Name: La misurazione simultanea di pH in endocitosi e citosoliche scomparti nelle cellule viventi usando Microscopia confocale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Scopri come misurare simultaneamente il pH vescicolare e citosolico nelle cellule viventi mediante microscopia confocale. Questo metodo utilizza sonde HPTS e SNF F1 per analizzare la dinamica del pH intracellulare.

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Ringraziamo il Dr. Gilles Dupuis per la lettura critica del manoscritto. 
Finanziamento
Questo lavoro è stato supportato dal Canadian Institutes for Health Research, grant # MOP-126173. C.M.D è membro del Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel, finanziato dal Fonds de la Recherche en Santé (FRSQ).

1. Preparazione di soluzioni per cellulare pH Calibrazione <ol><li> Aggiungere i seguenti composti da cinque tubi 50 ml coniche separati per preparare 5 soluzioni da utilizzare per la calibrazione: <ul><li> NaCl (1 ml di 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0,58 g in 10 ml di H 2 0) </li><li> KCl (6,75 ml di 1 M KCl) (1 M KCl = 0,75 g in 10 ml di H 2 0) </li><li> Glucosio (1 ml di 1 M D-glucosio) (1M D-Glucosio = 1,80 g in 10 ml di H 2 0) </li><li> MgS0 4 (0,05 ml di 1 M MgSO 4) (1 M MgSO 4 = 1,20 g in 10 ml di H 2 0) </li><li> HEPES 20 mM (1 ml di 1M HEPES) (1 M HEPES = 2,38 g in 10 ml di H 2 0) </li><li> CaCl 2 (0,05 ml di 1M CaCl 2) (1 M CaCl 2 = 1,47 g in 10 ml di H 2 0) Preparare tutte le soluzioni a doppia distillata H 2 O (DDH 2 O). </li></ul></li><li> Completare ogni soluzione con 35 ml di DDH 2 O e mescolare con un agitatore magnetico fino a tantoluzione è raggiunto. </li><li> Regolare il pH di ciascuna soluzione con 1 N KOH o 1 N HCl per ottenere valori di pH 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 e 7.5. Poi, regolare il volume con acqua deionizzata fino ad un volume finale di 50 ml. </li><li> Misura 5 mg di nigericin e aggiungerlo a 670 ml di EtOH assoluto per preparare un 10 mM nigericin soluzione stock. Attenzione: nigericin è altamente tossico e deve essere maneggiata con molta cura (guanti, occhiali di protezione e maschera). Miscelare la soluzione per inversione fino a quando il nigericin è completamente sciolto. </li><li> Aggiungere 0,05 ml di nigericin 10 mm (concentrazione finale 10 mM) ad ogni soluzione di taratura. Nigericina è uno ionoforo che aumenta la permeabilità della membrana cellulare e provoca equilibrazione di pH intracellulare ed extracellulare in presenza di una concentrazione depolarizzante di K + extracellulare. </li><li> Soluzioni di taratura possono essere memorizzati fino a 1 mese a 4 ° C </li></ol> 2. Preparazione cellulare <ol><li> Sotto un safet biologicoCappa y, cellule seme in 35 millimetri x 10 millimetri piatti di coltura in 2 ml di terreno di coltura supplementato con 10% di siero fetale bovino e antibiotici. Usare la quantità di cellule necessarie per garantire circa il 50% di confluenza dopo 24 ore. NOTA: Nei nostri esperimenti, usiamo la linea cellulare HT-1080 e la piastra 1 x 10 5 cellule per capsula di Petri. </li><li> Determinare il numero di piatti di coltura necessari per l&#39;esperimento e piastra 5 ulteriori piastre di coltura da utilizzare per la calibrazione. </li><li> Piatti di porre la cultura in un C 5% CO 2 incubatore 37 ° / per almeno 24 ore. </li></ol> 3. Preparazione di sonde pH-sensing <ol><li> Preparare una soluzione madre 1M della sonda pH fluorescente 8-idrossipirene-1, 3,6 acido trisolfonico, sale trisodico (HPTS / pyranine) in DDH 2 0. Questa soluzione deve essere conservato a temperatura ambiente e al riparo dalla luce. </li><li> Preparare una soluzione stock di 1 mM 5 - (e-6)-carbossilico seminaphthorhodafluor acetossimetilico estere acetato (C-SNARF-01:00; chiamato thereaopo SNARF-1) sciogliendo 1 mg di SNARF-1 in 1,76 ml di DMSO. Mescolare accuratamente pipettando ripetuta. SNARF-1 soluzione deve