Name: Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dellintegrasi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-09T21:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Impara a valutare la citotossicità cellulare e l'attività antivirale contro HIV-1 usando saggi luciferasi. Questo metodo permette di identificare rapidamente composti efficaci contro ceppi resistenti ai farmaci.

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Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale del NSC.

1. Preparazione di titoli di Master <ol><li> Fai maestri scorte dei composti da testare in DMSO. Preparare scorte a una concentrazione standard di 20 mM. Nota: qualsiasi concentrazione superiore a 10 mm può essere utilizzato. Composti che possono essere utilizzati come controlli positivi per convalidare questo saggio includono RAL, EVG, e DTG. </li><li> Garantire i composti sono sciolti in DMSO vortex le soluzioni più volte per 15 secondi e incubando a temperatura ambiente per 1 ora. Conservare le 20 soluzioni madre mM al buio a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 2. Preparazione delle piastre con 96 pozzetti per Compound Screening <ol><li> Scegliere la linea di cellule da testare (es HOS o TZM-bl), e seminare 100 pl di tali cellule ad una densità di 4 x 10 4 cellule / ml (4.000 cellule / pozzetto) in mezzi (ad esempio modificato Eagle o DMEM Dulbecco supplementato con 5% (v / v) di siero fetale bovino, siero di vitello neonato 5%, e penicillina (50 unità / ml) più streptomycin). </li></ol> 3. Generazione di riserve di virus Produrre VSV-g-pseudotyped HIV trasfettando cellule 293 (come mostrato in Figura 1, fase 1) 32-34. <ol><li> Il giorno prima della trasfezione, piastra 293 celle su 100 piatti mm di diametro con una densità di 1,5 x 10 6 cellule. </li><li> Il giorno della trasfezione, trasfettare cellule 293 con 16 pg di tipo selvatico o mutante HIV (pNLNgoMIVR - ΔLUC) e 4 microgrammi di VSV (pHCMV-g) utilizzando il metodo del fosfato di calcio 35. </li><li> Viene aggiunto circa 6 ore dopo il precipitato di fosfato di calcio, lavare 293 cellule due volte con tampone fosfato (PBS) e incubare con mezzi freschi per 48 ore. [DMEM supplementato con 5% (v / v) di siero fetale bovino, siero di vitello neonato 5%, e penicillina (50 unità / ml) più streptomicina (50 mg / ml)]. </li><li> Raccogliere il virus contenente surnatanti rimuovendo il supporto dal diametro di 100 mmpiatti, chiarire il surnatante mediante centrifugazione a bassa velocità a 3000 rpm per 10 minuti, filtrare il surnatante attraverso un filtro da 45 micron dimensione dei pori siringa, trattare surnatanti con DNasi Turbo per 30 minuti a RT e diluire surnatanti in mezzi per la preparazione in saggi di infezione . Conservare il surnatante virale congelati, in aliquote, a -80 ° C. Nota: la quantità di p24 nel supernatante viene determinato utilizzando un kit p24 saggio immunoenzimatico HIV-1. La concentrazione p24 è utilizzato per controllare la quantità di virus nel campione. Circa 500 ng di virus viene aggiunta alle cellule HOS placcato da 60 piatti mm di diametro ad una densità di 1,5 x 10 5 cellule / piatto il giorno prima dell&#39;infezione. Dopo 48 h di incubazione, le cellule vengono raccolte, raccolte per centrifugazione, lavate e risospese in 100 microlitri di PBS. Aggiungi una pari quantità di luminescenza giornalista dosaggio del gene del reagente e misurare l&#39;attività luciferasi come descritto nelle sezioni 5.4.1 e5.4.2. Da questo, una diluizione appropriata del virus