Etichettatura cellulare <ol><li> Sedici ore prima del live-cell imaging, aggiungere 2 ml di soluzione stock 1M HPTS (concentrazione finale 1 mm) per ogni piatto di coltura contenente 2 ml di terreno completo. </li><li> Riportare i piatti della cultura per l&#39;incubatore. La sonda HPTS è cell-impermeant, quindi etichetta organelli la sonda deve essere occupato da pinocitosi. Questa condizione richiede che incubazione delle cellule con HPTS vengono eseguite in medium siero supplementato cultura. </li><li> Dopo l&#39;incubazione con HPTS, lavare le cellule due volte con PBS sterile e aggiungere 2 ml di mezzo privo di siero per almeno 2 ore. Incubazione con SNARF-1 deve essere eseguita in terreno privo di siero perché siero può impedire l&#39;assorbimento della sonda. </li><li> Aggiungere 10 ml di un SNARF-1 soluzione stock 1 mm per ottenere afconcentrazione inale su 5 micron e consentono alle cellule di incubare per 20 min a 37 ° C, sotto la luce fioca. C-1-SNARF concentrazione e tempo di incubazione può variare a seconda del tipo cellulare. </li><li> Al termine dell&#39;incubazione, lavare le cellule due volte in PBS sterile e aggiungere 2 ml di mezzo privo di siero. </li></ol> 5. Aggiunta di pH modulatori <ol><li> Per valutare se il metodo può rilevare variazioni di pH nelle cellule, diversi reagenti che modulano pH intracellulare possono essere utilizzati: <ul><li> Bafilomycin A1, un inibitore specifico della V-ATPasi 5 </li><li> Na + / H + scambiatore isoforma 1 (NHE-1) 6 </li><li> NH 4 Cl, una base debole che aumenta intracellulare pH 7 </li></ul><ol><li> Preparare soluzioni madre dei reattivi di cui sopra: <ul><li> Bafilomycin A1: aggiungere 10 mg di bafilomycin A1 a 160 ml di DMSO per ottenere una soluzione stock di 100 micron </li><li> EIPA: aggiungere 25 mg di EIPA a 1.67 ml di metanolo per ottenuna concentrazione finale di 50 mM </li><li> NH 4 Cl: sciogliere 0,53 g di cloruro di ammonio in 10 ml di DDH 2 O per ottenere una concentrazione finale di 1 mM. </li></ul> Nota: Tutte le soluzioni di archivi devono essere conservati a 4 ° C ad eccezione di bafilomycin A1, che deve essere conservato a -20 ° C e al riparo dalla luce. </li><li> In piatti della cultura separati, aggiungere uno dei reagenti come descritto di seguito: <ul><li> 2 ml di 100 mM bafilomycin A1 (concentrazione finale 100 nm) </li><li> 1 ml di 50 mM EIPA (concentrazione finale 25 pm) </li><li> 40 ml di 1M NH 4 Cl (concentrazione finale 20 mM) </li></ul></li><li> Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C. </li></ol></li><li> Procedere alla acquisizione delle immagini. </li></ol> 6. Specifiche tecniche di imaging microscopio live-cell e impostazioni di acquisizione <ol><li> Eseguire live-cell imaging usando un obiettivo 40X montato su una spettrale invertito confocale a scansione microscope dotato di un palco XY motorizzato, una camera che ospita fondo di vetro piatti della cultura in un (temperatura, umidità, CO 2) fase di incubatore ambiente controllato. </li><li> Lo strumento confocale (Olympus FV1000) qui usato è dotato di: <ul><li> Un diodo laser 405 nm </li><li> Un laser ad argon 40 mW (458 nm, 488 nm, 515 nm) </li><li> Un laser elio neon (543 nm) </li><li> Obiettivo Fluorite 10X, NA0.4 </li><li> Un obiettivo LUCPLFLN 40X, NA0.60 </li><li> Un obiettivo olio PLAPONSC PIANO APO 60X, NA1.4 </li><li> Uno specchio dicroico DM 405/458/488/543 </li><li> Un SDM 560 e un SDM 640 filtri dicroici </li><li> Un filtro barriera BA655-755 </li><li> Un BS20/80 divisore di fascio </li><li> Software di analisi dei dati per acquisizione ed elaborazione, </li></ul></li><li> Una volta che l&#39;incubatore fase si è riscaldata fino a 37 ° C e il microscopio è istituito, mettere un piatto di coltura precedentemente incubate con HPTS e SNARF-1 nella camera di imaging fase confocale. </li><li> Laopo