essere conservata a -20 ° C e al riparo dalla luce. </li></ol> 4. Etichettatura cellulare <ol><li> Sedici ore prima del live-cell imaging, aggiungere 2 ml di soluzione stock 1M HPTS (concentrazione finale 1 mm) per ogni piatto di coltura contenente 2 ml di terreno completo. </li><li> Riportare i piatti della cultura per l&#39;incubatore. La sonda HPTS è cell-impermeant, quindi etichetta organelli la sonda deve essere occupato da pinocitosi. Questa condizione richiede che incubazione delle cellule con HPTS vengono eseguite in medium siero supplementato cultura. </li><li> Dopo l&#39;incubazione con HPTS, lavare le cellule due volte con PBS sterile e aggiungere 2 ml di mezzo privo di siero per almeno 2 ore. Incubazione con SNARF-1 deve essere eseguita in terreno privo di siero perché siero può impedire l&#39;assorbimento della sonda. </li><li> Aggiungere 10 ml di un SNARF-1 soluzione stock 1 mm per ottenere afconcentrazione inale su 5 micron e consentono alle cellule di incubare per 20 min a 37 ° C, sotto la luce fioca. C-1-SNARF concentrazione e tempo di incubazione può variare a seconda del tipo cellulare. </li><li> Al termine dell&#39;incubazione, lavare le cellule due volte in PBS sterile e aggiungere 2 ml di mezzo privo di siero. </li></ol> 5. Aggiunta di pH modulatori <ol><li> Per valutare se il metodo può rilevare variazioni di pH nelle cellule, diversi reagenti che modulano pH intracellulare possono essere utilizzati: <ul><li> Bafilomycin A1, un inibitore specifico della V-ATPasi 5 </li><li> Na + / H + scambiatore isoforma 1 (NHE-1) 6 </li><li> NH 4 Cl, una base debole che aumenta intracellulare pH 7 </li></ul><ol><li> Preparare soluzioni madre dei reattivi di cui sopra: <ul><li> Bafilomycin A1: aggiungere 10 mg di bafilomycin A1 a 160 ml di DMSO per ottenere una soluzione stock di 100 micron </li><li> EIPA: aggiungere 25 mg di EIPA a 1.67 ml di metanolo per ottenuna concentrazione finale di 50 mM </li><li> NH 4 Cl: sciogliere 0,53 g di cloruro di ammonio in 10 ml di DDH 2 O per ottenere una concentrazione finale di 1 mM. </li></ul> Nota: Tutte le soluzioni di archivi devono essere conservati a 4 ° C ad eccezione di bafilomycin A1, che deve essere conservato a -20 ° C e al riparo dalla luce. </li><li> In piatti della cultura separati, aggiungere uno dei reagenti come descritto di seguito: <ul><li> 2 ml di 100 mM bafilomycin A1 (concentrazione finale 100 nm) </li><li> 1 ml di 50 mM EIPA (concentrazione finale 25 pm) </li><li> 40 ml di 1M NH 4 Cl (concentrazione finale 20 mM) </li></ul></li><li> Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C. </li></ol></li><li> Procedere alla acquisizione delle immagini. </li></ol> 6. Specifiche tecniche di imaging microscopio live-cell e impostazioni di acquisizione <ol><li> Eseguire live-cell imaging usando un obiettivo 40X montato su una spettrale invertito confocale a scansione microscope dotato di un palco XY motorizzato, una camera che ospita fondo di vetro piatti della cultura in un (temperatura, umidità, CO 2) fase di incubatore ambiente controllato. </li><li> Lo strumento confocale (Olympus FV1000) qui usato è dotato di: <ul><li> Un diodo laser 405 nm </li><li> Un laser ad argon 40 mW (458 nm, 488 nm, 515 nm) </li><li> Un laser elio neon (543 nm) </li><li> Obiettivo Fluorite 10X, NA0.4 </li><li> Un obiettivo LUCPLFLN 40X, NA0.60 </li><li> Un obiettivo olio PLAPONSC PIANO APO 60X, NA1.4 </li><li> Uno specchio dicroico DM 405/458/488/543 </li><li> Un SDM 560 e un SDM 640 filtri dicroici </li><li> Un filtro barriera BA655-755 </li><li> Un BS20/80 divisore di fascio </li><li> Software di analisi dei dati per acquisizione ed elaborazione, </li></ul></li><li> Una volta che l&#39;incubatore fase si è riscaldata fino a 37 ° C e il microscopio è istituito, mettere un piatto di coltura precedentemente incubate con HPTS e SNARF-1 nella camera di imaging fase confocale. </li><li> Laopo l&#39;individuazione di una