Name: Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Scopri come analizzare la sintesi globale di RNA a livello di singola cellula in condizioni di ipossia utilizzando la marcatura con click-chemistry e la microscopia a fluorescenza.

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JB è un collega clinico CRUK, AS è uno studente di dottorato Wellcome Trust, il laboratorio di SR è finanziato da un CRUK Senior Research Fellowship (C99667/A12918). Questo lavoro è stato supportato da due Wellcome Trust Awards strategici (097945/B/11/Z e 095931/Z/11/Z).

1. Cella Cultura e trattamento <ol><li> Raccogliere i reagenti e attrezzature elencati nella tabella 1 alla cultura osteosarcoma umano (U2OS) cellule. Preparare tutti i reagenti e condurre tutte le tecniche di coltura tissutale nella cappa a flusso laminare per garantire la sterilità </li><li> Preparare il terreno di coltura come segue: aggiungere 50 ml di FCS, 5 ml di L-glutammina e 5 ml di penicillina / streptomicina alla DMEM per ottenere concentrazioni finali di 10% (FCS), 2 mM (L-glutammina), 50 U / ml ( penicillina) e 50 U / ml (streptomicina). Riscaldare il terreno di coltura a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Preparare le cellule per il trattamento: <ol><li> Sterilizzare diversi coprioggetto in etanolo al 70%, lasciare asciugare e posizionare uno sul fondo di sei piastre 3,5 cm. </li><li> Immergere i coprioggetti in 2 ml riscaldati DMEM completa (37 ° C), premendo con le pinze coprioggetto per garantire che essi rimangano aderito al fondo dei pozzetti. </li><li> Staccare le cellule U2OS dal loro culto tessutopiastra ure lavando una volta con 3 ml di PBS, applicando 4 ml riscaldato 0,05% tripsina-EDTA (1%) e incubando a 37 ° C per 7 minuti. </li><li> Risospendere le cellule in 6ml riscaldato completo DMEM per inattivare la tripsina-EDTA e contare con un emocitometro. </li><li> Piastra 2 x 10 5 cellule a ciascuna delle piastre cm 3,5 preparate al punto 1.3.1. Agitare delicatamente la piastra per garantire una distribuzione delle cellule ancora. Permettono alle cellule di aderire notte prima del trattamento. </li></ol></li><li> Trattare le cellule ponendo quattro piastre 3,5 cm nella workstation ipossia e lasciare gli altri due piastre 3,5 cm di incubatrice a 37 ° C in condizioni normali dell&#39;ossigeno. Essere pronta ad avviare l&#39;RNA etichettatura saggio in condizioni trattati (nella camera di ipossia per le cellule trattate ipossia) 1 ora prima del trattamento ipossia termina. </li><li> Esporre cellule all&#39;ipossia per 1 h 15 min, 1 ora e 30 min, 2 ore e 24 ore. Questi punti temporali sono flessibili e determinato dall&#39;utente. </li><li> Utilizzare un normoxic piastra da 3.5 cm come controllo positivo e un normossia piastra 3,5 centimetri trattata con actinomicina D (10 mcg / ml concentrazione finale) per 4 ore come controllo negativo. Actinomicina D è un inibitore della sintesi dell&#39;RNA globale. </li></ol> Avvertenze: Hoechst 33342 è un agente mutageno conosciuto. DMSO è noto per facilitare l&#39;ingresso di molecole organiche nei tessuti. NaOH è corrosiva. HCl è corrosivo. Paraformaldeide è altamente tossico per tutti gli animali e può causare la morte negli esseri umani. Triton X-100 può causare irritazione della pelle a seguito di contatto diretto. Actinomicina D è tossico a contatto con la pelle e per ingestione. Prendere le opportune precauzioni quando si maneggia tutte le sostanze chimiche pericolose. 2. Click-iT Assay <ol><li> Raccogliere i seguenti reagenti necessari oltre al kit di analisi Istruzioni-iT: tampone fosfato salino (PBS) pH 7.2 - 7.6, 3.7% paraformaldeide (PFA) in PBS, 1% Triton X-100 In PBS, acqua deionizzata (dH 2 O), dimetilsolfossido (DMSO), 10 M di idrossido di sodio (NaOH) e acido cloridrico 37% (HCl); Strisce indicatrici di pH - opzionale. </li><li> Preparare una soluzione stock PFA fresco prima di eseguire la reazione di Click-iT come segue: <ol><li> Mettere 1,85 g PFA, 3,5 ml dH 2 O e 10 microlitri di10 M NaOH in un tubo Falcon da 50 ml. Bollire 300-400 ml di H 2 O in un grande bicchiere nel microonde per fare un bagno di acqua e sopportare questo in una cappa aspirante. </li><li> Posizionare il 50 ml Falcon in bagno di acqua e agitare delicatamente per 10 min, rilasciando