può essere fatto come discusso nel passo 4.6. </li></ol> 4. Composto screening in piastre con 96 pozzetti Schermo ciascun composto in triplice copia e media i risultati. Nota: l&#39;effetto di ciascun composto sulla replicazione virale viene corretto normalizzando il livello di replicazione ottenuto in assenza di qualsiasi composto. <ol><li> Determinare l&#39;intervallo di concentrazione empirica di essere proiettati. Nota: in genere, schermi con 11 diluizioni seriali sono fatti aggiungendo il composto alla colonna piastra per colonna e schermi con 7 diluizioni seriali sono fatti aggiungendo il composto per riga. Una triplice copia set di pozzi deve essere riservato per il controllo non composto. Inoltre, una colonna o una riga deve rimanere vuota per agire come controllo negativo / sfondo. Infine, se è una citotossicità cellulare o prova di infettività detterà se viene aggiunto virus. </li><li> Prepararediluizioni seriali della soluzione stock di 20 mm. Le concentrazioni sono scelti in funzione della gamma determinato empiricamente di concentrazioni da testare (come mostrato nella Tabella 1). Preparare le diluizioni in media a 10 volte la concentrazione finale desiderata, cioè se la concentrazione finale sta per essere a 100 micron, fare un archivio di lavoro 1 mm. Nota: composti con IC 50 s sopra 5-10 micron di solito non sono buoni candidati per lo sviluppo di farmaci. Nei test iniziali testiamo i composti solo contro il vettore WT. Promettenti composti che inibiscono efficacemente il vettore WT vengono poi testati contro un gruppo di mutanti resistenti ai farmaci. </li><li> Rimuovere le piastre a 96 pozzetti dall&#39;incubatore e aggiungere le diluizioni seriali dei composti da testare ai pozzetti in triplicato (come mostrato in Figura 1, fase 2). Nota: il volume aggiunto al pozzetto dovrebbe essere 1/10 del volume della concentrazione finale. Quindi, aggiungere 22 microlitri / pozzetto (volume finale pInoltre virus ost è di 220 ml) per i saggi di infettività. Per i saggi di citotossicità, aggiungere 11 microlitri / pozzetto (volume finale è di 110 ml / pozzetto). </li><li> Riportare le piastre a 96 pozzetti per l&#39;incubatrice. Per uno schermo citotossicità cellulare, incubare le piastre a 96 pozzetti 48 ore a 37 ° C e senza ulteriori manipolazioni sono necessari nel protocollo 4: passare al protocollo 5 Per i saggi di infettività, proseguire seguendo le istruzioni riportate nel protocollo 4.. </li><li> Saggi di infettività solo. Rimuovere le piastre dal termostato dopo un minimo di 3 ore di incubazione a 37 ° C con i composti da analizzare. Nota: questo permette il composto da assorbito dalle cellule prima dell&#39;infezione con il vettore HIV. </li><li> Preparare una diluizione magazzino del virus 33, 34 (di solito circa 1,3) che produrrà un segnale luciferasi tra 0,2-1,5 unità luciferasi relative (RLU) in cellule non trattate. Un intero piatto richiederà circa 10 ml della diluizionevirus ted. Aggiungere 100 ml di virus a ciascuno dei pozzetti, utilizzando un 8 o 12 pipetta multicanale. Non aggiungere virus alle negativo / sfondo pozzetti di controllo. Riportare le piastre per la 37 ° C incubatore per 48 ore. Nota: uno stock diluizione del virus 01:03 è tipica diluizione che produrrà un segnale luciferasi tra 0.2 -1.5 RLU basato su un saggio p24 mostrando che la concentrazione virale nel supernatante è approssimativamente 500 ng in 1,0 ml. </li></ol> 5. Preparazione e misurazione della citotossicità ed infettività in piastre con 96 pozzetti <ol><li> Aspirare il