zona di interesse, regolare le impostazioni di acquisizione del software Figura 1. <ul><li> Impostare due set di canali virtuali. </li><li> Avviare la prima fase che corrisponde al HPTS eccitazione a 405 nm e la raccolta emissione a 505-525 nm e SNARF-1 eccitazione a 543 nm e la raccolta emissione a 570-600 nm. </li><li> Avviare la seconda fase che corrisponde alla HPTS eccitazione a 458 nm e la raccolta emissione a 505-525 nm e SNARF-1 eccitazione a 543 nm e la raccolta emissione a 640-650 nm. </li><li> L&#39;apertura confocale è impostato a 175 micron per default e apertura ottimale deve essere impostata manualmente a 300 micron. </li><li> Prendere Immagine impilando seriali sezioni ottiche orizzontali (800 x 800 pixel) da 0,4 micron di spessore. </li></ul></li></ol> NOTA: Un obiettivo 40X è utile osservare più celle contemporaneamente e funziona bene per la visualizzazione organello. Tuttavia, la risoluzione spaziale e l&#39;intensità del segnale sono better ottenuto utilizzando un obiettivo 60X olio. Inoltre, non c&#39;è eccitazione o di emissione di diafonia tra i due coloranti. 7. Taratura delle sonde di pH-sensing <ol><li> Prima della taratura, rimuovere terreno dalla piastra di coltura precedentemente incubate con HPTS e SNARF-1, lavare due volte con PBS sterile e poi aggiungere 2 ml di una delle cinque soluzioni di taratura. </li><li> Posizionare il piatto cultura nella camera di fase confocale. </li><li> Procedere al time-lapse acquisizione delle immagini secondo le seguenti impostazioni: <ol><li> Impostare il numero di immagini e tempi di durata degli intervalli per l&#39;esperimento. NOTA: Usiamo tipicamente un intervallo di 1 minuto tra le immagini fino a 30 min. </li><li> Programmare l&#39;otturatore per chiudere tra l&#39;acquisizione di ogni immagine. </li></ol></li><li> Registrare l&#39;intensità di fluorescenza per min in un foglio elettronico e determinare il momento in cui l&#39;intensità di fluorescenza è costante. PH intracellulare è generalmente stabile dopo 15 - 20 min. </li><li> Ripetere passaggi 7,1-7,4 utilizzando un nuovo piatto di coltura per ogni soluzione di calibrazione rimanente. </li></ol> 8. Acquisizione dati <ol><li> Una volta che la calibrazione è stato fatto, acquisire dati di esempio 4-5 campi scelti a caso contengono 15-20 cellule per campo. Due immagini sono ottenute per ciascun campo: uno per l&#39;etichettatura HPTS (vescicole) e il secondo per SNARF-1 etichettatura (citosol). </li><li> Fluorescenza di fondo (zona extracellulare) viene digitalmente sottratto dalle immagini fluorescenti di entrambe le sonde. Vescicole etichettati e citoplasma dei rispettivi immagini memorizzate sono state selezionate usando una maschera binaria. Per ogni sonda pH-sensing, intensità di fluorescenza sono misurati su una scala numerica (0-4,095 scala di livelli di grigio). Una intensità medio per tutti i pixel del organello o citoplasma è calcolato ei valori vengono utilizzati per calcolare i rapporti di fluorescenza. </li></ol> 9. Analisi dei dati <ol><li> I vari pacchetti software sono disponibili in commercio per l&#39;analisi dei dati. EsempioFluoView Software. </li><li> In un foglio di calcolo, i valori dei record e calcolare rapporti di fluorescenza come segue: Nel caso di HPTS, R = (F 458 nm / F 405 nm) e, nel caso di SNARF-1, R = (F 644 nm / F 584 nm ). </li><li> Tracciare i dati utilizzando software grafici scientifici come GraphPad Prism. La trama dovrebbe ritrarre rapporti di fluorescenza (asse y) in funzione del pH (asse X). Curva di raccordo è realizzato utilizzando la regressione non lineare. </li><li> Raccogliere intensità di fluorescenza dei campioni come descritto al punto 8.2 e calcolare rapporti di fluorescenza. Usare curve di calibrazione per trasformare i rapporti in valori di pH. </li></ol>