periodicamente il coperchio finché il PFA è sciolta. </li><li> Siringa la soluzione PFA attraverso un filtro da 0,2 micron in un&#39;altra provetta Falcon da 50 ml, ottenendo così una soluzione 37%. </li><li> Diluire la 10x aggiungendo PBS e portare il pH a 6,8 con l&#39;aggiunta di circa 12 ml di HCl concentrato. Opzione: Confermare il corretto pH con le strisce indicatore della cappa. </li><li> Utilizzare immediatamente o conservare overnight a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparare le soluzioni madre del kit imaging RNA come segue: <ol><li> Aggiungere 373 microlitri dH 2 O al componente A con conseguente in una soluzione stock di 100 mm di UE. Conservare a -20 ° C per un massimo di un mese. </li><li> Aggiungere 85 ml di DMSO al componente B (Alexa Fluor 594) e mescolare pipettando o vortex. Conservare sia a -20 ° C per un massimo di un anno. </li><li> Aggiungere 2 ml dH 2 O per il componente e per creare una soluzione 10X dell&#39;additivo tampone di reazione kit imaging RNA. Conservare a -20 ° C per un massimo di un anno, scartare quando la soluzione si sviluppa un colore marrone. </li></ol></li><li> Etichettatura delle cellule con l&#39;UE: Preparare una soluzione di lavoro 2X dell&#39;UE dal magazzino 100 mM preparata nella fase 2.3 nel mezzo completo preriscaldata (37 ° C) Eseguire il resto di questo passo e passo 2,5 nella camera di ipossia delle cellule trattate con ipossia. . Diluire a 1X aggiungendo un volume uguale di questa soluzione di lavoro 2X per il cont mezziaining cellule. Incubare per 1 ora in trattamento condizioni di coltura delle cellule. </li><li> Fissazione delle cellule: Lavare ogni bene una volta con PBS e aggiungere 1 ml di 3,7% PFA magazzino preparate al passo 2.2 in condizioni di trattamento. Incubare per 15 min in condizioni di trattamento. I campioni trattati con ipossia possono essere rimossi dalla camera di ipossia a questo punto. Togliere il fissativo e lavare ogni pozzetto una volta con PBS (Prenditi cura di disporre di PFA sprecare responsabilmente). Eseguire le prossime tappe a temperatura ambiente. </li><li> Permeabilizzazione: Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere 1 ml di 1% Triton X-100 in PBS in ciascun pozzetto. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il buffer permeabilizzazione e lavare ogni pozzetto una volta con PBS. </li><li> Etichettato RNA Detection: <ol><li> Preparare una soluzione fresca 1X lavoro di additivo immagini RNA tampone di reazione kit diluendo la soluzione 10X (preparata nella fase 2.3) 1:10 con dH 2 O. </li><li> Preparare il kit imaging RNACocktail di reazione secondo la Tabella 2 per l&#39;uso subito dopo la preparazione. </li><li> Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere 500 ml di RNA di imaging cocktail reazione kit per ogni campione. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. </li><li> Rimuovere la rappresentazione RNA cocktail reazione kit e lavare una volta con 1 ml di RNA di imaging reazione kit tampone di lavaggio (componente F), quindi rimuovere la reazione kit buffer di risciacquo di imaging RNA. </li></ol></li><li> Reazione multiplex Optional: Eseguire etichettatura anticorpi supplementare di campioni, a questo punto secondo le raccomandazioni del fabbricante. </li><li> Colorazione DNA: Lavare i campioni con PBS quindi rimuovere la soluzione di lavaggio. Diluire la Hoechst 33342 (Component G) 1:1000 in PBS. Aggiungere 1 ml di diluito Hoechst 33342 in ciascun pozzetto ed incubare per 15 min a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Rimuovere la soluzione Hoechst 33342 e lavare le cellule due volte con PBS. Rimuovere la solutio lavaggion e procedere al microscopio ottico. </li></ol> 3. Microscopia ottica <ol><li> Mount Coprivetrini: <ol><li> Trasferire 10 ml di mezzo di fissaggio sul centro di un vetrino da microscopio standard. </li><li> Posizionare il coprioggetto con cella lato sul centro del vetrino da microscopio a coprire l&#39;aliquota di mezzo di montaggio. Fare attenzione ad evitare la formazione di bolle nel mezzo di montaggio come questo oscurare la successiva acquisizione delle immagini. </li><li> Attaccare il vetrino al vetrino da microscopio applicando smalto chiaro al suo perimetro. Lasciare asciugare per 5 minuti a