supporto dai pozzi (fenolo rosso nei media può interferire con il segnale luciferasi). Utilizzare una pipetta di vetro con una punta di pipetta 200 microlitri fissato all&#39;estremità. Inizia la parte superiore del supporto e lavorare lentamente giù verso l&#39;angolo in fondo al pozzo. Non spendere troppo tempo sul fondo del pozzo, o le cellule possono essere rimosse dal pozzo. </li><li> Aggiungere 100 ml di PBS integrato con 0,5 mM MgCl 2 a ciascun pozzetto. Questo deve essere fatto immediatamente dopo la media è rimosso in modo che le cellule non si seccano. </li><li> Solo per saggi di citotossicità, aggiungere 5 ml di tampone substrato dal saggio di rilevamento di luminescenza ATP per ogni flacone di dotazione del reagente liofilizzato. Un flaconcino è sufficiente per una piastra a 96 pozzetti. <ol><li> Aggiungere 50 ml di tampone di lisi cellulare dal saggio rilevamento luminescenza ATP a ciascun pozzetto. Agitare la piastra a 96 pozzetti a 700 rpm a temperatura ambiente per 5 minuti usando un thermomixer compatto. </li><li> Aggiungere 50 ml di ricostituito luminescenza ATP di reagenti del dosaggio di rilevamento per tutti i pozzetti, eccetto per il controllo / sfondo negativi pozzi. Agitare a 700 rpm a temperatura ambiente per 5 minuti usando un thermomixer compatto. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 20 min per permettere tempo per lo sviluppo del segnale. </li><li> Leggere la piastra a 96 pozzetti utilizzando luminometro micropiastra. Nota: aprire il programma microplacca luminometro SoftMax Pro. Assicurarsi che il luminometro sia impostato per misurare luminescence ad una sensibilità di 5 letture / pozzetto. </li></ol></li><li> Solo per saggi di infettività, aggiungere 10 ml di tampone substrato dal saggio gene luminescenza reporter per ogni flacone di dotazione del reagente liofilizzato. Un flaconcino è sufficiente per ciascuna piastra da 96 pozzetti. <ol><li> Aggiungere 100 pl di luminescenza ricostituito giornalista saggio gene reagente a ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 20 min per permettere tempo per lo sviluppo del segnale. </li><li> Leggere la piastra a 96 pozzetti utilizzando un luminometro micropiastre interpretato nel paragrafo 5.3.3. </li></ol></li></ol> 6. Determinazione del CC 50 e IC 50 valori per Composti <ol><li> Trasferire i dati luciferasi dal luminometro micropiastra in un foglio excel. <ol><li> Media sia i dati di luciferasi in triplice copia ed i dati del segnale di fondo / di controllo. Sottrarre il segnale di fondo media / controllo dal segnale medio triplicato per l&#39;intera gamma di concentrazione. </li> &lt;li&gt; normalizzare il segnale di correzione del fondo media degli intervalli di concentrazione contro l&#39;attività, se è citotossicità o infettività, in assenza di qualsiasi composto per determinare la percentuale di inibizione. Nota: percentuale di inibizione è definito come l&#39;attività di luciferasi in presenza del farmaco diviso per l&#39;attività di luciferasi in assenza di farmaco moltiplicato per 100. </li></ol></li><li> Utilizzare software Kaleidagraph per ottenere CC 50 e IC 50 valori <ol><li> Trasferire sia l&#39;intervallo di concentrazione empiricamente determinato e percentuale di inibizione dell&#39;attività di luciferasi in Kaleidagraph. </li><li> Tracciare i dati con l&#39;intervallo di concentrazioni sull&#39;asse x e la percentuale di inibizione di attività di luciferasi sull&#39;asse y. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori hanno nulla da rivelare.

