Name: Tecnica di Subnormothermic Ex Vivo Fegato perfusione per la Conservazione, valutazione e riparazione dei marginali fegato innesti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Impara la tecnica di perfusione subnormotermica ex vivo del fegato per preservare e valutare innesti marginali prima del trapianto. Questo metodo riduce il danno da conservazione rispetto allo stoccaggio statico freddo.

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Lo studio è stato sostenuto da borse di ricerca del trapianto di organi Roche Research Foundation (ROTRF) e Astellas. Markus Selzner è stato sostenuto da un Development Award ASTS carriera. Matthias Knaak è stato sostenuto dalla borsa di studio Astellas ricerca. Ringraziamo Uwe Mummenhoff e la famiglia Birmingham per il loro generoso sostegno.

Una panoramica schematica del protocollo è presentato in Figura 1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig1highres.jpg" /> Figura 1 Protocollo di studio. Il disegno dello studio suina di danno epatico si basa su una donazione dopo la morte cardiaca (DCD) modello. Dopo la dissezione di tutti i vasi epatici, morte cardiaca è indotta seguita da 45 minuti di ischemia trapianto caldo. Per simulare un trasporto trapianto tra ospedali donatore e ricevente in un ambiente clinico, l&#39;innesto viene memorizzato sul ghiaccio per 4 ore dopo il freddo, doppio scarico. Dopo lo stoccaggio a freddo, l&#39;organo è perfuso subnormothermic per 6 ore al fine di valutare la stabilità di perfusione. In un modello di trapianto, il tempo di perfusione potrebbe essere più breve per ricaricare stoccaggio di energia e di valutare la vitalità dell&#39;organo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51419/51419fig1large.jpg" target="_blank">cliccate lui</a>re per vedere una versione più grande di questa figura. 1. Gli animali NOTA: suini maschi Yorkshire, 30-35 kg, sono stati utilizzati per questo studio. Tutti gli animali hanno ricevuto cura umana nel rispetto delle &#39;&#39; Principi di Laboratorio Animal Care &#39;&#39; formulate dalla Società Nazionale per la ricerca medica e la &#39;&#39; Guida per la cura di animali da laboratorio &#39;&#39; pubblicato dal National Institutes of Health. Il Comitato del Research Institute di Toronto Generale Animal Care ha approvato tutti gli studi. 2 Organo Retrieval <ol><li> Casa maschi Yorkshire suini in strutture di ricerca per 1 settimana prima di perfusione / trapianto per ridurre il livello di stress e per abituare gli animali alle condizioni abitative. Meno di 2 giorni di abitazioni all&#39;interno della struttura porterà ad una reazione fisica indotta da stress, che possono alterare il risultato della perfusione 22,23. </li><li> Anestetizzare i maialida una iniezione intramuscolare (im) di una miscela di ketamina (25 mg / kg), atropina (0,04 mg / kg), e midazolam (0,15 mg / kg). </li><li> Prima di intubazione, assicurare il maiale respira spontaneamente 2 L di O 2 dosato con il 5% isoflurano. Spruzzare le corde vocali con il 2% di lidocaina 2 minuti prima l&#39;intubazione per evitare spasmi delle corde vocali. Ad esempio, per un maiale di 35 kg utilizzare una 6.5 fr. tubo tracheale. Bloccare il tubo tracheale con 3-5 ml di aria ambiente. </li><li> Dopo l&#39;intubazione, utilizzare capnometria per confermare il corretto intubazione. Abbassare il gas isoflurano al 2%. Impostare il ventilatore di 14-16 respiri / min e un volume corrente di 10 ml / kg di peso corporeo. </li><li> Inserire un 20 G endovenosa (iv) catetere in una vena dell&#39;orecchio per consentire l&#39;infusione di soluzione di lattato di Ringer (200 ml per ora). Poi macchia il maiale e coprire con teli sterili. </li><li> Eseguire un&#39;incisione mediana seguito da un&#39;estensione laterale sinistra. Utilizzare un asciugamano per coprire le grandi e piccole viscere e spostarsi verso il lato sinistro. </li><li> Infe separatorior vena cava (IVC) e aorta distale uni dagli altri; Legare i rami aorta sul retro; isolare e arterie renali liberi dal tessuto aderente. </li><li> Dividere il legamento falciforme e il legamento triangolare con cauterizzazione. </li><li> Rilasciare la vena porta da una incisione del peritoneo tra il pancreas e la vena porta. Legare le vene che drenano dal pancreas alla vena porta. </li><li> Sezionare il tronco celiaco sotto la vena porta e seguire all&#39;indietro per l&#39;aorta. Circondano l&#39;arteria mesenterica con un pareggio 2-0; circondano le arterie gastriche splenici e di sinistra, che si diramano posteriormente al tronco celiaco. Sezionare il tronco celiaco fuori la vena porta. </li><li> Legare i vasi linfatici all&#39;interno del legamento epatoduodenale per evitare perdite linfatica. Dividere l&#39;arteria gastrica destra tra legami. Legare le vene più piccole. Separare il dotto biliare dal legamento e dividerlo distale dopo la legatura. </li><li> Sezionare l&#39;aorta dietro il diaframma tra cuore e celiaca trunk; posizionare un pareggio per 2-0 in tutto l&#39;aorta. </li><li> Rilasciare il fegato dalla cava inferiore sul lato destro con cauterizzazione electro; utilizzare forbici per la parte superiore tra cava e fegato. </li><li> Rimuovere la cistifellea e cauterizzare sfiati da letto della colecisti. </li><li> Somministrare iv 1.000 UI / kg di peso donatore di eparina. Per un modello DCD, indurre arresto cardiaco mediante iniezione intracardial di 40 Mval KCl 3 min dopo la somministrazione di eparina. Imposta arresto cardiaco come punto di partenza di ischemia calda. </li><li> Per la perfusione, raccogliere 1,6 L di sangue di maiale in sacchi CPDA (citrato, fosfato, destrosio, adenosina), subito dopo la morte cardiaca. Eseguire un lancio morbido (2.000 xg senza freno). Rimuovere il plasma e il buffy coat in condizioni sterili (classe biosicurezza cabinet II) e memorizzare gli eritrociti in sacchetti CPDA per la trasfusione. </li><li> Cannulare vena porta e aorta con le linee d&#39;organo a filo. Legare i legami precedentemente disposte intorno femorale, renale, splenica, mesenterica, e l&#39;arte gastrica sinistraerie nonché l&#39;aorta superiore. Per un cuore che batte donatore (HBD) modello, eseguire la cannulazione dell&#39;aorta e della vena porta in condizioni di battere il cuore. </li><li> Dopo 45 min di ischemia calda, lavare il fegato con l&#39;Università di Wisconsin soluzione (UW) con doppia perfusione via aorta (sacchetto di pressione) e della vena porta (gravità guidato). </li><li> Tagliare il fegato di maiale, lasciando tutti gli altri pescherecci lungo. </li><li> Durante la preparazione di back-tavolo, bloccare la parte superiore IVC con un Satinsky morsetto e lavare il fegato una seconda volta con circa 0,5 L di soluzione UW retrograda via inferiore IVC fino a quando il deflusso della vena porta è chiara. </li><li> Legare tutti i rami arteriosi dal tronco celiaco e aorta. Eseguire una perfusione pressione arteriosa back-tavolo con circa 0,5 L di soluzione UW. </li><li> Lavare il dotto biliare con soluzione UW. </li><li> Cannulare le parti superiori e inferiori della IVC utilizzando un mezzo &quot;x 3/8&quot; riduttori con Luer Lock; incannulare la vena porta e l&#39;arteria epatica con 3/8 &quot;; x 1/4 &quot;e 1/4&quot; x 3/8 &quot;riduttori con Luer Lock. Utilizzare la vena cava superiore e inferiore come il drenaggio venoso. </li><li> Mettere il fegato in un sacchetto organo, chiudere il sacchetto organo, e memorizzare il fegato sul ghiaccio fino a quando la perfusione è iniziata. </li></ol> 3. ex vivo perfusione epatica <ol><li> Preparare la soluzione di perfusione contenente soluzione 2,000 ml di Steen, 400 ml di eritrociti lavati, 550 mg di piruvato di sodio, 100 ml di soluzione di acido amino (10% Travasol), 10 mg di gluconato di calcio, 1.000 IE insulina ad azione rapida, 1 g di cefazolina, metronidazolo 500 mg, e 10.000 UI di eparina. Aggiungere altre molecole per la vasodilatazione, immunosoppressione, scavenging delle specie reattive dell&#39;ossigeno, o il trattamento delle cellule del fegato in base alla particolare protocollo di studio. </li><li> Per la componente dialisi, utilizzare dialisato standard contenente 3,5 mM di potassio, bicarbonato 25 mM, 27 mM di glucosio, così come 275 mg / L piruvato. </li><li> Impostare il circuito di perfusione (schema vedi Figura 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig2highres.jpg" /> Figura 2 Circuito impostato. Venendo dal serbatoio principale come il punto di inizio e di fine, la soluzione di perfusione è azionato da una pompa centrifuga attraverso un ossigenatore. Subito dopo ossigenazione della soluzione, il circuito si divide in una linea più piccola corsa a un&#39;unità dializzatore per elettrolita omeostasi e una linea più grande esecuzione di un filtro per leucociti riduzione delle cellule residue bianche del sangue (WBC). La soluzione che corre attraverso il dializzatore ritorna al serbatoio principale. Dopo il filtro dei leucociti, il circuito si divide di nuovo in 2 righe uguali. Una linea corre ad alta pressione (circa 60 mmHg) direttamente nell&#39;aorta di perfusione dell&#39;arteria epatica. L&#39;altra linea drena in un secondo serbatoio. Da questo serbatoio la vena porta è perfuso. La pressione di perfusione portale dipende dall&#39;energia elevazione del livello della soluzione del serbatoio (circa 2-6 mmHg). Tutti i fluidi sono drained tramite l&#39;infrastruttura e sovra-epatica cava di nuovo nel serbatoio principale. Per ridurre la gravità e la perfusione omogenea, il fegato è posto in una piscina riempita con acqua a temperatura regolata. Si è separato dall&#39;acqua da una membrana impermeabile e nuota in una sospensione di perfusione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51419/51419fig2large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <ol><li> Raccogliere