temperatura ambiente. Proteggere dalla luce. I campioni possono essere conservati a -20 ° C in seguito montaggio. </li></ol></li><li> Acquisizione Image: Acquisire le immagini utilizzando un microscopio a grande campo in grado di rilevare la fluorescenza. Approssimativamente maxima emissione di fluorescenza / eccitazione per il colorante Alexa Fluor e Hoechst 33342 legato al DNA sono mostrati in Tabella 3. </li><li> Perform Imaging utilizza una lente immersione in olio 40X/1.30 NA e catturare immagini con una telecamera CCD raffreddata. </li></ol> 4. Analisi dei dati <ol><li> Deconvolve immagini utilizzando il software di elaborazione delle immagini (vedi tabella Materials) prima di importare al cliente OMERO. Normalizzare il rendering impostazioni per tutte le immagini nello stesso esperimento nel software microscopio visualizzazione e analisi d&#39;immagine applicando le impostazioni di rendering da cellule normossiche controllo di tutte le altre condizioni. </li><li> Utilizzare la regione di interesse (ROI) strumento nel software microscopio visualizzazione di immagini e analisi (vedi tabella materiali) per selezionare nuclei da ogni immagine. Avere intensità media per ogni ROI e calcolare la deviazione media e standard per ciascuna condizione scegliendo l&#39;opzione analisi intensità, compreso un numero compreso tra 30-50 cellule. </li><li> Costruire diagrammi a dispersione utilizzare un software di grafica di dati (vedi tabella Materials), riportando tutti i singoli valori di intensità medi ottenuti nella fase 4.2 to riflettere la variabilità tra le cellule sotto ogni condizione. In alternativa, costruire grafici a barre per rappresentare l&#39;intensità media media più la deviazione standard di RNA nascente. </li></ol>

<ol><li>Kenneth, N. S., Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gene+expression+by+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of gene expression by hypoxia.</a> Biochem J. 414, 19-29 (2008).</li>
<li>Appelhoff, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+function+of+the+prolyl+hydroxylases+PHD1%2C+PHD2%2C+and+PHD3+in+the+regulation+of+hypoxia-inducible+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor.</a> J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).</li>
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<li>Schodel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+genome-wide+mapping+of+HIF-binding+sites+by+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq.</a> Blood. 117, (2011).</li>
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</ol>

Il JRS è fondatore di Glencoe Software, Inc., una società commerciale statunitense open-source che contribuisce alla OMERO.

Abbiamo descritto il nostro utilizzo di un kit imaging RNA per esaminare gli effetti dell&#39;ipossia sulla sintesi di RNA in osteosarcoma (U2OS) cellule. Questa tecnica è relativamente semplice e fornisce dati relativi trascrizione globale a livello di singola cellula. Abbiamo modificato il protocollo convenzionale per questo kit per incorporare etichettatura in una camera di ipossia. A nostra conoscenza questo è il primo rapporto di utilizzo di questa tecnica per misurare le variazioni di sintesi dell&#39;RNA in ipossia. Il kit imaging RNA abbiamo usato è adatto per la sperimentazione in ipossia poiché richiede isotopi radioattivi e tecnicamente compatibili con le limitazioni di lavorare in una workstation atmosfera controllata. I problemi più comuni con questo fissazione efficiente tecnica preoccupazione e l&#39;etichettatura del campione. E &#39;estremamente importante che il PFA utilizzata per fissare il campione è fresco e le fasi di lavaggio che seguono la reazione&#39; scegliere &#39;vengono eseguite come descritto per garantire bassa bassa colorazione del campione. Se background fluorescenza diventa un problema, si raccomanda di lavare ancora una volta con 1 ml di imaging RNA tampone di reazione kit di risciacquo dopo il punto 2.7.4. Il kit imaging RNA qui menzionato rappresenta un avanzamento significativo nella tecnologia di imaging RNA in termini di semplicità d&#39;uso e la specificità e la velocità di reazione. Questa tecnica è limitata principalmente dal tempo necessario per etichettare il campione. Il kit imaging RNA richiede un periodo