Strato sottile cromatografica (TLC) Separazioni e Bioassays di estratti vegetali per identificare composti antimicrobici

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare i metaboliti vegetali che sono antimicrobici per i batteri anaerobi. Ciò si ottiene separando prima un estratto vegetale mediante cromatografia su strato sottile o TLC. Successivamente, il cromatogramma viene tagliato in zone comprendenti uno o più composti.

Le zone vengono quindi poste su agar inoculate con batteri anaerobi e incubate. Dopo l'incubazione, le zone vengono rimosse e le piastre vengono colorate per identificare i composti che inibiscono la crescita batterica. I dati risultanti rivelano la presenza o l'assenza di metaboliti antimicrobici delle piante.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della nutrizione dei ruminanti, come ad esempio quali sono gli effetti dei metaboliti secondari delle piante sull'utilizzo dei nutrienti da parte di microrganismi specifici. Anche se questo metodo rivela composti vegetali che sono inibitori dei batteri della rumina. Può anche essere applicato per rivelare composti inibitori di altri batteri o funghi.

In questo protocollo, i composti fenolici del trifoglio rosso saranno utilizzati per dimostrare l'identificazione di composti antimicrobici mediante la biografia del contatto. Iniziare pulendo la cromatografia su strato sottile o le piastre TLC che lavorano in una cappa aspirante. Preparare una quantità di solvente per la pulizia sufficiente a coprire il fondo della camera di sviluppo TLC e il bordo inferiore della piastra TLC A.

Una volta posizionato all'interno della camera, viene preparato il metanolo di acetato di etile due a uno. Successivamente, indossare i guanti e lavorare in una cappa aspirante. Usa le forbici per tagliare le piastre di silice flessibile con supporto in alluminio o plastica per adattarle alla camera di sviluppo.

Inserire le piastre nella camera con le parti superiori appoggiate alle pareti della camera. Le piastre non devono toccarsi. Coprire la camera e lasciare che il solvente si muova verso l'alto sulle piastre per azione capillare.

Quando il solvente ha raggiunto la parte superiore delle piastre, rimuoverle dalla camera e disporle in posizione eretta nella cappa aspirante fino a quando il solvente non è evaporato. Una volta che le piastre sono asciutte, controlla se le impurità sono migrate vicino alla parte superiore delle piastre TLC. Questi appariranno come una banda gialla sotto la luce visibile o una banda fluorescente sotto la luce ultravioletta.

Se la maggior parte della lastra ha ancora una sfumatura giallastra, ripetere il processo di pulizia nella stessa camera TLC utilizzando lo stesso solvente. Dopo aver rimosso le piastre TLC dalla camera, scartare il solvente. Lasciare evaporare completamente il solvente residuo prima di utilizzare la camera per la parte successiva del protocollo.

Successivamente, per rimuovere l'umidità residua che può influenzare la migrazione dei composti sul supporto di silice, posizionare le piastre in posizione verticale in un forno di essiccazione a 100 gradi Celsius per 10-15 minuti per una piastra di 20 x 20 centimetri e cinque minuti per piastre di sette x 10 centimetri. Una volta che i piatti sono asciutti, lasciateli raffreddare a temperatura ambiente prima di caricarli con gli estratti. Per preparare le camere per la separazione dell'estratto, utilizzare le forbici per tagliare un pezzo di carta da filtro leggermente al di sotto dell'altezza della camera e circa la metà del perimetro della camera in larghezza.

Questa carta fungerà da stoppino per aspirare i solventi lungo la parete della camera e saturare la camera con carte solventi, migliorando così la riproducibilità delle separazioni In una cappa aspirante mescolare i solventi qui. I solventi utilizzati sono acetato di etile, metanolo, quattro a un volume per volume. Versare la miscela di solvente nella camera e coprire.

Usa una matita per segnare leggermente l'origine in un punto della lastra TLC che sarà sopra la superficie del solvente di sviluppo nella camera. Se la piastra assorbente TLC è morbida e si danneggia facilmente, fare dei segni sui bordi come mostrato qui. Quindi, sciogliere gli estratti in una quantità sufficiente di solvente organico per avere una soluzione concentrata invece di una sospensione torbida.

Qui il solvente utilizzato è il metanolo. L'uso di micropipette capillari o di una siringa da microlitri carica standard e campioni come bande strette lasciando un bordo di un centimetro sui lati della piastra, lasciare asciugare le bande a ventaglio la piastra o caricarla in una cappa aspirante aiuta ad asciugare le bande più rapidamente. Una volta che le bande si sono asciugate, caricare nuovamente i campioni nello stesso punto o sopra.

Se è necessaria una maggiore concentrazione di campione sulla piastra, ripetere l'operazione nella camera TLC, se necessario. Assicurarsi che l'intero stoppino sia saturo di solvente. Quindi, con una pinza o una pinza, posizionare le piastre all'interno della camera TLC.

Le piastre non devono toccare lo stoppino. Coprire la camera e lasciare che le piastre si sviluppino prima che il fronte del solvente raggiunga la parte superiore della piastra. Rimuovere le piastre dal serbatoio TLC e segnare l'altezza del fronte del solvente con una matita.