l&#39;individuazione di una zona di interesse, regolare le impostazioni di acquisizione del software Figura 1. <ul><li> Impostare due set di canali virtuali. </li><li> Avviare la prima fase che corrisponde al HPTS eccitazione a 405 nm e la raccolta emissione a 505-525 nm e SNARF-1 eccitazione a 543 nm e la raccolta emissione a 570-600 nm. </li><li> Avviare la seconda fase che corrisponde alla HPTS eccitazione a 458 nm e la raccolta emissione a 505-525 nm e SNARF-1 eccitazione a 543 nm e la raccolta emissione a 640-650 nm. </li><li> L&#39;apertura confocale è impostato a 175 micron per default e apertura ottimale deve essere impostata manualmente a 300 micron. </li><li> Prendere Immagine impilando seriali sezioni ottiche orizzontali (800 x 800 pixel) da 0,4 micron di spessore. </li></ul></li></ol> NOTA: Un obiettivo 40X è utile osservare più celle contemporaneamente e funziona bene per la visualizzazione organello. Tuttavia, la risoluzione spaziale e l&#39;intensità del segnale sono better ottenuto utilizzando un obiettivo 60X olio. Inoltre, non c&#39;è eccitazione o di emissione di diafonia tra i due coloranti. 7. Taratura delle sonde di pH-sensing <ol><li> Prima della taratura, rimuovere terreno dalla piastra di coltura precedentemente incubate con HPTS e SNARF-1, lavare due volte con PBS sterile e poi aggiungere 2 ml di una delle cinque soluzioni di taratura. </li><li> Posizionare il piatto cultura nella camera di fase confocale. </li><li> Procedere al time-lapse acquisizione delle immagini secondo le seguenti impostazioni: <ol><li> Impostare il numero di immagini e tempi di durata degli intervalli per l&#39;esperimento. NOTA: Usiamo tipicamente un intervallo di 1 minuto tra le immagini fino a 30 min. </li><li> Programmare l&#39;otturatore per chiudere tra l&#39;acquisizione di ogni immagine. </li></ol></li><li> Registrare l&#39;intensità di fluorescenza per min in un foglio elettronico e determinare il momento in cui l&#39;intensità di fluorescenza è costante. PH intracellulare è generalmente stabile dopo 15 - 20 min. </li><li> Ripetere passaggi 7,1-7,4 utilizzando un nuovo piatto di coltura per ogni soluzione di calibrazione rimanente. </li></ol> 8. Acquisizione dati <ol><li> Una volta che la calibrazione è stato fatto, acquisire dati di esempio 4-5 campi scelti a caso contengono 15-20 cellule per campo. Due immagini sono ottenute per ciascun campo: uno per l&#39;etichettatura HPTS (vescicole) e il secondo per SNARF-1 etichettatura (citosol). </li><li> Fluorescenza di fondo (zona extracellulare) viene digitalmente sottratto dalle immagini fluorescenti di entrambe le sonde. Vescicole etichettati e citoplasma dei rispettivi immagini memorizzate sono state selezionate usando una maschera binaria. Per ogni sonda pH-sensing, intensità di fluorescenza sono misurati su una scala numerica (0-4,095 scala di livelli di grigio). Una intensità medio per tutti i pixel del organello o citoplasma è calcolato ei valori vengono utilizzati per calcolare i rapporti di fluorescenza. </li></ol> 9. Analisi dei dati <ol><li> I vari pacchetti software sono disponibili in commercio per l&#39;analisi dei dati. EsempioFluoView Software. </li><li> In un foglio di calcolo, i valori dei record e calcolare rapporti di fluorescenza come segue: Nel caso di HPTS, R = (F 458 nm / F 405 nm) e, nel caso di SNARF-1, R = (F 644 nm / F 584 nm ). </li><li> Tracciare i dati utilizzando software grafici scientifici come GraphPad Prism. La trama dovrebbe ritrarre rapporti di fluorescenza (asse y) in funzione del pH (asse X). Curva di raccordo è realizzato utilizzando la regressione non lineare. </li><li> Raccogliere intensità di fluorescenza dei campioni come descritto al punto 8.2 e calcolare rapporti di fluorescenza. Usare curve di calibrazione per trasformare i rapporti in valori di pH. </li></ol>