di etichettatura 1 ora che impedisce l&#39;esame dei rapidi cambiamenti RNA globale che si verificano di solito entro questo lasso di tempo. E &#39;per questo motivo il nostro punto prima volta è limitato a 1 ora e 15 min. La tecnica è associata con poche altre limitazioni che riguardano principalmente reagente compatibilità con altri marcatori fluorescenti, per esempio, questo kit imaging RNA non è compatibile con falloidina colorazione. Tutti gli approcci esistenti di studiare la sintesi di RNA in cellule sono basati su incorporazione di nucleosidi modificati nellaRNA nascente e il rilevamento di etichette incorporate con mezzi diversi. L&#39;approccio pionieristico si è basata sull&#39;utilizzo di precursori di RNA marcati radioattivamente seguita da rilevamento con autoradiografia. Questo metodo ha portato alla scoperta di fasi del ciclo cellulare e altri reperti importanti; tuttavia, ha un sacco di svantaggi, come la macchinosità del lavoro radioattività, tempi di esposizione lunghi e le immagini a bassa risoluzione di autoradiografia 6. Il successivo avanzamento nel campo sfruttato mezzi dell&#39;immunochimica per eliminare la necessità di radioattività. RNA è stato etichettato per incorporazione di Bru seguita da rilevazione immunochimica. Tuttavia, anticorpo efficace legame necessario denaturazione degli acidi nucleici per migliorare l&#39;accesso al DNA o RNA che ha causato la perdita di morfologia cellulare e danneggiato gli epitopi di molte proteine, impedendo loro ulteriore rilevazione con anticorpi fluorescente 13. L&#39;introduzione della tecnologia &#39;click chemistry&#39; semplificato il processo di rilevamento e tegli procedura rispetto a autoradiografia e immunochimica. La tecnologia è basata su azide-alchino Huisgen reazione di cicloaddizione dove alchino terminale 5-ethyniluridine lega con azide coniugato con il fluoroforo in presenza di Cu (I). La reazione è specifica, rapida, non richiede ulteriori passaggi, ed è facilmente compatibile con la rilevazione immunochimica di altri costituenti cellulari. Utilizzando questa tecnologia di imaging RNA abbiamo dimostrato che le cellule, nella stessa popolazione monostrato, hanno diversi livelli di sintesi di RNA in risposta all&#39;ipossia. Abbiamo ristretto il nostro esperimento per esaminare l&#39;effetto della sola produzione di RNA; tuttavia, è del tutto possibile con questo kit imaging RNA modificati, effettuare ulteriori reazioni multiplex che consentono una più complessa analisi della produzione di RNA. Ad esempio, la colorazione secondaria utilizzando un anticorpo specifico per marcatori di trascrizione attivi quali i livelli di fosforilazione RNA polimerasi II o anche componenti della traduzionezione macchinari per dare un&#39;indicazione della quantità di questo RNA di nuova produzione che viene convertito in proteine ​​sono possibili. Proteine ​​addizionali, quali actina, una proteina che non dovrebbe cambiare significativamente con ipossia, possono essere testati come controllo aggiuntivo. Inoltre, diversi tipi cellulari possono essere testate, in quanto è molto probabile che le cellule differenti avranno differenti tassi di sintesi di RNA e anche risposte diverse a ipossia. L&#39;utilizzo di questo kit imaging RNA è molto semplice, purché i passaggi vengono eseguiti come descritto. Passaggi critici nel protocollo riguardano placcatura cellule, la fissazione delle cellule e la colorazione e l&#39;acquisizione delle immagini. E &#39;importante per placcare le cellule ad una densità descritto per evitare sopra o sotto confluenza in sperimentazione che influenzerà notevolmente il risultato. E &#39;anche importante usare fissativo fresco, assicurando la migliore&#39; fotografia &#39;della cellula è preso e curare quando si lava le cellule dopo colorazione per ridurre il background ad un livello accettabile per l&#39;analisi efficiente. Infine, il metodo di acquisizione di immagini è di vitale importanza per ottenere immagini che sono di buona qualità sufficiente per la successiva analisi. Si consiglia di utilizzare il miglior microscopio ottico a disposizione per esaminare i campioni otticamente come il microscopio utilizzato in questo protocollo che è disponibile presso i centri più intensivo di ricerca a livello globale.