Descriviamo un saggio rapido, efficiente e riproducibile che può essere utilizzato per composti schermo di citotossicità e per la loro capacità di inibire la replicazione del WT e resistente HIV-1 farmaco. La capacità di identificare rapidamente i composti e testare la loro efficacia e la citotossicità è cruciale nello sviluppo di farmaci nuovi e migliorati contro HIV-1. Una volta composti di piombo sono identificati, analoghi del composto guida possono essere prodotti e testati utilizzando lo stesso dosaggio. Il saggio è relativamente semplice. Ci sono entrambi i controlli positivi e negativi che consentono all&#39;utente di diagnosticare i problemi più comuni (composti tossici, problemi con il vettore stock). L&#39;uso di un insieme triplicato di pozzetti senza composto aggiunto indica che si è verificato l&#39;infezione virale. Il fatto che la citotossicità è misurata in un saggio indipendente misinterpreting evita una riduzione della luciferasi citotossicità causata da un effetto specifico sulla replicazione virale. I passaggi criticinel protocollo si preparano le piastre in modo che le cellule sono distribuiti uniformemente nei pozzetti, che i pozzetti hanno le concentrazioni appropriate dei composti da testare, aggiungendo la stessa quantità di virus a ciascuno dei pozzetti, e misurando l&#39;attività di luciferasi per determinare il CC 50 e IC 50 valori. Il saggio è sicuro, quantitativa e riproducibile. Il saggio è sicuro perché il vettore è la replica difettoso. Il saggio è quantitativa e riproducibile perché si basa su un singolo vettore rotonda che esprime la luciferasi, che può essere saggiata esattamente e convenientemente. In un round saggio più replicazione del virus, la misurata IC 50 dipende dal numero di cicli di vita virali; questo è un problema particolare quando i saggi coinvolgono sia WT e virus resistenti ai farmaci che potrebbero avere le capacità di replica significativamente diversi. Ci sono stati diversi saggi enzimatici riferito in precedenza che possonoessere utilizzato per lo screening per gli inibitori IN. I saggi che coinvolgono tecnologia PCR real time per misurare il DNA integrato richiedono proteine ​​ricombinanti purificate (s), e sono, in generale, sia più laborioso e costoso, 36, 37. Sebbene sia possibile utilizzare saggi enzimatici per misurare l&#39;impatto dei composti sugli altri enzimi virali (RT e proteasi), ciascun enzima richiede un proprio sistema di dosaggio. L&#39;unico test vettore rotonda, come descritto, può essere utilizzato, senza modifiche, per lo screening inibitori della RT. Un test simile può essere usato per individuare inibitori di proteasi; Tuttavia, in un saggio di inibitore della proteasi, i composti devono essere aggiunti alle cellule usate per produrre i vettori. Un saggio correlate, utilizzando cellule e vettori differenti, può anche essere usato per individuare busta (env) e inibitori entrata fusione HIV. Infine, il test può essere utilizzato, in scala ingrandita, con dispensatori robotici automatizzati. Così, il saggio può essere utilizzato per lo screening di grandi librerie di composti contro WT e mutant HIV. Tuttavia, il fatto che il test in grado di rilevare un inibitore della replicazione dell&#39;HIV che agisce in diverse fasi del virali punti del ciclo di vita di una limitazione nell&#39;interpretazione dei dati. Di per sé il saggio non definisce la fase del ciclo di vita è bloccato da un composto. Se si pone questa domanda, può essere risolto utilizzando il tempo di saggi di addizione 38, e testando il composto contro le proteine ​​virali ricombinanti purificate. Purtroppo, nonostante il successo di farmaci anti HIV, vi sono ancora problemi sia con resistenza e tossicità. In assenza di un vaccino efficace contro l&#39;HIV, è necessario non solo per sviluppare nuovi farmaci terapeutici che saranno efficaci contro i mutanti resistenti ai farmaci esistenti, ma anche per sviluppare farmaci profilattici che possono ridurre la diffusione del virus. Se l&#39;uso profilattico di farmaci anti-HIV incudes il trattamento delle persone infette, questo approccio un onere speciale sullo sviluppo di farmaci che hanno little o nessuna tossicità a lungo termine.

