Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di etichettare e quantificare in modo fluorescente la quantità di RNA nascente prodotta in condizioni di trattamento utilizzando l'analisi di imaging quantitativa per raggiungere questo obiettivo. Le cellule coltivate placcate sul vetro di copertura sono trattate con la base modificata con alcherina. Cinque uridina etale denominate di seguito cinque UE e incubate in condizioni di ipossia.

Durante l'incubazione, il five EU viene incorporato durante la sintesi dell'RNA senza interrompere il meccanismo di trascrizione cellulare. Successivamente, il cinque EU incorporato viene quindi marcato in fluorescenza eseguendo un'azide catalizzata dal rame in un'edizione ciclologica o una reazione a clic. L'RNA nascente marcato in fluorescenza viene quindi visualizzato mediante microscopia a fluorescenza e le immagini risultanti vengono analizzate per confrontare la quantità di RNA generata in condizioni di trattamento e controllo.

L'analisi statistica dei dati risultanti mostra i cambiamenti nella generazione di RNA nascente in risposta all'ipossia attraverso la quantificazione di cinque incorporazioni UE e il rilevamento mediante microscopia a fluorescenza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il BCR quantitativo, è che consente la visualizzazione diretta della produzione di RNA nelle cellule a livello di singola cellula. Sebbene qui usiamo questo metodo per studiare come le cellule rispondono a un basso livello di ossigeno, può anche essere utilizzato per studiare le risposte ai farmaci chemioterapici.

Le nostre risposte a ulteriori risposte allo stress che dimostrano una procedura saranno John Leston, uno studente laureato del mio laboratorio con l'aiuto di ish Kova, anche lui uno studente laureato, e Humana Druker, un borsista post-dottorato. Infine, Gus Ferguson dimostrerà l'uso del software di visualizzazione delle immagini. Inizia questo esperimento immergendo diversi vetrini coprioggetti in etanolo al 70% per sterilizzarli.

Posizionare i vetrini di copertura sul bordo di una piastra nella cappa di coltura tissutale e lasciarli asciugare all'aria sotto flusso laminare. Una volta che i vetrini coprioggetto sono asciutti, metterne uno in ciascuno dei sei piatti da 3,5 centimetri. Aggiungere due millilitri di DMEM completo caldo a ogni piatto.

Premere con una pinza per assicurarsi che ogni vetrino coprioggetti rimanga aderente al fondo del pozzetto. Successivamente, staccare le cellule U2 OS dal piatto di coltura tissutale, lavare una volta con tre millilitri di PBS. Quindi applicare quattro millilitri di tripsina calda allo 0,05%, EDTA all'1% e incubare a 37 gradi Celsius per sette minuti.

Trascorsi sette minuti, sospendere le cellule in sei millilitri di DMEM completo caldo per inattivare la tripsina EDTA. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e seminare ciascuna delle piastre da 3,5 centimetri contenenti vetrini coprioggetti con due volte 10 alla quinta cellula. Agitare delicatamente la capsula per garantire una distribuzione uniforme delle cellule, incubare durante la notte a 37 gradi Celsius, 21% di ossigeno, 5% di anidride carbonica per consentire alle cellule di aderire.

Il giorno successivo, rimuovi cinque delle piastre dall'incubatrice. Lasciare indisturbato il piatto rimanente. Sarà usato come controllo positivo normossico.

Posizionare quattro dei piatti nella postazione di lavoro per l'ipossia. Esporre le cellule a condizioni ipossiche per 75 minuti, 90 minuti, due ore e 24 ore. All'altro piatto.

Aggiungere l'acton micina D al terreno fino a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e rimetterlo nell'incubatore a 37 gradi in condizioni normali di ossigeno per quattro ore. Questo piatto funziona come il controllo negativo normossico. Durante l'incubazione delle cellule, preparare e raccogliere i seguenti reagenti in preparazione del test click it.

Il kit di analisi a scatto: PBS a un pH compreso tra 7,2 e 7,6, 3,7%Aldeide paraforma in PBS 1%Triton X 100 in acqua deionizzata PBS, dimetilsolfossido di solfossido 10 molari, acido cloridrico al 37% e strisce indicatrici di pH. Dovresti pianificare di essere pronto per iniziare un test etichettato in condizioni sottotrattate. Un'ora prima della fine del trattamento di ipossia Per marcare le cellule, preparare una soluzione di lavoro di due x UE dal ceppo da 100 millimolari in terreno completo di preriscaldamento.

Quindi, aggiungere un volume uguale di due XEU al terreno nella capsula contenente le cellule trattate con acton micina D, diluendo così l'EU alla concentrazione di lavoro. Quindi, nella camera dell'ipossia, aggiungere lo stock UE alle cellule trattate con ipossia. Incubare per un'ora in condizioni di coltura cellulare in trattamento dopo il trattamento con ipossia o dopo quattro ore per i controlli.

Lavare ogni piatto una volta con PBS e aggiungere un millilitro del 3,7% di aldeide Paraform in condizioni di trattamento, incubare per 15 minuti in condizioni di trattamento. Dopo il fissaggio, rimuovere le celle dalla camera di ipossia e posizionarle nella cappa aspirante. Versare il fissativo avendo cura di smaltire in modo responsabile i rifiuti di paraformaldeide.