Ipossia (tensioni basse ossigeno) si verifica quando il normale di ossigeno ad un tessuto è disturbato. Ossigeno ambientale è sia una sostanza nutritiva e una molecola di segnalazione, fornendo spunti importanti per vari tipi di cellule. Le variazioni di ossigeno ambientale vengono rilevati da un gruppo di diossigenasi che controllano l&#39;attività di un fattore di trascrizione essenziale famiglia conosciuta come i fattori inducibili ipossia (HIF). Le HIF sono composte da due subunità, α e β. Ci sono tre isoforme conosciute di HIF-α (1, 2, e 3) e molteplici varianti di splicing di HIF-1β. HIF-1β è costitutivamente espresso e non regolato da livelli di ossigeno ambientali 1. I membri della famiglia HIF-α sono regolate in modo dinamico da una classe di prolina-idrossilasi (dottorati di ricerca) e il fattore di inibizione HIF (FIH); che richiedono entrambi ossigeno come co-fattore per catalizzare l&#39;idrossilazione di HIF-α 2,3. In normoxia i familiari HIF-α sono idrossilati e contrassegnati per proteosomal degrado della E3-ligasi, von Hippel Lindau (VHL). In ipossia i dottorati e FIH sono inattivi o hanno una ridotta attività. Le isoforme HIF-α stabilizzarsi, formano un eterodimero con HIF-1β, e per effetto di trascrizione di geni che forniscono la risposta cellulare all&#39;ambiente ipossico (Figura 1A) 4. Attuali tecniche di analisi dell&#39;RNA concentrano sulla quantificazione dei valori medi di tutti una data popolazione cellulare. Le cellule rispondono a uno stimolo ipossico avviando la trascrizione di una miriade di geni che permettono loro di adattarsi al loro ambiente ostile 5. Tuttavia, ipossia esiste spesso una sfumatura e cellule in un ambiente ipossico non sono soggetti ad uno stimolo ipossico uniforme. Descriviamo una implementazione dei kit di imaging RNA Click-iT in una workstation di ossigeno controllato per esaminare la sintesi di RNA globale a livello di singola cellula in ipossia. Il kit imaging RNA utilizza un anucleoside lkyne modificati, 5-etinile uridina (UE) e legatura chemoselective abilitare il rilevamento di sintesi di RNA globale temporalmente e spazialmente in cellule e tessuti 6. Brevemente, le cellule vengono trattate con ipossia e coltivate in presenza di UE. Vengono poi fissate e permeabilizzate e l&#39;incorporazione UE in RNA nascente viene rilevato mediante legatura chemoselective dell&#39;UE con azide contenente colorante. Un flusso di lavoro tipico per questa reazione è mostrato in Figura 1B. Abbiamo utilizzato il kit imaging RNA esaminare sintesi di RNA a livello di singola cellula che ha portato dal trattamento con ipossia. Le ridotte dimensioni del tag alchino consente incorporazione efficiente del nucleoside modificato in RNA specifico. La legatura chemoselective o &#39;click&#39; di reazione è altamente efficiente, veloce e specifico 7-10. Tutti i componenti di reazione sono bioinerte e la reazione non richiede temperature estreme o solventi. La reazione click negail requisito per la radiomarcatura convenzionale e permette la visualizzazione diretta dei risultati poiché l&#39;uscita è leggero. Inoltre, la molecola di rilevamento può facilmente penetrare campioni complessi per consentire analisi multiplex compresi gli anticorpi per la rilevazione di proteine ​​RNA-interattiva. Questo test di imaging RNA è compatibile con coloranti organici, tra cui Alexa Fluor e fluoresceina (FITC). Abbiamo misurato il cambiamento di sintesi di RNA dopo il trattamento delle nostre cellule utilizzando un&#39;implementazione dell&#39;ambiente microscopia porta oggetti remoti (OMERO). OMERO è un software open-source, disponibile all&#39;indirizzo <a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a> . Questo software microscopio di visualizzazione e analisi delle immagini consente l&#39;accesso a, e l&#39;utilizzo di una vasta gamma di dati biologici, compresa la gestione di set di dati multidimensionali, eterogenei. L&#39;applicazione client consente la visualizzazione e l&#39;analisi di complessi dati immagine biologica 11 remoto;abbiamo usato per quantificare i cambiamenti visivi a livello mondiale e un&#39;unica sintesi di RNA cellulare. Questi dati e le operazioni necessarie per analizzare il nostro esperimento di imaging RNA utilizzando questo microscopio visualizzazione di immagini e software di analisi sono riportati di seguito. Abbiamo esaminato i cambiamenti nella sintesi di RNA globale a seguito del trattamento di osteosarcoma umano (U2OS), le cellule con ipossia fino a 24 ore. In tutte le condizioni, abbiamo rilevato cellula-cellula variazione del livello di produzione di RNA. Tempi brevi di esposizione all&#39;ipossia non hanno comportato cambiamenti significativi al livello di RNA nascente nelle cellule. Tuttavia, l&#39;esposizione di 24 ore di ipossia determinato un aumento significativo della quantità di RNA prodotta in cellule. La maggior parte delle risposte cellulari all&#39;ipossia sono misurate seguenti periodi prolungati di esposizione, come quelli 4 a 24 ore. Tuttavia, alcuni meccanismi vengono messi in atto molto prima, per esempio; Attivazione di NF-kB si verifica entro 5-15 min dell&#39;ipossia esposizione 12. Indagare ipo brevetempi di esposizione Xia è quindi giustificato e potrebbe sminuire le risposte più complesse, come il ciclo cellulare e l&#39;apoptosi.