tutti i fluidi dal circuito in 3 L serbatoio (serbatoio principale) e bloccare il deflusso. </li><li> Collegare il deflusso di una pompa centrifuga seguita da un ossigenatore commerciale. </li><li> Dietro l&#39;ossigenatore, dividere il tubo in 2 righe. Collegare una linea ad un dializzatore e scolatela di nuovo nel serbatoio principale. Collegare la seconda linea di un filtro di riduzione leucocitaria. </li><li> Dividere la linea dopo il filtro di riduzione dei leucociti in una linea arteriosa, che fornisce la soluzione di perfusione per l&#39;arteria epatica, e un portale vlinea enous fornendo soluzione di perfusione ad un secondo serbatoio, che drena nella vena porta per gravità deflusso. Bloccare l&#39;afflusso portale. </li><li> Collegare la linea arteriosa di una linea vena cava scarico nel serbatoio principale di raccoglimento fluido. </li><li> Per la raccolta di ascite o fuoriuscita della soluzione di perfusione del fegato, preparare un tubo di aspirazione collegato al serbatoio principale. </li></ol></li><li> Rilasciare il morsetto deflusso dal serbatoio principale e riempire il circuito con la soluzione di perfusione. Avviare la pompa centrifuga a 1.500 giri / min. La soluzione perfusione guiderà attraverso la linea arteriosa nella linea di vena cava nel serbatoio principale. Assicurarsi che tutta l&#39;aria è spinta fuori il circuito. </li><li> Accendere l&#39;alimentazione del gas al ossigenatore. </li><li> Prendete il fegato fuori dal ghiaccio. Lavare la soluzione UW con salina. </li><li> Inserire il fegato, con il lato convesso verso il basso per facilitare l&#39;accesso ai vasi, idealmente in un ambiente privo di gravità per evitarecompressione organo alla superficie di contatto. Utilizzare un bagno di acqua e calore coolable. Impostare la temperatura iniziale del bagno circuito e acqua a 20 ° C. Coprire il bagno d&#39;acqua con una membrana impermeabile e posizionare il fegato su quella membrana. Ridurre la gravità compressione guidato immergendo il fegato con la soluzione di perfusione. </li><li> Ridurre la velocità della pompa centrifuga a 1.000 giri / min e mettere due fascette al collegamento di arterie e vena cava linee. Quindi, tagliare il tubo tra i morsetti. Utilizzando un connettore a 3 vie, unire entrambi i deflussi cava e collegarli alla linea vena cava. </li><li> Rilasciare il morsetto dalla linea arteriosa, versare la soluzione di perfusione nella cannula arteriosa per sbarazzarsi di bolle, e collegare la linea alla cannula. Aumentare la pompa centrifuga a 1.500 giri / min. Rilasciare il secondo morsetto dalla linea vena cava. </li><li> Rilasciare il morsetto dal serbatoio venoso portale, al fine di riempire. Lasciate che la soluzione di perfusione versare nel Cannu Portalela e collegarlo. Faccia attenzione dei livelli dei fluidi stabili nel serbatoio portale. </li><li> Collegare le linee di pressione per le serrature Luer delle cannule arteriosa, portale e vena cava. </li><li> Per simulare le condizioni fisiologiche, applicare i trattamenti nel vaso giusto. Iniettare il glucosio nella vena porta e non nella linea arteriosa al fine di stabilire un gradiente mimando un portale maggiore gradiente di glucosio venoso e inducendo la sintesi di glicogeno 24,25. </li><li> Dopo aver collegato il fegato al circuito, alzare la temperatura a 33 ° C entro 60 min. </li><li> Obiettivo per un flusso a partire arterioso a circa 250 ml / min a 40 mmHg. Ciò può raggiungere i 700 ml / min durante la perfusione volta che la pressione viene innalzata fino a 70 mmHg. </li><li> A partire temperatura, puntare ad un flusso vena porta di 500-600 ml / min a 3-5 mmHg. Dopo aver aumentato la temperatura, monitorare il flusso venoso portale, che aumenterà fino a 1.100 ml / min a 4-6 mmHg. Non eccedere pressione portale al di sopra Physiological i valori (circa 8 mmHg) per proteggere fenestrazioni sinusoidali 26. Non eccedere flusso totale sopra 2.000 ml / min, per evitare di danneggiare l&#39;organo. Impostare il deflusso a -2 mmHg abbassando il principale serbatoio per evitare la congestione del fegato funzionale ostruzione. </li><li> Aggiungere il componente dialisi al circuito al fine di equilibrare la soluzione di perfusione a valori prefissati 27. Impostare il flusso del dialisato a 500 ml / h. Prendere una particolare attenzione per regolare il deflusso dialisi in modo che la soluzione di perfusione è né diluita né concentrato. Entro la prima ora della perfusione del serbatoio principale deve essere guardato con attenzione! </li><li> Garantire omogenea ossigenazione dei tessuti per recuperare e mantenere la funzione degli organi utilizzando un componente principale della miscela gassosa di O 2 (95-98%) e CO 2 (2-5%). Utilizzare gas variabile durante la perfusione in quanto il fegato trasforma il suo metabolismo e la sua richiesta pH durante la perfusione. </li><li> Mantenere un basso pH durante l&#39;inizio dellaperfusione per proteggere l&#39;organo con il concetto di paradosso pH 28 ed evitare gravi danni ai tessuti che può derivare da un collegamento veloce con pH fisiologico sotto riossigenazione, dal momento che dopo stoccaggio in soluzione UW, l&#39;organo ha un pH al di sotto di acidosi 7 Regolare la pressione parziale di CO 2 continuamente fino a 25-30 mmHg modo che il pH raggiunge un livello fisiologico entro 1 ora. </li><li> Aggiungere bicarbonato di sodio o di potassio al circuito per ottenere una concentrazione fisiologica di bicarbonato standard nel liquido di perfusione. Iniettare attentamente sotto gas del sangue ripetitivo e controllo degli elettroliti. </li><li> Monitorare la perfusione da periodico venoso e arterioso gas del sangue e AST analisi. Il venoso PO 2 rimane sopra 175 mmHg durante la perfusione. Monitorare il flusso e la pressione vascolare e notare la perfusione stabile per una costante resistenza vascolare. </li><li> Mantenere il sistema di perfusione stabile per un massimo di 8 ore. Alla fine del periodo di perfusione ex vivo, frescoil sistema di perfusione a 20 ° C e, dopo aver scollegato tubi del circuito dal fegato, lavare la soluzione perfusione il fegato doppiamente con soluzione UW ghiaccio freddo. Conservare il fegato una volta posti su ghiaccio in un sacchetto organo sterile. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In un modello suino che imita il trapianto di fegato DCD, abbiamo dimostrato che la perfusione del fegato subnormothermic con cellulari risultati della soluzione di perfusione nei parametri stabili di perfusione, minimal lesioni epatociti, e metabolismo epatico attivo. Il nostro perfusione subnormothermic istituito ha dimostrato di recuperare una omeostasi epatocellulare e il metabolismo. Accumulo di glicogeno viene ripristinato e metaboliti vengono eliminati. Ex vivo perfusione epatica come tecnica di conservazione offre per la prima volta la possibilità di valutare marker della funzione del trapianto e di lesioni durante la conservazione di organi e prima del trapianto. Accanto alla valutazione macroscopica della omogeneità perfusione dell&#39;innesto, valori di flusso forniscono un buon indicatore della redditività del graft e l&#39;entità del danno ischemico che aveva sofferto in precedenza 29. Il consumo di ossigeno e la produzione di bile sono marker della funzione metabolica. I livelli di enzimi epatici quali AST possono essere usate comesess il grado e la dinamica di lesione epatocellulare 30. Questa valutazione approfondita trapianto può consentire una discriminazione affidabile tra gli organi trapiantabili marginali e non trapiantabili. Abbiamo scelto un subnormothermic temperatura di 33 ° C nel nostro sistema di perfusione perché la temperatura è sufficiente a consentire metabolismo così come ATP e la sintesi di glicogeno. Allo stesso tempo, esso fornisce una richiesta di ossigeno diminuito rispetto a impostazioni di perfusione normotermici che fornisce la sicurezza supplementare contro danno ischemico. In generale, le temperature di perfusione superiori a 30 ° C hanno dimostrato di ridurre al minimo freddo danno ischemico e fornire sufficiente attività metabolica 31. Contrariamente ad altri gruppi, non abbiamo usato sangue intero come perfusato, ma una soluzione di albumina normo-osmotica (Steen) con globuli rossi lavati e filtrati. Escludendo le componenti del plasma e trombociti e leucociti, la soluzione di perfusione è defirmato da minimizzare segnalazione pro-infiammatoria durante la perfusione ex vivo. Oltre alla valutazione innesto, condizioni di perfusione stabili per diverse ore consentono il trattamento dell&#39;innesto. Numerose molecole hanno dimostrato di attenuare il danno da riperfusione in condizioni sperimentali 32. Tuttavia, quasi nessun regime di trattamento si è fatto strada nella pratica clinica, ancora. Una ragione sembra essere la mancanza di opportunità di applicare tali trattamenti durante la conservazione a freddo. Un fegato metabolicamente attivo su un sistema di perfusione ex vivo è ottimale per l&#39;applicazione di qualsiasi tipo di trattamento. A questo proposito, non solo trattamenti per migliorare le condizioni di riperfusione come attenuazione di attività delle cellule Kupffer o scavenging delle specie reattive dell&#39;ossigeno sono concepibili, ma anche trattamenti come la terapia genica per condizionare l&#39;innesto, per esempio, contro l&#39;epatite C recidiva. Altre strategie possibili potrebbero includere la riduzione sulla steatosi durante la perfusione ex vivoperiodo 33. In sintesi, ex vivo perfusione del fegato è una nuova strategia per ridurre al minimo freddo danno ischemico e di valutare fegati marginali prima del trapianto di fegato. L&#39;impostazione di perfusione ex vivo offre un&#39;opportunità unica per riparare e condizioni innesti prima del trapianto.

