Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell'integrasi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di selezionare i composti di interesse per determinare la loro citotossicità cellulare e la capacità di inibire l'HIV wild type o resistente ai farmaci uno in un singolo ciclo di test di infettività. Ciò si ottiene esponendo prima le cellule ai composti per l'assorbimento e poi incubando le cellule trattate con luciferasi che esprime l'HIV wild type o resistente ai farmaci. L'attività della luciferasi del virus può quindi essere misurata.

In definitiva, il segnale di lettura della luciferasi può essere utilizzato per quantificare l'inibizione della replicazione del vettore virale HIV V one da parte dei composti. Questa tecnica ha implicazioni terapeutiche in quanto può essere utilizzata per lo screening di nuovi composti che mostrano una migliore efficacia contro l'HIV resistente ai farmaci. Tali composti potrebbero potenzialmente essere utilizzati nelle terapie antiretrovirali nei pazienti affetti da HIV Il giorno prima della trasfezione su piastra 2 93 cellule su piastre da 100 millimetri a una densità di 1.500.000 cellule.

Il giorno successivo, trasfettare le cellule con 16 microgrammi di HIV wild type o mutante e quattro microgrammi di VSV utilizzando l'app per il metodo del fosfato di calcio. Sei ore dopo, lavare le 2 93 cellule due volte con PBS e poi incubarle con terreno fresco per 48 ore. Due giorni dopo, prelevare il virus contenente surnatanti S dalle piastre di 100 millimetri di diametro e chiarificare i surnatanti mediante centrifugazione a bassa velocità per 10 minuti a 1.620 Gs a temperatura ambiente.

Successivamente, filtrare i surnatanti attraverso un filtro a siringa da 45 micromolari e trattare le sospensioni virali con DNA turbo. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, diluire il virus con un terreno fresco e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Per eseguire lo screening dei composti in un test di infettività il giorno prima dell'esperimento, seminare 4.000 delle cellule di interesse in ciascun pozzetto di un 96.

Immergere in 100 microlitri di terreno e incubarli a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. 24 ore dopo, diluire in serie il composto dalla soluzione madre in terreno fresco. Le concentrazioni finali scelte dipenderanno da un intervallo di concentrazioni determinato empiricamente, come indicato nella tabella.

Successivamente, aggiungere la diluizione seriale dei composti ai pozzetti in triplicato. Ad un decimo del volume della concentrazione finale, incubare con le cellule l'opportuna diluizione dei composti per almeno tre ore. Dopo l'incubazione, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 100 microlitri di virus diluito a ciascuno dei pozzetti.

Accetta i pozzetti di controllo negativo. Quindi incubare le piastre per altre 48 ore. Dopo l'incubazione, utilizzare una pipetta di vetro dotata di una punta da 200 microlitri per aspirare il terreno dai pozzetti iniziando dalla parte superiore del terreno e procedendo lentamente verso il basso verso l'angolo inferiore del pozzetto.

Aggiungere immediatamente 100 microlitri di PBS integrato con 0,5 millimolari di cloruro di magnesio a ciascun pozzetto, quindi per misurare l'attività della luciferasi, aggiungere 10 microlitri del tampone del substrato dal saggio del gene reporter di luminescenza a ciascuna fiala di reagente liofilizzato fornito. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di reagente ricostituito a ciascun pozzetto e incubare la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente per consentire lo sviluppo del segnale. Infine, leggere la piastra a 96 pozzetti utilizzando un luminometro per micropiastre.

I valori di luciferasi di una procedura di screening dei composti di successo sono presentati nella tabella. Si noti che i composti potenzialmente potenti mostrano una crescente attività della luciferasi con il controllo che mostra il segnale più alto in questo innesto rappresentativo di Kaleido. La concentrazione del composto rispetto alla percentuale di inibizione dell'attività di Lucifero è stata tracciata per determinare se il composto è efficace nell'inibire la replicazione dell'HIV wild type o resistente ai farmaci.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante distribuire accuratamente una quantità uniforme di cellule e virus in tutti i pozzetti delle piastre e assicurarsi di inserire la corretta concentrazione di composti in ciascun pozzetto.