<ol><li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+Homeostasis+of+cellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">pH Homeostasis of cellular organelles.</a> News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).</li>
<li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+pH%3A+a+perfect+storm+for+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).</li>
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<li>Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NHE1+inhibition+by+amiloride-+and+benzoylguanidine-type+compounds.+Inhibitor+binding+loci+deduced+from+chimeras+of+NHE1+homologues+with+endogenous+differences+in+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity.</a> J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).</li>
<li>Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-pH+crosstalks+in+rat+mast+cells%3A+cytosolic+alkalinization%2C+but+not+intracellular+calcium+release%2C+is+a+sufficient+signal+for+degranulation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation.</a> Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).</li>
<li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for intracellular pH.</a> Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).</li>
<li>Giuliano, K. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+intracellular+pH+of+BALB%2Fc-3T3+cells+using+the+fluorescence+of+pyranine%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine.</a> Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).</li>
<li>Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+intracellular+pH+changes+on+resting+cytosolic+calcium+in+voltage-clamped+snail+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones.</a> J Physiol. 530, 405-416 (2001).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Misura di pH quantitativa in live-cell imaging di diversi compartimenti cellulari è necessaria per misurare con precisione le variazioni di pH nelle risposte cellulari alle sfide esterne. Tuttavia, uno dei principali ostacoli che rimane è facile e specificamente i compartimenti cellulari. A questo proposito, alcuni studi hanno evidenziato l&#39;uso di HPTS come indicatore di pH intracellulare introdotto in cellule mediante elettroporazione o microiniezione 8-10. Queste tecniche soffrono di gravi inconvenienti...

<table><tbody><tr><td>Soluzioni per taratura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosio (destrosio)</td><td>Fischer</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Fischer</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Fischer</td><td>M-1612</td><td></td></tr><tr><td>Acqua deionizzata</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Calbiochem</td><td>481990</td><td>Tossico per inalazione o a contatto con la pelle</td></tr><tr><td colspan="4">Tenere al riparo dalla luce a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>Piastre di coltura e vuote; 35 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>354456</td><td></td></tr><tr><td>sonde</td><td></td><td></td><td></td>per il rilevamento del pH</tr><tr><td>Acido 8-idrossipirene-1,3,6-trisolfonico (HPTS)</td><td>Life technologies</td><td>H-348</td><td>Tenere lontano dalla luce a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>5-(e-6)-carbossi-carbossi SNARF&reg;-1, acetossimetilestere, acetato</td><td>Life technologies</td><td>C-1271</td><td>Tenere lontano dalla luce e dall'umidità a -20 gradi C</td></tr><tr><td>Dimetil Sufoxide (DMSO)</td><td>Fischer</td><td>BP231-1&nbsp;</td><td>nocivo</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 100X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico</td><td>Fischer</td><td>S369-1</td><td>115 g</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>J.T Baker</td><td>3246-01</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Acqua deionizzata</td><td>N/A</td><td>N/A Portare</td><td>in autoclave da 1 L</td></tr><tr><td>e regolare il pH a 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 100X</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td>40,5 g</td></tr><tr><td>Acqua deoinizzata</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Portare a 5 L</td></tr><tr><td>modulatori di</td><td></td><td></td><td></td>pH</tr><tr><td>Bafilomicina A1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1793</td><td></td></tr><tr><td>5-(N-Etil-N-isopropil)amiloride (EIPA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3085</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio</td><td>Fischer</td><td>A649-500</td><td></td></tr></tbody></table>