<ol><li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+Homeostasis+of+cellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">pH Homeostasis of cellular organelles.</a> News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).</li>
<li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+pH%3A+a+perfect+storm+for+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).</li>
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<li>Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NHE1+inhibition+by+amiloride-+and+benzoylguanidine-type+compounds.+Inhibitor+binding+loci+deduced+from+chimeras+of+NHE1+homologues+with+endogenous+differences+in+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity.</a> J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).</li>
<li>Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-pH+crosstalks+in+rat+mast+cells%3A+cytosolic+alkalinization%2C+but+not+intracellular+calcium+release%2C+is+a+sufficient+signal+for+degranulation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation.</a> Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).</li>
<li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for intracellular pH.</a> Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Misura di pH quantitativa in live-cell imaging di diversi compartimenti cellulari è necessaria per misurare con precisione le variazioni di pH nelle risposte cellulari alle sfide esterne. Tuttavia, uno dei principali ostacoli che rimane è facile e specificamente i compartimenti cellulari. A questo proposito, alcuni studi hanno evidenziato l&#39;uso di HPTS come indicatore di pH intracellulare introdotto in cellule mediante elettroporazione o microiniezione 8-10. Queste tecniche soffrono di gravi inconvenienti...

<table><tbody><tr><td>Soluzioni per taratura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosio (destrosio)</td><td>Fischer</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Fischer</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Fischer</td><td>M-1612</td><td></td></tr><tr><td>Acqua deionizzata</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Calbiochem</td><td>481990</td><td>Tossico per inalazione o a contatto con la pelle</td></tr><tr><td colspan="4">Tenere al riparo dalla luce a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>Piastre di coltura e vuote; 35 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>354456</td><td></td></tr><tr><td>sonde</td><td></td><td></td><td></td>per il rilevamento del pH</tr><tr><td>Acido 8-idrossipirene-1,3,6-trisolfonico (HPTS)</td><td>Life technologies</td><td>H-348</td><td>Tenere lontano dalla luce a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>5-(e-6)-carbossi-carbossi SNARF&reg;-1, acetossimetilestere, acetato</td><td>Life technologies</td><td>C-1271</td><td>Tenere lontano dalla luce e dall'umidità a -20 gradi C</td></tr><tr><td>Dimetil Sufoxide (DMSO)</td><td>Fischer</td><td>BP231-1&nbsp;</td><td>nocivo</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 100X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico</td><td>Fischer</td><td>S369-1</td><td>115 g</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>J.T Baker</td><td>3246-01</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Acqua deionizzata</td><td>N/A</td><td>N/A Portare</td><td>in autoclave da 1 L</td></tr><tr><td>e regolare il pH a 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 100X</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td>40,5 g</td></tr><tr><td>Acqua deoinizzata</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Portare a 5 L</td></tr><tr><td>modulatori di</td><td></td><td></td><td></td>pH</tr><tr><td>Bafilomicina A1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1793</td><td></td></tr><tr><td>5-(N-Etil-N-isopropil)amiloride (EIPA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3085</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio</td><td>Fischer</td><td>A649-500</td><td></td></tr></tbody></table>

la misurazione simultanea di ph in endocitosi e citosoliche scomparti nelle cellule viventi usando microscopia confocale