La disponibilità di farmaci mirati diversi passaggi essenziali nella HIV-1 ciclo di vita virale ha portato alla terapia di combinazione farmaco (chiamato terapia altamente attiva antiretrovirale, o HAART), che ha notevolmente migliorato il trattamento delle infezioni da HIV-1, e la sopravvivenza a lungo termine dei pazienti. HAART, che utilizza tipicamente combinazioni di due nucleosidico della trascrittasi inversa (RT) e inibitori sia un inibitore della proteasi o un inibitore non nucleosidico RT, ha convertito una malattia mortale in una condizione di vita lunga 1-5. Tuttavia, nonostante i molti successi di HAART in soppressione sostenuta della replicazione virale, ma ha dei limiti. HAART non sradicare l&#39;HIV, in modo che i pazienti non vengono curati e la terapia è lunga vita. Ci sono problemi con la tossicità della droga e con l&#39;emergere di ceppi resistenti ai farmaci. La resistenza può nascere a tutti i farmaci anti-HIV approvati, tra cui i farmaci recentemente approvati che mirano HIV integrasi (IN). La resistenza ai farmaci probabilmente deriva Becauso di mutazioni spontanee che si verificano durante la replicazione virale (tasso di errore di 3 x 10 -5 ciclo mutazioni / base / replica) 6. Quando sorgono mutazioni nei geni che codificano per i bersagli di farmaci anti-retrovirali, un piccolo sottoinsieme di queste mutazioni porterà ad una riduzione di sensibilità del ceppo virale ai farmaci. Per evitare lo sviluppo di resistenza ai farmaci, le concentrazioni del farmaco devono essere mantenuti a livelli che sopprimono completamente replicazione dell&#39;HIV. Scarsa aderenza al regime terapeutico aggrava il problema, e può portare al rapido sviluppo di resistenza 7-9. Anche se concentrazioni di farmaco possono variare in pazienti a causa di assorbimento differenti, il metabolismo, la distribuzione ei livelli di escrezione, elevate concentrazioni di droga possono portare a tossicità 10. Poiché la terapia continua per la vita del paziente, esistono gravi problemi di sicurezza circa la tossicità a lungo termine di anti antiretrovirali. Gli anti-retrovirali comunemente usati in HAART possono avere effetti negativi and ci sono stati episodi in cui gli effetti collaterali sono stati in pericolo di vita 11-15. I problemi riscontrati pazienti con lo sviluppo di resistenza e tossicità alla base della necessità di sviluppare nuovi farmaci che bloccano efficacemente la replicazione dei ceppi resistenti al farmaco comuni del virus con poca o nessuna tossicità a lungo termine. Pertanto, vi è la necessità di un metodo che può schermo per i composti che bloccano fasi essenziali del ciclo vitale del virus rapidamente. Qui si descrive un dosaggio efficace che può essere utilizzato per valutare la citotossicità di composti e la loro capacità di bloccare rapidamente ed efficacemente la replicazione di entrambi WT e ceppi di HIV resistenti ai farmaci. Il test utilizzato è simile a un saggio che è stato sviluppato per lo screening farmacoresistenza in virus isolato da pazienti 16-18. Anche se il dosaggio può essere utilizzato senza modifiche per schermo per i composti che possono bloccare la trascrizione inversa dell&#39;HIV, noi descrIBE utilizzando il test per valutare IN inibitori. IN è un enzima virale essenziale che inserisce il DNA virale nel genoma cellulare 19. Anche se si stanno sviluppando una serie di promettenti inibitori, alcuni dei quali sono attualmente in fase di sperimentazione clinica, solo Isentress 20, 21 (noto anche come raltegravir o RAL) e, più recentemente, Elvitegravir (EVG) 22 e dolutegravir (DTG) 23 sono stati approvato dalla FDA. Questi composti sono attivi contro l&#39;HIV B e sottotipi non B in coltura cellulare e nei pazienti 24, 25. Tuttavia, il trattamento con RAL seleziona per farmaco-resistente di HIV-1 IN mutanti, tra cui Y143R, N155H, e G140S/Q148H 24, 26-31. N155H e G140S/Q148H anche ridurre l&#39;efficacia di EVG, che sottolinea la necessità di progettare e sviluppare seconda generazione IN Inibitori di trasferimento del filamento (INSTIs) che sono efficaci contro queste mutazioni di resistenza.