la misurazione simultanea di ph in endocitosi e citosoliche scomparti nelle cellule viventi usando microscopia confocale

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Il pH intracellulare è strettamente regolato e sono state riportate differenze di pH tra il citoplasma e gli organelli1. La regolazione del pH cellulare è fondamentale per il controllo omeostatico dei processi fisiologici che includono: sintesi di proteine, DNA e RNA, traffico vescicolare, crescita cellulare e divisione cellulare. Alterazioni dell'omeostasi del pH cellulare possono portare a cambiamenti funzionali dannosi e promuovere la progressione di varie malattie2. Sono disponibili vari metodi per misurare il pH intracellulare, ma pochissimi di questi consentono la misurazione simultanea del pH nel citoplasma e negli organelli. Qui, descriviamo in dettaglio un metodo rapido e accurato per la misurazione simultanea del pH citoplasmatico e organellare utilizzando la microscopia confocale su cellule viventi3. Questo obiettivo viene raggiunto con l'uso di due coloranti raziometrici sensibili al pH che possiedono una partizione selettiva del compartimento cellulare. Ad esempio, SNARF-1 è compartimentalizzato all'interno del citoplasma mentre HPTS è compartimentalizzato all'interno degli organelli endosomiali/lisosomiali. Sebbene l'HPTS sia comunemente usato come indicatore di pH citoplasmatico, questo colorante può marcare in modo specifico le vescicole lungo la via endosomiale-lisosomiale dopo essere stato assorbito dalla pinocitosi3,4. Utilizzando queste sonde sensibili al pH, è possibile misurare simultaneamente il pH all'interno dei compartimenti endocitico e citoplasmatico. La lunghezza d'onda di eccitazione ottimale dell'HPTS varia a seconda del pH mentre per SNARF-1 è la lunghezza d'onda di emissione ottimale che varia. Dopo il caricamento con SNARF-1 e HPTS, le cellule vengono coltivate in diverse soluzioni calibrate per il pH per costruire una curva standard di pH per ciascuna sonda. L'imaging cellulare mediante microscopia confocale consente l'eliminazione di artefatti e rumore di fondo. A causa delle proprietà spettrali dell'HPTS, questa sonda è più adatta per la misurazione del compartimento endosomiale leggermente acido o per dimostrare l'alcalinizzazione degli organelli endosomiali/lisosomiali. Questo metodo semplifica l'analisi dei dati, migliora l'accuratezza delle misure di pH e può essere utilizzato per affrontare le questioni fondamentali relative alla modulazione del pH durante le risposte delle celle a sfide esterne.

Per la misura simultanea di pH sia intracellulare e compartimenti cellulari endosomal / lisosomiali, sono stati usati i fluorescenti sonde pH-sensing raziometrici Snarf-1 e HPTS. SNARF-1 è limitata al compartimento citosolico che HPTS permette di misurare raziometrica pH del vano endosomale / lisosomiale. Carico delle cellule con HPTS per 16 ore permette la sua localizzazione selettiva negli endosomi / lisosomi 4. Un tipico esempio di fluorescenza registrata da cellule HT-1080 caricato con le sonde pH-sensibi...

Sono disponibili diversi metodi per misurare il pH intracellulare, ma pochissimi di questi permettono la misurazione simultanea del pH citoplasmatico e organellare. Qui, descriviamo in dettaglio una metodologia rapida e accurata per misurare simultaneamente il pH citoplasmatico e vescicolare mediante imaging raziometrico di cellule viventi.