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Il pH intracellulare è strettamente regolato e sono state riportate differenze di pH tra il citoplasma e gli organelli1. La regolazione del pH cellulare è fondamentale per il controllo omeostatico dei processi fisiologici che includono: sintesi di proteine, DNA e RNA, traffico vescicolare, crescita cellulare e divisione cellulare. Alterazioni dell'omeostasi del pH cellulare possono portare a cambiamenti funzionali dannosi e promuovere la progressione di varie malattie2. Sono disponibili vari metodi per misurare il pH intracellulare, ma pochissimi di questi consentono la misurazione simultanea del pH nel citoplasma e negli organelli. Qui, descriviamo in dettaglio un metodo rapido e accurato per la misurazione simultanea del pH citoplasmatico e organellare utilizzando la microscopia confocale su cellule viventi3. Questo obiettivo viene raggiunto con l'uso di due coloranti raziometrici sensibili al pH che possiedono una partizione selettiva del compartimento cellulare. Ad esempio, SNARF-1 è compartimentalizzato all'interno del citoplasma mentre HPTS è compartimentalizzato all'interno degli organelli endosomiali/lisosomiali. Sebbene l'HPTS sia comunemente usato come indicatore di pH citoplasmatico, questo colorante può marcare in modo specifico le vescicole lungo la via endosomiale-lisosomiale dopo essere stato assorbito dalla pinocitosi3,4. Utilizzando queste sonde sensibili al pH, è possibile misurare simultaneamente il pH all'interno dei compartimenti endocitico e citoplasmatico. La lunghezza d'onda di eccitazione ottimale dell'HPTS varia a seconda del pH mentre per SNARF-1 è la lunghezza d'onda di emissione ottimale che varia. Dopo il caricamento con SNARF-1 e HPTS, le cellule vengono coltivate in diverse soluzioni calibrate per il pH per costruire una curva standard di pH per ciascuna sonda. L'imaging cellulare mediante microscopia confocale consente l'eliminazione di artefatti e rumore di fondo. A causa delle proprietà spettrali dell'HPTS, questa sonda è più adatta per la misurazione del compartimento endosomiale leggermente acido o per dimostrare l'alcalinizzazione degli organelli endosomiali/lisosomiali. Questo metodo semplifica l'analisi dei dati, migliora l'accuratezza delle misure di pH e può essere utilizzato per affrontare le questioni fondamentali relative alla modulazione del pH durante le risposte delle celle a sfide esterne.

Per la misura simultanea di pH sia intracellulare e compartimenti cellulari endosomal / lisosomiali, sono stati usati i fluorescenti sonde pH-sensing raziometrici Snarf-1 e HPTS. SNARF-1 è limitata al compartimento citosolico che HPTS permette di misurare raziometrica pH del vano endosomale / lisosomiale. Carico delle cellule con HPTS per 16 ore permette la sua localizzazione selettiva negli endosomi / lisosomi 4. Un tipico esempio di fluorescenza registrata da cellule HT-1080 caricato con le sonde pH-sensibi...

Sono disponibili diversi metodi per misurare il pH intracellulare, ma pochissimi di questi permettono la misurazione simultanea del pH citoplasmatico e organellare. Qui, descriviamo in dettaglio una metodologia rapida e accurata per misurare simultaneamente il pH citoplasmatico e vescicolare mediante imaging raziometrico di cellule viventi.

La misurazione simultanea di pH in endocitosi e citosoliche scomparti nelle cellule viventi usando Microscopia confocale

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare simultaneamente il pH vescicolare e citosolico in cellule vive mediante microscopia confocale. Questo risultato si ottiene innanzitutto incubando le cellule con le sonde rivelatrici di pH, HPTS e SNF F1, che marciano rispettivamente i compartimenti endosomiali e lisosomiali e il citosol. Successivamente, le cellule vengono posizionate in una camera controllata ambientalmente sotto un microscopio confocale, e il software viene impostato per misurare la fluorescenza delle sonde all'interno della camera.Le cellule vengono incubate con diverse soluzioni calibrate per pH. Viene costruita una curva standard di pH utilizzando una regressione non lineare. Vengono determinate equazioni esponenziali per entrambe le sonde, che successivamente vengono utilizzate per convertire le intensità di fluorescenza dei campioni in valori di pH.Questo metodo permette la determinazione del pH vescicolare e citosolico da campioni sottoposti a diversi trattamenti e può consentire lo studio della regolazione del pH intracellulare durante processi biologici. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per la misurazione del pH

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Biologia

Il video dimostra la misurazione simultanea dei livelli intracellulari di calcio e delle variazioni del potenziale di membrana nelle cellule endoteliali dei segmenti dell'arteria cerebrale di topo. Il tubo endoteliale isolato viene caricato con un indicatore fluorescente di calcio e trattato con un farmaco che induce il rilascio intracellulare di calcio, con conseguente variazione del potenziale di membrana. La fluorescenza dell'indicatore consente la misurazione dei livelli di calcio e un...