Lascia asciugare il piatto. In una cappa aspirante, sviluppare eventuali piastre TLC rimanenti nella stessa camera TLC, che generalmente è utilizzabile per un'intera giornata se tenuta chiusa. Se la quantità di solvente nella camera diminuisce notevolmente, preparare più miscela di solvente dopo che le piastre sono asciutte.

Visualizza le bande sotto la luce visibile o UV. Una camera di visualizzazione con una lampada UV portatile è conveniente, soprattutto se la lampada è in grado di rilevare composti sia a 254 nanometri UV a onde corte che a 365 nanometri a onde lunghe. Utilizzare una matita per delineare le bande utilizzando un sistema di documentazione fotografica su gel dotato di luci dall'alto, UV e/o visibili per ottenere immagini delle lastre.

Infine, per facilitare la caratterizzazione delle bande, calcolare il fattore di ritenzione o i valori RF misurando prima la distanza percorsa dal composto, quindi misurando la distanza percorsa dal solvente e dividendo il primo per la scala. Una volta contrassegnate le posizioni delle bande, le piastre possono essere conservate per un secondo momento. Utilizzare nel biotest.

Avvolgere i piatti nella plastica e coprirli con un foglio di alluminio. Conservare le piastre a meno 20 gradi Celsius. Il tempo massimo di conservazione dipende dalla stabilità del composto perché la silice non è neutra.

Alcuni composti possono degradarsi mentre si trovano sulla piastra TLC. In preparazione per il saggio della biografia del contatto, preparare e inoculare i batteri produttori di iperammoniaca o il terreno HAB in condizioni anaerobiche. La coltura utilizzata in questo caso è Clostridium stickland eye strain sr.

Coltiva la coltura fino alla fase esponenziale o stazionaria a 39 gradi Celsius. Utilizzare tecniche anaerobiche sterili quando si lavora con microrganismi anaerobi. Preparare zero virgola 75% in peso per volume.

L'agar nello stesso terreno utilizzato per far crescere i batteri dopo che la temperatura dell'agar è scesa a meno di 60 gradi Celsius. Inoculare l'agar fuso con l'1% in volume per volume di coltura e mescolare delicatamente, posizionarlo immediatamente in una camera anaerobica e versare in piastre di Petri di plastica da 15 x 100 millimetri con le forbici. Tagliare la lastra TLC in zone contenenti la banda o le bande di interesse.

Usando un pennarello segnato i lati posteriori delle piastre. Posizionare una striscia TLC inutilizzata sulla piastra di agar come controllo. Quindi posizionare le bande a faccia in giù sulle piastre di agar.

Incubare le piastre con il lato agar rivolto verso il basso nella camera anaerobica. Incubatrice per 24 ore a 39 gradi Celsius con pinze. Rimuovere le bande TLC dalle piastre di agar mentre si trovano nella camera anaerobica.

Aggiungere il tetra oleum rosso goccia a goccia sulle superfici delle piastre di agar. Lasciare che il colore si sviluppi per almeno 20 minuti. Quando la piastra di controllo diventa completamente rossa, rimuovere le piastre dalla camera anaerobica.

Il Clostridium stick Landi è un batterio anaerobico, quindi inizierà a perdere vitalità subito dopo la rimozione dalla camera anaerobica, ma il colore è stabile per più di 24 ore. Utilizzando una fotocamera digitale, fotografare le lastre sotto la luce visibile su uno sfondo che fornisca un contrasto sufficiente. Si osserverà un colore rosso brillante quando le cellule viventi sono colorate.

Le cellule morte non si colorano. Qui sono mostrate le separazioni rappresentative di silice e TLC di estratti di trifoglio rosso contenenti composti fenolici. La separazione in acetato di etile esano nove a uno oltre 8,5 centimetri ha portato a cinque bande, una completamente risolta dall'origine.

Gli standard caricati sono stati Formin, Bio, Canon A e Genine. Quattro bande di questa piastra sono state applicate a colture con bastoncino di Clostridium Landi, un batterio produttore di iperammoniaca ruminale, per 24 ore e colorate con rosso tetra oleum come descritto qui. L'incubazione con la banda uno Bio Canon A e parte della banda due quattro Monon nein su agar seminato con batteri ha portato a una zona di inibizione ben definita.

Tuttavia, l'incubazione del resto della banda due, insieme alle bande tre e quattro, non ha inibito la crescita batterica. Questi risultati hanno dimostrato che il bio canone A era inibitorio per vedere la crescita dell'occhio stickland, ma la forma aone Nein non lo era. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la tecnica è flessibile.

È possibile utilizzare altri microrganismi in esame, purché vengano selezionati i terreni appropriati e siano inclusi controlli per garantire che la chimica di separazione e il metodo di rilevamento siano compatibili Seguendo questa procedura. Altre tecniche, come la cromatografia liquida ad alte prestazioni e la spettrometria di massa, possono essere utilizzate per aiutare a caratterizzare i composti antimicrobici identificati in un biodosaggio.