La misurazione simultanea di pH in endocitosi e citosoliche scomparti nelle cellule viventi usando Microscopia confocale

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare simultaneamente il pH vescicolare e citosolico in cellule vive mediante microscopia confocale. Questo risultato si ottiene innanzitutto incubando le cellule con le sonde rivelatrici di pH, HPTS e SNF F1, che marciano rispettivamente i compartimenti endosomiali e lisosomiali e il citosol. Successivamente, le cellule vengono posizionate in una camera controllata ambientalmente sotto un microscopio confocale, e il software viene impostato per misurare la fluorescenza delle sonde all'interno della camera.Le cellule vengono incubate con diverse soluzioni calibrate per pH. Viene costruita una curva standard di pH utilizzando una regressione non lineare. Vengono determinate equazioni esponenziali per entrambe le sonde, che successivamente vengono utilizzate per convertire le intensità di fluorescenza dei campioni in valori di pH.Questo metodo permette la determinazione del pH vescicolare e citosolico da campioni sottoposti a diversi trattamenti e può consentire lo studio della regolazione del pH intracellulare durante processi biologici. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per la misurazione del pH intracellulare è che il nostro approccio consente la valutazione della dinamica del pH intracellulare in cellule vive, eliminando al contempo artefatti e rumore di fondo durante l'acquisizione delle immagini. A dimostrare la procedura sarà Fess Lucier, lo studente di dottorato che ha sviluppato questo metodo. Per la calibrazione del pH cellulare, è necessario preparare una serie di cinque soluzioni da 50 millilitri con valori di pH compresi tra 5,5 e 7,5 a intervalli di 0,5.Aggiungere una goccia normale di idrossido di potassio o acido cloridrico goccia a goccia per regolare i valori di pH. Successivamente, aggiungere a ciascuna soluzione tarata per pH 0,05 millilitri di IOR gersin. A 10 millimolare per una concentrazione finale di 10 micromolare, il risin aumenterà la permeabilità della membrana cellulare in presenza di concentrazioni depolarizzanti di potassio extracellulare. Seminare le cellule sotto cappa in piatti di coltura da 35 millimetri con due millilitri di mezzo contenente 10% di siero fetale bovino e antibiotici, con l'obiettivo di raggiungere una confluenza del 50% entro 24 ore di incubazione a 37 gradi Celsius.Dopo aver seminato tutte le piastre necessarie per l'esperimento, seminare ulteriori cinque piastre per la calibrazione. Incubare queste piastre per 24 ore, 24 ore dopo e 16 ore prima dell'acquisizione delle immagini. Aggiungere due microlitri del marcatore organellare HPTS ad una concentrazione di un molare per una concentrazione finale di un millimolare di HPTS in soluzione nella mattina successiva, circa tre ore.Prima dell'acquisizione delle immagini, rimuovere l'HPTS eseguendo due lavaggi con PBS. Quindi aggiungere due millilitri di mezzo privo di siero e lasciare che le cellule incubino per almeno altre due ore.Subito prima dell’acquisizione delle immagini, incubare le cellule con cinque micromolari di snf, uno aggiungendo 10 microlitri di snf, uno millimolare seguendo il periodo di incubazione con SNF uno. Lavare le cellule due volte con PBS e aggiungere due millilitri di mezzo privo di siero, quindi procedere con l’acquisizione delle immagini. Le cellule.L'acquisizione delle immagini delle cellule deve essere eseguita con un microscopio confocale a scansione invertito spettrale, dotato di un palco motorizzato e di una camera ambientale. Quando si utilizzano piastre di plastica, un obiettivo da 40 x è il più appropriato. Il software deve essere impostato per due set di canali virtuali, regolando la lunghezza d'onda di eccitazione e le lunghezze d'onda di emissione.Per HPTS e SNF uno, l'apertura confocale è impostata per impostazione predefinita a 175 micron e l'apertura ottimale deve essere regolata manualmente a 300 micron. Una volta che la