Il trapianto di fegato è l&#39;unica opzione di trattamento per i pazienti con malattia epatica allo stadio terminale o carcinoma epatocellulare avanzato. Per gli ultimi 25 anni, il numero di lista d&#39;attesa candidati è progressivamente aumentato e superato il numero di innesti disponibili. Il numero di donatori di cuore battere è diminuito negli ultimi dieci anni. Allo stesso tempo, il numero di innesti marginali, come donazione dopo morte cardiaca (DCD), nonché fegati vecchi e grassi sono aumentati 1,2. Innesti marginali sono spesso diminuiti per il trapianto di fegato a causa della maggiore probabilità di trapianto primaria funzione di mancato o ritardato. In innesti DCD, sviluppo di tipo ischemico stenosi biliari (ITB) è di particolare interesse. Con la tecnica di conservazione a freddo statico convenzionale, ITBS si verificano in circa il 10-40% degli innesti DCD. Nella maggior parte dei pazienti, ITBS porta a ri-trapianto o morte del paziente. Soprattutto i tempi d&#39;ischemia caldi e freddi prolungati sono il rischio difattori per ITBS 3-7. Età del donatore, predisposizioni genetiche (come CCR5 delta 32), e la scelta della soluzione di conservazione sono stati anche discussi come fattori di rischio aggiuntivi 7-10. Microtrombosi parziale delle navi peribiliari è stato suggerito come potenziale meccanismo per ITBS dopo trapianto di fegato con DCD innesti 11. Prima dell&#39;introduzione clinica di trapianto di fegato, ex vivo perfusione del fegato sono stati utilizzati per studiare il metabolismo epatico e la fisiologia 12,13. Dopo il trapianto di fegato ha trovato la sua strada nel contesto clinico nel 1960, innumerevoli tentativi sono stati fatti per utilizzare ex vivo perfusione epatica come metodo di conservazione imitando condizioni di nutrizione e ossigenazione fisiologici. La sua utilità per la conservazione di innesti marginali è stato studiato negli ultimi dieci anni, ma non ha raggiunto la cura clinica standard. Abbiamo recentemente descritto una riduzione della lesione del dotto biliare in DCD trapianto di fegato da ex vivo perfuso conservazione 14. Sono stati effettuati diversi approcci per quanto riguarda la soluzione di perfusione. L&#39;offerta spazia da soluzioni cellulari come sangue intero dal donatore o globuli rossi concentrati in combinazione con plasma umano, ad approcci acellulari come macchina Università del Wisconsin soluzione, soluzione IGL, o la soluzione Steen 14-19. La temperatura varia 4-37 ° C 20. La nomenclatura in ipotermico, subnormothermic, e normotermica è molto variabile e incoerente. Tutte le diverse tecniche, soluzioni e impostazioni della temperatura mirano a 1) condizioni di perfusione stabili, 2) ossigenazione sufficiente, e 3) ripristino della funzione d&#39;organo. Una capacità di conservazione maggiore, nonché la capacità di valutazione dell&#39;organo e del trattamento durante la perfusione normotermica e subnormothermic volti maggiore complessità tecnica e costi rispetto alla perfusione ipotermica 20,21. Abbiamo sviluppato un sistema di perfusione ex vivo fegato subnormothermic nel corso degli ultimi 4 anni. Il sistema può essere utilizzato per 1) &quot;ricaricare&quot; il contenuto energetico epatica, 2) per valutare la qualità del trapianto, e 3) riparare i fegati marginali prima del trapianto. Il protocollo seguente contiene tutte le informazioni per una perfusione epatica stabile.

