Metodi di imaging immunoistochimici e di calcio in Wholemount Rat Retina

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di marcare selettivamente le cellule gangliari retiniche nell'intera preparazione della montatura tramite un'iniezione di moncone del nervo ottico di un colorante indicatore di calcio. Ciò si ottiene iniettando prima un colorante indicatore di calcio ad altissima affinità, come il flusso quattro nel moncone del nervo ottico. Successivamente, la retina viene isolata dalla conchiglia oculare e divisa in quadranti per essere montata su un vetrino In una camera di registrazione configurata per imitare le condizioni fisiologiche, i contributi dei canali del calcio voltaggio-dipendenti al segnale del calcio.

Nelle cellule gangliari retiniche possono essere misurate in cellule depolarizzate utilizzando bloccanti dei canali. In definitiva, i risultati possono fornire misurazioni semiquantitative del contributo dei canali del calcio educati al voltaggio a un segnale come un segnale di calcio evocato ad alto contenuto di potassio. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'elettroporazione e il caricamento di massa, è la capacità di marcare selettivamente le cellule gangliari retiniche e i loro assoni in un'intera preparazione di montatura Conservare, sezionare gli occhi rad e ibernare un mezzo di mira o una soluzione simile.

Ora, se si intende eseguire esperimenti di imaging del calcio, riempire le cellule gangliari retiniche con il flusso quattro. Iniettare 0,5 microlitri di flusso da 40 millimolari di sale penta di potassio, ricostituito in acqua nel nervo ottico, moncone di circa un millimetro posteriormente al bulbo oculare. Trasferisci il bulbo oculare ai suonelli dei mammiferi.

Bollito con il 95% di ossigeno, il 5% di anidride carbonica o un'ora a temperatura ambiente. Tenete la preparazione al buio. Sezionare gli occhi al microscopio con intensità luminosa controllata.

Usando una lama di rasoio, praticare delicatamente una piccola incisione nella parte anteriore del bulbo oculare e rimuovere la cornea. Quindi rimuovere la lente dalla superficie retinica interna utilizzando una pinza. Tenere saldamente la sclera.

Quando si rimuove il vitreo con l'altra pinza, staccare delicatamente la base del vitreo verso il centro della retina. La preparazione risultante, chiamata coppa I, può essere elaborata per la preparazione immunoistochimica della montatura intera, per la preparazione dell'imaging del calcio o preparata per le sezioni retiniche trasversali per realizzare una preparazione immunoistochimica della montatura intera. Per prima cosa, fai quattro tagli alla retina in modo che sia piatta.

Posizionare la retina sul vetrino di copertura con lo strato di cellule gangliari rivolto verso il basso. In secondo luogo, aggiungi una goccia di soluzione alla retina e coprila con carta da filtro di cellulosa se necessario, appiattisci la retina con un pennello o una pinza. In terzo luogo, quando la retina è completamente piatta e si stacca dalla carta da filtro, rimettila nella soluzione.

Per elaborare prima la preparazione, trasferirla in aldeide paraforma al 4% per 10-15 minuti. Quindi lavare le retine tre volte in tampone fosfato molare 0,1 a pH 7,4 per 30 minuti per lavaggio per un totale di 90 minuti. Successivamente, incubare le retine in 500 microlitri di soluzione bloccante per una notte a quattro gradi Celsius.

Questa soluzione è composta al 5% da siero normale di capra o siero d'asino in tampone fosfato con tritton allo 0,3% e azide di sodio allo 0,1% nei successivi cinque-sette giorni, incubare le retine nella soluzione di anticorpi primari a quattro gradi Celsius. La composizione di questa soluzione deve essere raggiunta empiricamente. Lavare via la soluzione di anticorpi primari proprio come è stato lavato via il fissativo.

Quindi incubare le retine in anticorpi secondari a una concentrazione da uno a 1000 durante la notte a quattro gradi Celsius. Rimuovere l'anticorpo secondario con altri tre lavaggi e tampone fosfato. Quindi montare le retine per la visualizzazione e sigillare con lo smalto.

Questi vetrini devono essere conservati al buio a quattro gradi Celsius. Inizia con la preparazione di una montatura intera per l'imaging del calcio dalla coppa I nei ringer. Per prima cosa, taglia il tessuto retinico in quadranti.

Posizionare un quadrante piatto sulla camera di registrazione con lo strato gangliale rivolto verso l'alto e quindi lo strato di fotorecettori rivolto verso il basso. Asciugare accuratamente l'area circostante con una salvietta Kim e posizionare delicatamente l'arpa unta sul fazzoletto. Ora caricare la preparazione retinica sul rig e terminare l'impostazione del sistema di superfusione a gravità a otto canali.

Se la retina montata si muove dopo aver posizionato l'arpa, rimuoverla e pulirla con cura. Asciugare l'area circostante la retina e rimontare l'arpa super. Fondere la camera di registrazione con una soluzione di suoneria per mammiferi e mantenere la soluzione in ebollizione continua con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica.

Innanzitutto, come controllo senza farmaci, eseguire due impulsi accoppiati ad alto potassio da tre millimolari a 60 millimolari per 33 secondi. Depolarizzando, l'RGC dovrebbe attivare i canali del calcio voltaggio-dipendenti se la preparazione funziona. Ora procedi con gli esperimenti.

Il bloccante dei canali del calcio voltaggio-dipendente di tipo Nifedipina e L è comunemente usato per valutare il contributo dei canali del calcio voltaggio-dipendenti di tipo L al cobalto del segnale di calcio evocato dalla depolarizzazione. Un bloccante dei canali del calcio non specifico può essere utilizzato per bloccare selettivamente i canali del calcio voltaggio-dipendenti. Scansiona la preparazione ogni cinque secondi per visualizzare e acquisire immagini dell'rgc fluorescente.

Utilizzare una potenza laser il più bassa possibile. L'eccitazione deve essere impostata a 488 nanometri e l'emissione deve essere raccolta con un filtro LP da 505 nanometri. Utilizzando i protocolli descritti, è stata eseguita la marcatura immunologica contro la proteina delle cellule gangliari R-B-P-M-S, che è una proteina legante l'RNA con un flusso di splicing multiplo. Quattro.

La colorazione era infatti limitata alle cellule gangliari in base alla specifica dell'anticorpo. Successivamente, è stato studiato il contributo dei canali del calcio voltaggio-dipendenti al segnale del calcio negli R GC utilizzando i valori di intensità fluorescente acquisiti dall'rgc. Ai livelli basali, gli assoni RGC e RGC possono essere visti marcati con il flusso quattro.

Al fine di acquisire i valori di intensità fluorescente, le ROI sono state posizionate sulla cellula ganglionaria, sui somati e/o sugli assoni. Dopo aver applicato un alto contenuto di potassio all'intera preparazione della montatura, il segnale fluorescente degli RG C è aumentato. A ciò ha fatto seguito una successiva riduzione dei valori di intensità della fluorescenza in presenza di cobalto durante il secondo impulso ad alto contenuto di potassio.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come caricare selettivamente le cellule gangliari retiniche con un dado indicatore di calcio sintetico in un'intera preparazione di montatura.