<table><tbody><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-017</td><td></td></tr><tr><td>ATPlite Sistema di rilevamento dell'ATP con luminescenza</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016941</td><td></td></tr><tr><td>Steady Lite Plus Sistema di analisi genica reporter di luminescenza ad alta sensibilità</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016751</td><td></td></tr><tr>PBS <td>Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td> di<td>Dulbecco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini</td><td>EM Molecular Devices Software</td><td></td><td></td></tr><tr>di <td>sinergia</td><td></td><td></td><td>KaleidaGraph</td></tr><tr><td>Nunc F96 Microwell Piastra in polistirene bianco</td><td>Thomas Scientific</td><td>12-566-26</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer Compact</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1442-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtrante Millex HA, 0,45 & micro; M</td><td>Millipore</td><td>SLAHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 Kit Elisa</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEK050B001KT</td><td></td></tr><tr><td>cellule HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>cellule TZM-bl</td><td>Programma di reagenti NIH AIDS</td><td>8129</td><td></td></tr><tr><td>pNL4.3&Delta; Env.LUC</td><td>NIH-NCI HIV Drug Resistance Program - Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>NIH-NCI HIV Drug Resistance Program - Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Molecular Devices</td><td>0200-310</td><td></td></tr></tbody></table>

screening rapido di hiv trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Sebbene un certo numero di farmaci anti HIV sono stati approvati, ci sono ancora problemi con la tossicità e la resistenza ai farmaci. Ciò dimostra la necessità di individuare nuovi composti in grado di inibire l&#39;infezione da parte resistente droga comuni ceppi HIV-1 con tossicità minima. Qui si descrive un dosaggio efficace che può essere utilizzato per determinare rapidamente la citotossicità e l&#39;efficacia di un composto contro i ceppi WT e mutanti cellulare. La linea cellulare porta è seminato in una piastra a 96 pozzetti e, dopo una incubazione 24 ore, vengono aggiunti serialmente diluizioni dei composti da testare. Nessun ulteriore manipolazioni sono necessarie per i test di citotossicità cellulare; per anti HIV saggi una quantità predeterminata di una o WT o farmaco resistente HIV-1 vettore che esprime luciferasi viene aggiunta alle cellule. La citotossicità viene misurata utilizzando un saggio dipende luminescenza ATP e l&#39;impatto dei composti sulla infettività viene misurata determinando la quantità di lucifeRASE in presenza o assenza di inibitori putativi. Questo test di screening richiede quattro giorni per completare e composti multipli può essere proiettato in parallelo. I composti vengono proiettati in triplicato ei dati sono normalizzati ai livelli infettività / ATP in assenza di composti bersaglio. Questa tecnica fornisce una misurazione rapida e precisa della efficacia e la tossicità di potenziali composti anti-HIV.

Se il test (Figura 1, punti 1 e 2) è stata eseguita con successo, allora i valori luciferasi dovrebbero somigliare i dati presentati nella tabella 2 Eseguire la scansione di tutti i range di concentrazione.; un composto potenzialmente potente rivelerà aumentando l&#39;attività luciferasi da sinistra a destra, e il controllo deve avere la più alta attività luciferasi. Se l&#39;attività luciferasi non superi 0,1 Unità luciferasi relative (RLU) su tutta la gamma di concentrazione, questo di solito indica che il composto ha ucciso le cellule. Se i dati luciferasi è maggiore o uguale a 2,0 RLU in tutte le diluizioni seriali, poi i composti non erano in grado di inibire HIV-1 infezioni alle concentrazioni testate. Tracciando la concentrazione dei composti contro la percentuale di inibizione di attività di luciferasi in Kaleidagraph (Tabella 3, parte A), dopo l&#39;esecuzione di analisi di regressione lineare, produrrà risultati simili a t<html> tubo mostrato in tabella 3, parte B. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Preparazione di HIV-1 Stocks virali e l&#39;installazione di citotossicità cellulare e Single-round infettività saggi. Nella fase 1, cellule 293T sono trasfettate con pNL4.3ΔEnv.LUC e VSV-G ed incubato per 48 ore per produrre virus 34 . Il virus viene raccolto e conservato (congelato a -80 ° C in aliquote) finché non viene utilizzato nei saggi di infettività. Per il passaggio 2, cellule HOS vengono seminate in una piastra a 96 pozzetti e incubate per 24 ore. Le cellule sono poi pre-incubate con diluizioni seriali dei composti da testare per 3 ore e poi infettati con il virus (sia WT o resistenti ai farmaci). Dopo una incubazione 48 ore, l&#39;attività della luciferasi è misurata. le1.jpg &quot;width =&quot; 300 &quot;/&gt; Tabella 1. Drug Screening Serial diluizione Prototype. Uno screening più rigoroso coinvolge 11 diluizioni seriali che in genere partono da 10 micron e finiscono a 0,0005 micron. Le diluizioni seriali sono preparati 10x; ci sono 100 microlitri di cellule e 100 ml di virus in ogni pozzetto). A questo volume e seguendo questi calcoli, le diluizioni seriali saranno sufficienti per 3 righe di un&#39;intera piastra a 96 pozzetti. I saggi di citotossicità sono preparati allo stesso modo; tuttavia le diluizioni seriali 11 partono da 250 micron e terminano a 0.05 micron. Solo 11 ml delle diluizioni sono aggiunti ai pozzetti nella piastra che contengono 100 ml di cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa cifra.</a> <img alt="Tabella 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; Tabella 2. Luciferasi Lettura segnale dati e Determinazione della percentuale di inibizione di attività luciferasi. La tabella dati mostra un tipico insieme di dati luciferasi per un composto successo. La tabella mostra inoltre i calcoli aggiuntivi necessari per determinare la percentuale di inibizione dell&#39;attività di luciferasi e il CC 50 e IC 50 valori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> Tabella 3. Linear Regression Analysis Tabella dati. Parte A. Graficamente la gamma di concentrazione utilizzata contro la percentuale di inibizione di attività di luciferasi in Kaleidagraph produrrà le relative curve di inibizione. Parte B, Le curve di inibizione sono definiti dalla 3 parametricofunzione sigmoidale e in forma di dati mediante regressione lineare analisi 18. Questa tabella dati viene quindi utilizzato in combinazione con Microsoft Excel per calcolare le concentrazioni di farmaco necessarie per inibire l&#39;integrazione virus e citotossicità cellulare del 50%, ad esempio, IC 50 e CC 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Qui si descrive la citotossicità cellulare e singoli saggi di infettività rotonde che consentono lo screening rapido e preciso dei composti di determinare la loro citotossicità cellulare (CC 50) e valori di IC 50 contro WT e resistente di HIV-1 farmaco.