<table><tbody><tr><td>circuito</td><td>Maquet (Hirrlingen, GER)</td>serbatoio principale <td>su misura</td><td>(3 L, 3/8" di uscita) 
serbatoio a portale (1,5 L, 1/4", deflusso) 
pompa centrifuga 
Ossigenatore 
Filtro per licaci </td></tr><tr><td>Tubi (1/4" x 1/16")</td><td>Raumedic (Helmbrechts, GER)</td><td>MED7506</td><td></td></tr><tr><td>Tubi (3/8" x 3/32")</td><td>Raumedic (Helmbrechts, GER)</td><td>MED7536</td><td></td></tr><tr><td>Connettori per tubi</td><td>Raumedic (Helmbrechts, GER)</td><td></td><td>varie misure</td></tr><tr><td>Filtro per dialisi, Optiflux F160NR</td><td>Fresenius Medical Care (Waltham, MA)</td><td>F160NR</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione STEEN</td><td>XVIVO (G&ouml; teborg, SWE)</td><td>19004</td><td>2 L</td></tr><tr><td>Concentrato di acido per dialisi A</td><td>Baxter (Mississauga, ON)</td><td>D12188M</td><td>45 ml</td></tr><tr><td>di amminoacido, Travasol 10%</td><td>Baxter (Mississauga, ON)</td><td>JB6760</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P2256</td><td>1,1 g</td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sandoz Canada Inc (Toronto, ON)</td><td>10750</td><td>40.000 iU</td></tr><tr><td>Calcio gluconato</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada (Richmond Hill, ON)</td><td>C31110</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Insulina ad azione rapida</td><td>vari fornitori</td><td>1.000</td><td></td></tr><tr><td>iU Cefazolina</td><td>vari fornitori</td><td></td><td>1 g</td></tr><tr><td>Metronidazolo</td><td>Baxter (Mississauga, ON)</td><td>JB3401</td><td>500 mg</td></tr></tbody></table>