Misurazione simultanea del calcio intracellulare e del potenziale di membrana in un endotelio cerebrale di topo

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Studio di fagolisosoma Biogenesis nei macrofagi in diretta

Il pH fagosomico influenza la maturazione dei fagosomi, la produzione di ossidanti, l'uccisione fagosomiale e la presentazione dell'antigene. Qui descriviamo un metodo raziometrico per misurare le variazioni di pH nel corso temporale e nel punto finale nei singoli fagosomi nei fagociti viventi utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Misurare phagosome pH Raziometrico microscopia a fluorescenza

Questo manoscritto descrive un metodo semplice per misurare il pH phagosomal e zona così come il pH citoplasmatico di neutrofili umani e di topo usando l'indicatore raziometrico seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, o S-1. Ciò si ottiene mediante live-cell microscopia confocale a fluorescenza e analisi di immagine.

Imaging dei neutrofili phagosome e nel citoplasma utilizzo di un indicatore di pH Raziometrico

I mitocondri possono utilizzare il potenziale elettrochimico attraverso la loro membrana interna (Δ Ψm) di sequestrare il calcio (Ca 2+), permettendo loro di modellare Ca citosolico 2 + Segnalazione all'interno della cellula. Descriviamo un metodo per misurare simultaneamente i mitocondri Ca 2+ di assorbimento e ΔΨ m in cellule vive con coloranti fluorescenti e microscopia confocale.

Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente

Etichettare il dominio extracellulare di una proteina di membrana con un fluoroforo sensibile pH, superecliptic pHluorin (SEP), permette la localizzazione subcellulare, espressione, e il traffico da determinare. proteine ​​Imaging SEP-etichettato con riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRFM) consente la quantificazione dei livelli di proteine ​​nella membrana ER e nel plasma periferico.

Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

Questo protocollo descrive un nuovo metodo che consente la visualizzazione quantitativa della formazione di complessi di proteine SNARE, basato sul trasferimento di energia per risonanza e la durata di fluorescenza imaging microscopia.

Visualizing intracellulare rullante traffico da fluorescenza Lifetime Imaging microscopia

Ha dimostrato qui sono protocolli per isolamento (1) appena endothelial cerebrali intatti "tubi" e misure (2) simultanee di calcio endoteliale e potenziale durante endotelio-derivato hyperpolarization della membrana. Inoltre, questi metodi consentono per la sintonizzazione farmacologico di calcio delle cellule endoteliali e segnali elettrici come variabili sperimentali individuali o interattive.

Misurazioni simultanee di calcio intracellulare e potenziale di membrana nell'endotelio cerebrale Mouse appena isolato ed intatto

Qui è presentato il protocollo della tecnica Conpokal, che combina microscopia a forza confocale e atomica in un'unica piattaforma di strumenti. Conpokal fornisce la stessa cellula, la stessa regione, vicino all'imaging confocale simultaneo e alla caratterizzazione meccanica di campioni biologici vivi.

Microscopia confocale e a forza atomica (Conpokal) quasi simultanea su cellule vive

Questo protocollo descrive una tecnica di imaging confocale per rilevare tre modalità di fusione nelle cellule cromaffini surrenali bovine. Queste modalità di fusione includono 1) fusione ravvicinata (chiamata anche kiss-and-run), che coinvolge l'apertura e la chiusura dei pori di fusione, 2) la fusione di soggiorno, che coinvolge l'apertura dei pori di fusione e il mantenimento del poro aperto, e 3) la fusione termoretraibile, che coinvolge il restringimento delle vescicole fuse.

Microscopia confocale per misurare tre modalità di dinamica dei pori di fusione nelle cellule cromaffini surrenali

Il protocollo descrive una piattaforma microfluidica avanzata per misurare quantitativamente le dinamiche di secrezione di citochine di singole cellule mononucleate del sangue periferico umano. La piattaforma misura fino a tre citochine in parallelo (IL-6, TNFα e IL-1β) per ogni singola cellula stimolata con lipopolisaccaride come esempio.

Approccio microfluidico per risolvere la secrezione simultanea e sequenziale di citochine di singole cellule polifunzionali 

Scopri come misurare simultaneamente il pH vescicolare e citosolico nelle cellule viventi mediante microscopia confocale. Questo metodo utilizza sonde HPTS e SNF F1 per analizzare la dinamica del pH intracellulare.

La misurazione simultanea di pH in endocitosi e citosoliche scomparti nelle cellule viventi usando Microscopia confocale

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