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di esaminare composti di interesse per determinarne la citotossicità cellulare e la capacità di inibire il virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 selvaggio o resistente ai farmaci, mediante un saggio di infettività a ciclo singolo. Questo viene ottenuto esponendo innanzitutto le cellule ai composti per consentirne l'assorbimento, quindi incubando le cellule trattate con il virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1, selvaggio o resistente ai farmaci, che esprime la luciferasi. L'attività della luciferasi del virus può quindi essere misurata.In definitiva, il segnale di lettura della luciferasi può essere utilizzato per quantificare l'inibizione della replicazione del vettore virale HIV-1 da parte dei composti. Questa tecnica ha implicazioni terapeutiche poiché può essere impiegata per selezionare nuovi composti che mostrano un'efficacia superiore contro l'HIV resistente ai farmaci. Tali composti potrebbero potenzialmente essere utilizzati nelle terapie antiretrovirali per pazienti affetti da HIV-1. Il giorno precedente la trasfezione, seminare 2,93 x 10⁶ cellule in piastre da 100 millimetri a una densità di 1.500.000 cellule.Il giorno successivo, trasfettare le cellule con 16 microgrammi di HIV di tipo selvaggio o mutante e quattro microgrammi di VSV utilizzando il metodo del fosfato di calcio. Sei ore dopo, lavare le 2 93 cellule due volte con PBS e quindi incubarle con mezzo fresco per 48 ore. Due giorni dopo, raccogliere i supernatanti S contenenti il virus dalle piastre di diametro 100 millimetri e chiarificare i supernatanti mediante centrifugazione a bassa velocità per 10 minuti a 1.620 G a temperatura ambiente.Successivamente, filtrare i soprannatanti attraverso un filtro a siringa con pori di dimensione di 45 micrometri e trattare le sospensioni virali con turbo DNAsi. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, diluire il virus con mezzo fresco e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Per eseguire lo screening dei composti in un saggio di infettività, il giorno precedente l'esperimento, seminare 4.000 cellule di interesse in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.Piastra in pozzetti con 100 microlitri di terreno e incubare a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5%. 24 ore dopo, diluire in modo seriale il composto dalla soluzione madre in terreno fresco. Le concentrazioni finali scelte dipenderanno da un intervallo di concentrazioni determinato empiricamente, come indicato nella tabella.Successivamente, aggiungere la diluizione seriale dei composti alle pozzette in triplice replicato. A un decimo del volume della concentrazione finale, incubare la diluizione appropriata dei composti con le cellule per un minimo di tre ore. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 100 microlitri di virus diluito in ciascuna delle pozzette.Accettare le pozzette del controllo negativo. Quindi incubare le piastre per ulteriori 48 ore. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta di vetro dotata di una punta da 200 microlitri per aspirare il mezzo dalle pozzette, partendo dalla parte superiore del mezzo e procedendo lentamente verso l'angolo inferiore della pozzetta.Aggiungere immediatamente 100 microlitri di PBS integrato con cloruro di magnesio 0,5 millimolare in ogni pozzetto; quindi, per misurare l'attività della luciferasi, aggiungere 10 microlitri del tampone substrato presente nel saggio per il gene reporter chemiluminescente in ogni provetta contenente il reagente liofilizzato fornito. Successivamente, aggiungere 100 microlitri del reagente ricostituito in ogni pozzetto e incubare la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente per consentire lo sviluppo del segnale. Infine, leggere la piastra a 96 pozzetti utilizzando un luminometro per micropiastre.I valori della luciferasi ottenuti da una procedura di screening di composti riuscita sono presentati nella tabella. Si noti che i composti potenzialmente attivi mostrano un'attività della luciferasi crescente, con il controllo che presenta il segnale più alto in questo innesto rappresentativo di Kaleido. La concentrazione del composto è stata riportata in funzione della percentuale di inibizione dell'attività della luciferasi per determinare se il composto risulti efficace nell'inibire la replicazione dell'HIV di tipo selvaggio o resistente ai farmaci.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante distribuire accuratamente una quantità uniforme di cellule e virus in tutti i pozzetti delle piastre e assicurarsi di inserire la corretta concentrazione di composti in ciascun pozzetto.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Saggi in vitro per misurare la replicazione del virus sono state notevolmente migliorate dallo sviluppo di virus a RNA ricombinanti esprimenti luciferasi o altri enzimi in grado di bioluminescenza. Qui i dettagli di una pipeline screening ad alto rendimento che unisce tali ceppi ricombinanti di morbillo e virus chikungunya per isolare antivirali ad ampio spettro di librerie chimiche.