tecnica di subnormothermic<em&gt; ex vivo</em&gt; fegato perfusione per la conservazione, valutazione e riparazione dei marginali fegato innesti

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Il successo del trapianto di fegato ha portato a una drammatica carenza di organi. Nella maggior parte delle regioni di trapianto il 20-30% dei pazienti in lista d&#39;attesa per trapianto di fegato muoiono senza ricevere un trapianto d&#39;organo o di esclusione dalle negoziazioni per la progressione della malattia. Una strategia per aumentare il pool dei donatori è l&#39;utilizzo di innesti marginali, come i fegati grassi, innesti da donatori di età superiore o donazione dopo la morte cardiaca (DCD). La tecnica di conservazione attuale di archiviazione statica a freddo è solo mal tollerato dai fegati marginali con conseguente significativo danno d&#39;organo. Inoltre, Cold Storage organo statico non consente la valutazione del trapianto o la riparazione prima del trapianto. Queste carenze di conservazione statica a freddo hanno innescato un interesse a caldo la conservazione di organi perfusi per ridurre il freddo danno ischemico, valutare innesti fegato durante la conservazione, e di esplorare la possibilità di riparare i fegati marginali prima del trapianto. Le pres ottimalisicuri e condizioni di flusso, temperatura perfusione, la composizione della soluzione di perfusione e la necessità di un vettore di ossigeno è stata controversa in passato. Nonostante i risultati promettenti in diversi studi su animali, la complessità ed i costi hanno impedito una più ampia applicazione clinica finora. Recentemente, con una maggiore tecnologia e una migliore comprensione della fisiologia epatica durante la perfusione ex vivo l&#39;esito della perfusione epatica caldo è migliorata e sempre buoni risultati possono essere raggiunti. Questo documento fornisce informazioni sulle recupero fegato, tecniche di memorizzazione, e isolato perfusione epatica nei suini. Noi illustreremo a) i requisiti per garantire l&#39;apporto di ossigeno sufficiente per l&#39;organo, b) considerazioni tecniche sulla macchina di perfusione e la soluzione di perfusione, e c) aspetti biochimici di organi isolati.