camera ha raggiunto la temperatura di 37 gradi Celsius, avviare la calibrazione, lavare una piastra di cellule altre due volte utilizzando PBS e quindi sostituire il mezzo con la prima soluzione di calibrazione. Posizionare ora le cellule nella camera e calibrare entrambi i coloranti sensibili al pH, acquisendo fino a 30 immagini a intervalli di tempo con intervalli di un minuto.Ogni stack di immagini può essere acquisito con uno spessore di 0,4 micron e una risoluzione di 800 pixel quadrati. Tra un'immagine e l'altra, lo scatto deve essere programmato per rimanere chiuso. Rilevare l'intensità fluorescente ogni minuto, che di solito si stabilizza intorno ai 20 minuti.Una volta che la fluorescenza si è stabilizzata, acquisire immagini da quattro o cinque campi contenenti da 15 a 20 cellule e entrambi i sonde. Queste immagini vengono utilizzate per i calcoli della curva. Ripetere questo procedimento per ogni soluzione di calibrazione.Quindi procedere con l'acquisizione delle immagini delle piastre in condizioni sperimentali per le quali non sono necessari lavaggi. Nell'analisi di ciascuna immagine, sottrarre innanzitutto digitalmente la fluorescenza di fondo extracellulare. Successivamente, selezionare le vescicole marcate e il citosol dalle immagini archiviate utilizzando una maschera binaria. Per ciascun sonda di rilevamento del pH, le intensità di fluorescenza vengono misurate su una scala da zero a 4.095.Calcolare l'intensità media per tutti i pixel nell'organello o nel citoplasma. Utilizzando questi valori, calcolare i rapporti di fluorescenza per HPTS e per snf. Per le curve di calibrazione, riportare i rapporti di fluorescenza ottenuti per ciascuna soluzione di calibrazione in funzione del pH; l'adattamento della curva di calibrazione deve essere effettuato utilizzando un'equazione esponenziale.Infine, utilizzare le curve di calibrazione per trasformare i rapporti in valori di pH e ottenere così i valori di pH citosolico e degli organelli nelle cellule vive in condizioni sperimentali. È stata ottenuta una chiara evidenza che HPTS etichetta sia i compartimenti endosomiali che lisosomiali, mediante doppia colorazione con transferrina coniugata ad Alexa 5 46 per marcare gli endosomi o con un fluoroforo lisotropo. Lyo tracker.Sono state acquisite immagini in time-lapse di colore rosso scuro per ogni sonda, come descritto per le cellule HT 10 80. Sono state testate cinque soluzioni di calibrazione per valutare la stabilità dell'approccio fluorimetrico dopo 15 minuti nelle soluzioni, ad esempio con pH pari a 6 e pH 7,5. Nella curva di calibrazione per un determinato pH, i dati rappresentano il rapporto tra le intensità di fluorescenza a 558 e 405 nanometri per HPTS oppure a 644 e 584 nanometri per SNF uno. Entrambe le curve sono state adattate con un'equazione esponenziale.L'efficienza del metodo in cellule vive HT 10 80 è stata valutata utilizzando cloruro di ammonio, una base debole che aumenta il pH intracellulare. La base ha aumentato il pH sia del citosol che delle vescicole. Il metodo è stato inoltre valutato utilizzando B mycin, A one, un inibitore di va a TPAs bamy, A one che ha indotto un'alcalinizzazione sia dei compartimenti endosomiali che lisosomiali, ma non ha alterato il pH citosolico.Infine, è stato testato l'EIPA, un inibitore dell'NHE1. Esso ha acidificato il citosol fino a un pH di 6,62, ma non ha influenzato il pH. Per ora.Lo studio dell'omeostasi del pH cellulare è stato limitato sia dai rapidi cambiamenti di pH che avvengono all'interno delle cellule, sia dalla mancanza di strumenti per studiare il pH intracellulare. Oggi descriviamo un approccio semplice e passo dopo passo per misurare simultaneamente il pH citosolico e quello endosomiale in singole cellule vive. Questo è particolarmente importante per lo studio dell'omeostasi del pH cellulare in cellule in cui mutazioni o farmaci possono influenzare l'ingresso e l'efflusso di protoni all'interno del compartimento endosomiale.

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