Quindi lavare le celle una volta con PBS. Eseguire i passaggi successivi a temperatura ambiente, mantenendo tutte le soluzioni in ghiaccio a una temperatura compresa tra due e sei gradi Celsius. Successivamente permeare le cellule, rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere un millilitro di tritton X 100 all'1% in PBS a ciascuna, incubare bene per 15 minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere il tampone di permeazione e lavare ogni pozzetto una volta con PBS. Rimuovere la soluzione di lavaggio dalle cellule e aggiungere 500 microlitri di cocktail di reazione del kit di imaging dell'RNA appena preparato a ciascun campione. Proteggere le cellule dalla luce e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, rimuovere la reazione del kit di imaging dell'RNA, il cocktail e lavare. Una volta che con un millilitro di RNA del kit di imaging della reazione, risciacquo, tampone, qualsiasi ulteriore marcatura degli anticorpi deve essere eseguita in questo momento. Per colorare il DNA, lavare i campioni con PBS, quindi diluire l'herst 3, 3, 3, 4, 2 a uno a 1000.

Nella PBS, aggiungere a ciascuno un millilitro della soluzione di HERC diluita. Proteggere bene dalla luce e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di HERC e lavare le cellule due volte con PBS per montare i vetrini.

Posizionare 10 microlitri di terreno di montaggio al centro di un microscopio standard. Far scorrere e posizionare la cella del vetrino coprioggetto con il lato rivolto verso il basso sulla goccia del supporto di montaggio. Evitare di generare bolle in quanto ciò oscuri la successiva acquisizione dell'immagine.

Applicare lo smalto trasparente per unghie sul perimetro del vetrino coprioggetti per fissarlo al vetrino del microscopio. Lasciare asciugare la vernice per cinque minuti a temperatura ambiente. Al riparo dalla luce, i campioni possono essere conservati a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius.

Dopo il montaggio, acquisire immagini utilizzando un microscopio ad ampio campo in grado di rilevare la fluorescenza. Esegui l'imaging utilizzando un obiettivo a immersione in olio da 40 V 1,30 NA e acquisisci immagini con un'immagine della telecamera CCD raffreddata. Un minimo di 30 celle dopo l'acquisizione dell'immagine.

Utilizzare un software di elaborazione delle immagini per devolvere le immagini. Questo correggerà la distorsione ottica applicando una formula matematica basata su software alle immagini acquisite. Il risultato è un'immagine più chiara che garantirà che l'analisi successiva sia limitata alle sole cellule visualizzate.

Quindi, importa le immagini nel client Omer O. Le miniature di tutte le immagini ottenute verranno visualizzate accanto a normalizzare le impostazioni di rendering per tutte le immagini nello stesso esperimento. Applica le impostazioni di rendering delle celle normossiche di controllo a tutte le altre condizioni utilizzando lo strumento ROI della regione di interesse nel software di analisi.

Seleziona i nuclei da ogni immagine nel software. Scegli l'opzione di analisi dell'intensità e ottieni intensità medie per ogni ROI da 30 a 50 celle. Salva i dati e quindi calcola la media e lo standard per ogni condizione.

Infine, l'utilizzo di un software di grafica dei dati costruisce grafici a dispersione di tutti i singoli valori di intensità media per riflettere la variabilità tra le celle in ciascuna condizione. Tracciare i dati di intensità in questo modo è utile perché consente un rapido confronto dei risultati del trattamento e dimostra chiaramente una significativa eterogeneità all'interno di una popolazione di cellule di trattamento che altrimenti sarebbe oscurata utilizzando la rappresentazione standard dei dati. In alternativa, costruire grafici a barre per rappresentare l'intensità media media più la deviazione standard dell'RNA nascente per determinare quantitativamente la sintesi dell'RNA totale Le cellule OS U2 trattate con ipossia e coltivate in presenza di cinque uridina o EU sono state quindi elaborate e analizzate.

Come dimostrato in questo video, è stata calcolata la media e tracciata l'intensità della fluorescenza di tutte le cellule all'interno di ciascuna popolazione di trattamento. In questo grafico a barre, il test T di uno studente è stato utilizzato per calcolare la probabilità statistica che ciascun gruppo di trattamento differisca significativamente dal controllo. È interessante notare che questi dati mostrano che c'è un aumento statisticamente significativo della sintesi globale di RNA nel tempo.

Quando le cellule OS U2 vengono trattate con ipossia per più di un'ora e mezza come previsto, il trattamento con ACTO micina D abla completamente l'intensità della fluorescenza. Questi dati suggeriscono che dopo periodi più lunghi di trattamento con ipossia, la cellula concentra i suoi sforzi sulla produzione di RNA, anche in questo ambiente ipossico ostile. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare e quantificare l'RNA nascente a livello di singola cellula in ipossia e normossia una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore dopo questa procedura.

Altri metodi, come la cocolorazione con anticorpi per l'RNA polimerasi e l'HIF, possono essere eseguiti per determinare se i livelli di RNA polimerasi sono alterati e se l'HIF è attivato. Non dimenticare che lavorare con la formaldeide può essere estremamente pericoloso durante l'esecuzione di questa procedura. Assicurati sempre di indossare i guanti e di lavorare in una cappa aspirante.