<table><tbody><tr><td>Cellule primarie U2OS:</td><td>raccolta europea di colture cellulari</td><td>92022711</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td>, <td>Gibco</td>, <td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td>, <td>Gibco</td>, <td></td> 41966029 <td></td></tr><tr><td>FCS,</td><td>Gibco</td>, <td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Lonza DE17-603E</td><td>,</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA (1%)</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Camera per ipossia</td><td>Ruskinn</td><td>InVivo2 300</td><td></td></tr><tr><td>Kit di test Click-iT</td><td>Invitrogen</td><td>C-10329/C10330</td><td></td></tr><tr><td>pFA</td><td>Sigma</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>37% HCl</td><td>VWR</td><td>20252.335</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield Montaggio Medio</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>Sigma</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Deltavision Core Microscope</td><td>Precisione applicata</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>softWoRx</td><td>Precisione applicata</td><td>N/A</td><td>Indicato nel testo come software di elaborazione delle immagini.</td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2 CCD</td><td>Camera Photometrics</td><td>N/A Open</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO)</td><td>OME</td><td>N/A</td><td>Indicato nel testo come software di visualizzazione e analisi delle immagini del microscopio.</td></tr><tr><td>SigmaPlot v12.0</td><td>Systat Software Inc.</td><td>N/A</td><td>Indicato nel testo come software di rappresentazione grafica dei dati.</td></tr></tbody></table>

analisi globale di rna sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Ipossia o abbassamento della disponibilità di ossigeno è coinvolto in molti processi fisiologici e patologici. A livello molecolare, le cellule iniziano un particolare programma trascrizionale per montare una risposta cellulare appropriato e coordinato. La cella possiede parecchi enzimi sensore di ossigeno che richiedono ossigeno molecolare come cofattore per la loro attività. Queste vanno da prolina-idrossilasi a demethylases istoni. La maggior parte degli studi che analizzano risposte cellulari all&#39;ipossia sono basati su popolazioni cellulari e studi medi, e come tale analisi singola cella di cellule ipossiche sono raramente eseguita. Qui si descrive un metodo di analisi della sintesi di RNA globale a livello di singola cellula in ipossia utilizzando i kit di imaging RNA Click-iT in una workstation di ossigeno controllata, seguita da analisi al microscopio e quantificazione. Utilizzando cellule tumorali esposte all&#39;ipossia per periodi di tempo diversi, RNA è etichettato e misurato in ogni cella. Questa analisi consentela visualizzazione e cellula-cellula cambiamenti temporali sintesi dell&#39;RNA globale seguenti stress ipossico.

Uno schema della reazione kit imaging RNA è mostrato nella Figura 1B. Abbiamo usato questa reazione per determinare quantitativamente la sintesi di RNA totale in cellule U2OS dopo il trattamento con ipossia a livello sia globale (popolazione di cellule) individuale (singola cella) e. Le cellule sono state trattate con ipossia e coltivate in presenza di UE. Sono state poi fissate e permeabilizzate e da parte dell&#39;UE è stato rilevato da legatura chemoselective dell&#39;UE con azide contenente colorante. Questo &#39;click&#39; i risultati di reazione in un emissione di fluorescenza che può essere rilevato e quantificato utilizzando la microscopia a fluorescenza. Figura 2A mostra un tipico risultato di questo esperimento. Cellule fluorescente sono pseudocolored rosso e l&#39;immagine &#39;stato aperto in ambiente di microscopia aperto per gli oggetti remoti (OMERO). Questo software microscopio visualizzazione e analisi d&#39;immagine ha un attrezzo incorporato ROI che può essere utilizzato per selezionare individuo struttura subcellulareScritture e quantitativamente analizzano l&#39;intensità dell&#39;immagine all&#39;interno della regione prescelta. Un tipico esempio di output dati in seguito all&#39;uso di questo strumento nel programma client può essere visto in Figura 2B; intensità delle singole celle sono riportati accanto un&#39;immagine rappresentativa dall&#39;esperimento che serve come un controllo visivo per accertare la validità dei dati. Le singole intensità di fluorescenza delle cellule possono essere riportati in grafico a dispersione per mostrare la distribuzione delle singole intensità cellulari all&#39;interno della popolazione di cellule trattate. Un esempio di questo tipo di grafico è visto in Figura 2C. Rappresentazione grafica dei dati di intensità in questo modo è utile perché permette un rapido confronto dei risultati di trattamento e dimostra chiaramente il notevole eterogeneità una popolazione cellulare trattamento che è altrimenti oscurata utilizzando rappresentazione dei dati standard. L&#39;eterogeneità risposta è interessante in questo esperimento perché anche se uno stimolo ipossico uniforme era unpplied alle cellule, è evidente che ogni cellula dalla stessa popolazione monostrato risponde diversamente a questo stimolo. Figura 2D raffigura il risultato complessivo del nostro esperimento. Intensità di fluorescenza di tutte le cellule all&#39;interno di una popolazione di trattamento sono stati mediati e poi tracciate in questo grafico a barre. T-test di Student è stato utilizzato per calcolare la probabilità statistica di ciascun gruppo di trattamento significativamente diversa dal controllo. È interessante notare, questi dati mostrano che vi è un aumento statisticamente significativo sintesi di RNA globale nel tempo quando le cellule vengono trattate con U2OS ipossia (a volte maggiore di 1 ora e 30 min * p &lt;0.01;. ** P &lt;0,05 e p *** &lt;0.001 e n&gt; 30). Questi dati mostrano che dopo periodi di trattamento più lunghi ipossia, la cella concentra i suoi sforzi sulla produzione di RNA anche in questo ambiente ipossico ostile. Actinomicina D trattamento ablates completamente l&#39;intensità di fluorescenza come previsto.