Qui di seguito, presentiamo i risultati di cinque esperimenti di perfusione con DCD-innesti dopo 45 min caldo- e ischemia 4 ore a freddo prima dell&#39;inizio del subnormothermic perfusione ex vivo. L&#39;obiettivo principale per una perfusione epatica ex vivo è assicurare un sufficiente apporto di ossigeno per l&#39;organo. L&#39;ischemia provoca vasocostrizione, aumentando così la resistenza perfusione. Il raggiungimento di flussi vascolari costanti con pressioni stabili è un buon indicatore di adeguata ossigenazione. Durante un periodo di induzione di 1-2 ore la soluzione di perfusione e l&#39;organo sono riscaldati a 33 ° C, che deceases la resistenza vascolare del fegato. Una volta che la temperatura nominale di 33 ° C si ottiene, valori di flusso livello ad un intervallo costante, quasi fisiologica per il resto del tempo perfusione 6 ore (Figure 3A-3D). Allo stesso tempo, l&#39;organo diventa metabolicamente attiva. Figura 4A mostra il venosa pO &lt;sub&gt; 2, un indicatore di consumo di ossigeno. Entro i primi 2 hr le venosi pO 2 declini ad un plateau costante. A questo stato metabolicamente attiva, il fegato inizia la produzione di bile (Figura 4B). Il dializzatore fornisce una omeostasi elettrolitica bilanciata (Figure 4C-4D). Un iperkaliemia iniziale viene rapidamente livellato. Misurazione AST online serve come monitoraggio di danno epatocellulare. Figura 5 visualizza solo un poco profondo aumento AST lineare per tutto il periodo di perfusione. Colorazione H &amp; E dopo 6 ore di perfusione rivela necrosi epatocitaria &lt;5% con un lobulare intatta e la struttura sinusoidale (Figura 6). Colorazione PAS nello stesso punto temporale mostra rifornito accumulo di glicogeno cellulare rispetto allo stoccaggio esausto in conservate DCD-innesti a freddo (Figura 7). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig3highres.jpg" /> Figura 3 flussi di perfusione e la pressione (n = 5, barre di errore indicano la deviazione standard). (A, B) arteria epatica (HA) di flusso e pressione: Durante la fase di riscaldamento in 1-2 ore, il flusso aumenta a pressioni stabili ed è costante in seguito. Guardando la diminuzione della pressione venosa portale (C), l&#39;incremento di HA flusso verso la fine della perfusione potrebbe essere una reazione di autoregolazione del fegato. (C, D) Il portale venosi (PV) flusso aumenta corrispondenti al flusso di HA durante le prime 2 ore di riscaldamento. Le pressioni rimangono relativamente stabili. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig4highres.jpg" /> Figura 4. parametri di controllo (n = 5, barre di errore indicano la deviazione standard). (A) Il venoso pO 2 come marcatore di richiesta di ossigeno e l&#39;attività metabolica diminuisce nella fase iniziale di riscaldamento dovuto alla cellula attivatar metabolismo; rimane stabile dopo (B) produzione di bile come marker di attività metabolica inizia a temperature intorno ai 30 ° C e, quindi, tra la prima e la seconda ora di perfusione (C, D) Il dializzatore assicura elettrolita omeostasi..; un iperkaliemia iniziale è rapidamente equilibrata. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig5highres.jpg" /> Figura 5 AST (n = 5, barre di errore indicano la deviazione standard) AST è un marker sensibile di danno epatocellulare.; la bassa crescita suggerisce alcun pregiudizio significativo durante la perfusione ex vivo. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig6highres.jpg" /> Figura 6 colorazione H &amp; E (20X di ingrandimento). (A) del campione Sham fegato prima di ischemia calda, un lobulo rappresentante fegato con architectur intattoe. (B) Fegato campione dopo 45 min di ischemia calda, 4 ore di ischemia fredda, e 6 ore di perfusione subnormothermic, l&#39;architettura lobulare è intatto senza necrosi e una minima rigonfiamento cellulare, gli spazi sinusoidali sono leggermente dilatati rispetto alla campioni sham.

Innesti marginali, come fegati grassi, innesti da donatori di età superiore o fegati prelevati dopo la morte cardiaca (DCD) tollerano stoccaggio statico convenzionale, freddo solo male. Abbiamo sviluppato un nuovo modello di subnormothermic ex vivo perfusione epatica per la conservazione, la valutazione, e la riparazione di fegati marginali prima del trapianto.

Tecnica di Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Fegato perfusione per la Conservazione, valutazione e riparazione dei marginali fegato innesti