High-throughput screening per largo spettro chimico inibitori di RNA virus

Test di resistenza ai farmaci per l'HIV-1 individui infetti in mancanza di terapia antiretrovirale (ART) in grado di guidare le terapie future e migliorare i risultati del trattamento. Ottimizzazione dei singoli e della popolazione esiti di salute in alta prevalenza di HIV, ma a risorse limitate in ultima analisi richiederà conveniente e accessibile genotipizzazione resistenza ai farmaci e metodi di interpretazione.

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Questo rapporto descrive un test in vitro per misurare l'attività di integrazione associata al complesso di preintegrazione (PIC) del virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) negli estratti citoplasmatici di cellule infettate acutamente. L'integrazione del DNA dell'HIV-1 associato a PIC nel DNA bersaglio eterologo viene quantificata utilizzando una strategia di reazione a catena della polimerasi nidificata in tempo reale.

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Qui presentiamo un metodo di sequenziamento profondo che fornisce una determinazione obiettiva della nascente 3'-termini nonché profili mutational di molecole di DNA single-stranded. L'applicazione principale è la caratterizzazione del nascente retrovirali DNAs complementare (cDNA), gli intermedi generati durante il processo di trascrizione inversa retrovirale.

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Questo studio ha utilizzato strategie in-silico per identificare l'etravirina enumerata come un promettente agente terapeutico per l'HIV. I nostri risultati sulle interazioni molecolari e le dinamiche supportano la progettazione razionale di nuovi NNRTI come possibili alternative al trattamento dell'HIV.

Relazione quantitativa struttura-attività, previsione dell'attività e dinamica molecolare degli inibitori della trascrittasi inversa non nucleotidica

Impara a valutare la citotossicità cellulare e l'attività antivirale contro HIV-1 usando saggi luciferasi. Questo metodo permette di identificare rapidamente composti efficaci contro ceppi resistenti ai farmaci.

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell'integrasi

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