<img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1.jpg" /> Figura 1. A. Il sistema HIF risponde ai cambiamenti di ossigeno cellulare. In questo ipossia schema semplificato stabilizza dell&#39;eterodimero HIF impedendo HIF-α idrossilazione (-OH) dagli enzimi prolyl idrossilasi (dottorati di ricerca) e la sua successiva polyubquitination di von Hippel-Lindau proteine ​​(VHL). Risultati stabilizzazione HIF l&#39;attivazione di una miriade di geni che aiutano il rispondono cellulare all&#39;ipossia cellulare B. sintesi di RNA può essere rilevato utilizzando il saggio Click-IT.; le cellule sono etichettati con l&#39;UE dopo il trattamento la reazione Click rileva sintesi di RNA che può essere quantificata da intensità di fluorescenza e microscopia ottica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una più grande vers</a>ione di questa figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2.jpg" /> Figura 2. A. Screenshot da OMERO per mostrare output tipico microscopio a seguito di etichettatura RNA. Questo software microscopio visualizzazione di immagini e di analisi in grado di estrarre rapidamente i dati di intensità su un livello di singola cellula utilizzando il macro ROI integrato. Uno screenshot del output di questo comando è mostrato in sintesi B. globale RNA può essere dedotta dalla intensità singola cella, l&#39;intervallo di cui può essere visto in un diagramma a dispersione C. Una rappresentazione formale di questi dati aggregati può essere visto D. * p &lt;0.01; ** P &lt;0.05 e *** p &lt;0.001 e n&gt; 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <table border = &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reagenti coltura cellulare </td></tr><tr><td> Tampone fosfato (PBS) a pH 7,2-7,6 </td></tr><tr><td> Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) </td></tr><tr><td> Siero fetale di vitello (FCS) sterilizzato per filtrazione </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td></tr><tr><td> L-glutammina </td></tr><tr><td> 0,05% tripsina-EDTA (1%) </td></tr><tr><td> 70% di etanolo </td></tr><tr><td> Actinomicina D (1 mg / mL magazzino) </td></tr><tr><td> Cella Cultura Attrezzature </td></tr><tr><td> Sterile Pasteur Pipettes </td></tr><tr><td> Una gamma di colture cellulari trattati plastico adatto per la manutenzione e il trattamento di cellule in coltura </td></tr><tr><td> Bagnomaria a 37 ° C </td></tr><tr><td> Cappa a flusso d&#39;aria laminare </td></tr><tr><td> Incubatore a 37 ° C, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> Ipossia Workstation fissata a 37 ° C, 5% CO 2, 1% O 2 </td></tr><tr><td> Vetrini </td></tr><tr><td> pinze di precisione </td></tr><tr><td> Emocitometro </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Reagenti e le attrezzature necessarie per la coltura delle cellule U2OS. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="514"><tbody><tr><td rowspan="2"> Componenti di reazione </td><td colspan="6"> Numero di Coprivetrini </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Click-iT tampone di reazione RNA (Component C) </td><td> 428 microlitri </td><td> 856 microlitri </td><td> 1,7 ml </td><td> 2.1 ml </td><td> 2.58 ml </td><td> 4.3 ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 (Component D) </td><td> 20 microlitri </td><td> 40 microlitri </td><td> 80 microlitri </td><td> 100 microlitri </td><td> 120 microlitri </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor azide (preparato nella fase 2.3) </td><td> 1,8 microlitri </td><td> 3,7 microlitri </td><td> 7.4 microlitri </td><td> 9.3 microlitri </td><td> 11.28 microlitri </td><td> 18.8 ml </td></tr><tr><td> Click-iT Additivo tampone di reazione (Preparata nel passo 2.3) </td><td> 50 microlitri </td><td> 100 microlitri </td><td> 200 ml </td><td> 250 microlitri </td><td> 300 ml </td><td> 500 microlitri </td></tr><tr><td> Approssimativa volume totale </td><td> 500 microlitri </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td><td> 2,5 ml </td><td> 1,5 ml </td><td> 5 ml </td></tr></tbody></table> . Tabella 2 di imaging RNA cocktail di reazione kit: Tabella di riferimento dettagliare rapporto dei componenti della miscela master per l&#39;imaging RNA reazione kit in base al numero di vetrini da colorare. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Fluoroforo </td><td> Eccitazione (nm) </td><td> Emission (nm) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> 495 </td><td> 519 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342, legato al DNA </td><td> 350 </td><td> 461 </td></tr></tbody></table> . Tabella 3 massimi di emissione di fluorescenza / eccitazione: approssimativamente massima emissione di fluorescenza / eccitazione per Alexa Fluor colorante e Hoechst 33342 legato al DNA.