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

Lo scopo di questa procedura è quello di preservare e valutare un trapianto epatico in condizioni quasi fisiologiche. Ciò si ottiene recuperando prima l'innesto di fegato da un maiale donatore. Nella seconda fase, il fegato viene incannulato, quindi l'innesto viene collegato al circuito di perfusione ex vivo.Nella fase finale, le proprietà di perfusione e le caratteristiche dell'innesto epatico vengono monitorate per il tempo di perfusione desiderato. In definitiva, i livelli di aspartato aminotransferasi o a ST e le analisi istologiche delle biopsie parenchimali vengono utilizzate per dimostrare la conservazione della lesione e la vitalità dell'innesto epatico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi di conservazione esistenti, come la cosiddetta conservazione statica, è che la conservazione in condizioni fisiologiche comporta meno lesioni da conservazione e consente la valutazione funzionale e il trattamento dell'innesto prima del trapianto d'organo vero e proprio.Immediatamente dopo aver indotto la morte cardiaca per somministrazione di cloruro di potassio, raccogliere 1,6 litri di sangue da un maiale maschio dello Yorkshire di 30-35 chilogrammi in sacche CPDA, chiudere l'addome, lasciare il fegato intra addominale per 45 minuti per indurre il danno ischemico caldo immediatamente prima della fine dell'ischemia calda. Anche in questo momento incannulare l'aorta e la vena porta con linee di lavaggio dell'organo. Utilizzare la doppia perfusione tramite la pressione dell'aorta e le sacche a portale per gravità per lavare il fegato con la soluzione dell'Università del Wisconsin.Quindi tagliare il fegato dal maiale, lasciando lunghi tutti i vasi rimanenti e metterlo in una sacca per organi. Incannulare le parti sopra e infraepatiche dello speleologo della vena inferiore con riduttori da mezzo pollice per tre ottavi di pollice con un blocco dell'esca. Incannulare la vena porta e l'arteria epatica con tre ottavi di pollice per un quarto di pollice e un quarto di pollice per tre ottavi di pollice.Si riduce anche con un blocco dell'esca in questo momento. Quindi chiudere la sacca e conservare il fegato in ghiaccio fino alla perfusione. Per impostare il circuito di perfusione ex vivo, collegare il deflusso di un serbatoio principale a una pompa centrifuga e a un ossigenatore commerciale dietro l'ossigenatore.Dividi il tubo in due linee. Collegare una linea a un dializzatore che scarica nuovamente nel serbatoio principale. Collegare l'altra linea a un filtro di riduzione dei leucociti.Dividere la linea dopo la riduzione leucocitaria Filtrare in una linea arteriosa per fornire il perfuso otto all'arteria epatica e in una linea venosa porta per fornire il perfuso otto a un secondo serbatoio che drena nella vena porta per deflusso per gravità. Bloccare l'afflusso del portale e quindi collegare la linea arteriosa a un'ansa di speleologia della vena che drena nel serbatoio principale. Per la raccolta dei liquidi, impostare la temperatura di avviamento del circuito e del bagnomaria a 20 gradi Celsius.Quindi coprire il bagno con una membrana impermeabile per raccogliere l'ascite o la fuoriuscita dell'otto perfuso. Collegare una linea di aspirazione azionata da una pompa a rulli al serbatoio principale. Quindi rilasciare il morsetto di deflusso dal serbatoio principale e riempire il circuito con la soluzione di perfusione.Avviare la pompa centrifuga a 1.500 giri al minuto, assicurandosi che tutta l'aria venga espulsa dal circuito. Quindi attivare l'alimentazione del gas all'ossigenatore. Collegare il fegato al circuito è la parte più complicata della procedura.Fare attenzione a evitare l'attorcigliamento del tubo e a rimuovere eventuali bolle per evitare impedimenti al deflusso del fegato. Anche il livello del serbatoio del portale deve essere seguito attentamente. Non deve mai funzionare a vuoto.Rimuovi il fegato dal ghiaccio e sciacqua la soluzione dell'Università del Wisconsin con soluzione salina. Quindi posizionare il fegato sulla membrana sopra il bagnomaria. Ridurre la velocità della pompa centrifuga a 1000 giri al minuto e posizionare due morsetti sul lato arterioso dell'anello dello speleologo della vena.Quindi tagliare il tubo tra i morsetti e collegare entrambi i deflussi dello speleologo della vena alla linea dello speleologo della vena. Rilasciare il morsetto dalla linea arteriosa. Versare l'otto perfuso nella cannula arteriosa per eliminare le bolle e collegare la linea alla cannula.Aumentare la pompa centrifuga a 1.500 giri al minuto e rilasciare il secondo morsetto dalla linea della grotta di Venner e rilasciare il morsetto dal serbatoio venoso portale per riempirlo. Lasciare che la soluzione di perfusione si riversi nella cannula portale e poi collegarla. Avendo cura di mantenere stabili i livelli del fluido nel serbatoio del portale.Dopo aver collegato il fegato al circuito, aumentare la temperatura del bagnomaria a 33 gradi Celsius nei successivi 60 minuti. Puntare a un flusso arterioso iniziale di circa 250 millilitri al minuto a 40 millimetri di mercurio. Questo può raggiungere i 700 millilitri al minuto durante la perfusione.Una volta aumentata la pressione fino a 70 millimetri di mercurio, puntare a un flusso della vena di porta da 500 a 600 millilitri al minuto a tre o cinque millimetri di mercurio. Dopo aver aumentato la temperatura, il flusso venoso aumenterà fino a 1.100 millilitri al minuto. Abbassare il serbatoio principale per impostare il deflusso a meno due milligrammi di mercurio per prevenire la congestione epatica dovuta all'ostruzione funzionale del deflusso, assicurandosi che non rimangano impigliate bolle d'aria nel tubo caval.Impostare il flusso di otto dialisi a 500 millilitri all'ora. Avendo cura di regolare il deflusso della dialisi in modo che PERFUSE eight non sia né diluito né concentrato. Mantenere un pH basso durante l'inizio della perfusione per proteggere l'organo.Regolare continuamente la pressione parziale dell'anidride carbonica fino a 25-30 millimetri di mercurio in modo che il pH raggiunga un livello fisiologico entro un'ora. Per imitare le condizioni fisiologiche, iniettare continuamente glucosio e insulina nella vena porta. Iniettare con cura il bicarbonato di sodio o di potassio nel circuito sotto controllo ripetitivo del sangue, dei gas e degli elettroliti e monitorare la perfusione mediante analisi periodiche del sangue venoso e arterioso e delle ST.Monitorare il flusso vascolare e la pressione. Una perfusione stabile manterrà costante la resistenza vascolare alla fine del periodo di perfusione ex vivo. Chiamare il sistema di perfusione verso il basso, quindi dopo aver scollegato il tubo dal fegato, sciacquare il PERFUSE otto due volte fuori dal fegato con una soluzione ghiacciata dell'Università del Wisconsin.Infine, conservare il fegato in ghiaccio in una sacca sterile per organi prima del trapianto. Ottenere flussi vascolari costanti con pressioni stabili è un buon indicatore di un'adeguata ossigenazione. Una volta raggiunta la temperatura target di 33 gradi Celsius, i valori di flusso si stabilizzano in un intervallo costante, quasi fisiologico per il resto del periodo di perfusione, allo stesso tempo l'organo diventa metabolicamente attivo.Questo grafico mostra la pressione parziale venosa dell'ossigeno, un indicatore del consumo di ossigeno. Entro le prime due ore, la pressione parziale venosa dell'ossigeno scende fino a un plateau costante. In questo stato metabolicamente attivo, il fegato inizia a produrre bile e il dializzatore fornisce un'omeostasi elettrolitica bilanciata.La misurazione online dell'A ST funge da monitor del danno cellulare epatico. Ad esempio, in questo esperimento, si osserva solo un lieve aumento del tratto ST A durante l'intero periodo di perfusione. La colorazione H ed E dopo sei ore di perfusione rivela una necrosi degli epatociti inferiore al 5% con una struttura lobulare e sinusoidale intatta.La colorazione BAS di un fegato perfuso ex vivo nello stesso punto temporale dimostra una riserva di glicogeno cellulare reintegrata rispetto alla conservazione esaurita osservata nei trapianti di morte cardiaca di donatori conservati a freddo. Dopo questa procedura, è possibile eseguire un modello di riperfusione d'organo come un trapianto di fegato per studiare l'effetto della perfusione epatica ex vivo sul danno da riperfusione e sulla funzione d'organo.

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Lo studio della fisiologia degli organi animali può essere ottenuto eseguendo un sistema sperimentale di perfusione ex vivo. L'aggiunta di un rene suino, come organo omeostatico, al nostro modello di perfusione epatica ex vivo precedentemente sviluppato, può essere un passo fondamentale per ottenere un ambiente fisiologico migliore.

Fasi per l'esperimento esperimento epatico-renale suino autologo ex vivo perfuso

Qui vi presentiamo un protocollo che descrive ossigenato ex situ macchina di perfusione di fegati donatore. Questo articolo contiene un passo per passo protocollo di procurarsi e preparare il trapianto di fegato per la macchina di perfusione, preparare il liquido di perfusione, primo la macchina di perfusione ed eseguire ossigenato normotermica macchina perfusione del trapianto di fegato.

Ex Situ normotermica macchina di perfusione di Vivi donatori

Descriviamo un metodo di ex vivo macchina perfusione di innesti di fegato umano a temperatura subnormothermic (21 ° C).

Umana Funzionale Fegato Conservazione e recupero mediante Subnormothermic macchina di perfusione

La grave carenza di organi ha portato ad un maggiore uso di innesti renali marginali per il trapianto. Ciò ha scatenato l'interesse in metodi di deposito alternativi, dal momento che gli innesti marginali soprattutto tollerare celle frigorifere male. La tecnica di normotermica ex vivo perfusione renale (NEVKP) rappresenta un metodo di conservazione romanzo per trapianti di rene prima del trapianto.

Normotermica<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Rene perfusione per la Preservazione della Kidney Innesti prima del trapianto

C'è una carenza significativa donatore di fegato, e i criteri per i donatori di fegato sono stati ampliati. Perfusione normotermica ex vivo del fegato (NEVLP) è stato sviluppato per valutare e modificare la funzione dell'organo. Questo studio dimostra un modello del ratto di NEVLP e verifica la capacità di pegylated-catalasi, per attenuare la lesione di conservazione del fegato.

Un piccolo modello animale di aspersione epatica normotermica Ex Vivo

La perfusione macchina ex vivo normomica (NEVP) è stata scarsamente esplorata per la conservazione degli allotrapianti pancreatici. Presentiamo una tecnica di conservazione innovativa per gli allotrapianti del pancreas prima del trapianto.

Perfusione Pancreatica Ex Vivo Normothermic per la Conservazione degli Allotrapianti Pancreatici prima del Trapianto

Il modello suino di perfusione meccanica normotermica epatica (NMP), qui descritto, può essere utilizzato con successo per studiare l'NMP come strategia di conservazione, strumento per la valutazione della vitalità e piattaforma per la riparazione d'organo. Ha un alto valore traslazionale, tuttavia è tecnicamente impegnativo e laborioso.

Perfusione epatica isolata normotermica suina

È stato creato un sistema di perfusione epatica normotermica ex vivo (NEVLP) per i fegati di topo. Questo sistema richiede esperienza in microchirurgia, ma consente risultati di perfusione riproducibili. La capacità di utilizzare fegati di topo facilita lo studio dei percorsi molecolari per identificare nuovi additivi perfufulati e consente l'esecuzione di esperimenti incentrati sulla riparazione degli organi.

Perfusione della macchina epatica Normothermic Ex Vivo nel topo

Questo protocollo delinea la metodologia per stabilire un modello suino che utilizza la perfusione meccanica (MP) a temperatura variabile e controllata per la conservazione del fegato del donatore, seguita dal trapianto di fegato ortotopico (OLTx). Mira a promuovere il tasso di successo di OLTx utilizzando la donazione di donatori dopo la morte circolatoria (DCD) del fegato e stabilire un modello stabile.

Conservazione della donazione suina dopo morte circolatoria (DCD) Fegato mediante perfusione e trapianto ortotopico di fegato

Qui, presentiamo un protocollo su come eseguire una perfusione epatica isolata (IHP) con melfalan e discutiamo anche l'IHP come opzione di trattamento per le metastasi epatiche del melanoma uveale.

Isolata epatica perfusione come Trattamento di metastasi epatiche di melanoma uveale

Impara la tecnica di perfusione subnormotermica ex vivo del fegato per preservare e valutare innesti marginali prima del trapianto. Questo metodo riduce il danno da conservazione rispetto allo stoccaggio statico freddo.

Tecnica di Subnormothermic Ex Vivo Fegato perfusione per la Conservazione, valutazione e riparazione dei marginali fegato innesti (Video) | JoVE Journal

Tecnica di Subnormothermic

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