Descriviamo una tecnica per l&#39;analisi della sintesi dell&#39;RNA globale in ipossia utilizzando immagini. Click-chimica etichettatura di RNA non è stato precedentemente eseguito in ipossia e consente la visualizzazione dei cambiamenti di RNA globali a livello di singola cellula. Questo approccio integra le tecniche RNA medi esistenti, permettendo la visualizzazione diretta di cellula-cellula cambiamenti nella sintesi dell&#39;RNA globale.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è etichettare in modo fluorescente e quantificare la quantità di RNA nascente prodotto in condizioni di trattamento, utilizzando un'analisi quantitativa mediante imaging per raggiungere tale scopo. Le cellule in coltura piastrate su coprivetri vengono trattate con la base modificata alchini, cinque etiniluridina, indicata in seguito come cinque EU, e incubate in condizioni di ipossia.Durante l'incubazione, cinque EU vengono incorporati durante la sintesi dell'RNA senza interrompere il macchinario cellulare della trascrizione. Successivamente, il cinque EU incorporato viene etichettato in modo fluorescente mediante una reazione di cicloaggiunta azide-alcina catalizzata dal rame, nota anche come reazione "click". L'RNA nascente etichettato fluorescentemente viene quindi osservato mediante microscopia a fluorescenza e le immagini ottenute vengono analizzate per confrontare la quantità di RNA prodotta in condizioni di trattamento e di controllo.L'analisi statistica dei dati ottenuti mostra i cambiamenti nella sintesi di RNA nascente in risposta all'ipossia, attraverso la quantificazione di cinque incorporazioni di EU e la rilevazione mediante microscopia a fluorescenza. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la PCR quantitativa, è che consente la visualizzazione diretta della produzione di RNA nelle cellule a livello singolo. Sebbene in questo caso utilizziamo questo metodo per studiare come le cellule rispondono alla bassa concentrazione di ossigeno, esso può essere impiegato anche per analizzare le risposte ai farmaci chemioterapici.Le nostre risposte ad ulteriori risposte allo stress che illustrano una procedura saranno di John Leston, uno studente laureato del mio laboratorio con l'aiuto di Ish Kova, anch'egli studente laureato, e Humana Druker, un ricercatore post-dottorato. Infine, Gus Ferguson illustrerà l'uso del software di visualizzazione delle immagini. Iniziare questo esperimento immergendo diversi coprioggetti in etanolo al 70% per sterilizzarli.Posizionare i coprioggetti sul bordo di una piastra nell'incubatrice per colture cellulari e lasciarli asciugare all'aria sotto flusso laminare. Una volta che i coprioggetti sono asciutti, posizionarne uno in ognuna delle sei piastre da 3,5 centimetri. Aggiungere due millilitri di DMEM completo tiepido in ciascuna piastra.Premere con la pinzetta per assicurarsi che ogni coprioggetto rimanga aderente al fondo della pozzetta. Per staccare le cellule U2 OS dalla piastra per coltura tissutale, lavare una volta con tre millilitri di PBS. Quindi aggiungere quattro millilitri di tripsina al 0,05% calda, EDTA 1% e incubare a 37 gradi Celsius per sette minuti.Trascorsi sette minuti, aggiungere il mezzo di coltura completo DMEM caldo per sospendere le cellule e inattivare la tripsina-EDTA. Sospendere le cellule in sei millilitri di DMEM completo caldo. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e seminare ciascuna delle piastre da 3,5 centimetri contenenti cover slip con due volte 10 alla quinta cellule. Agitare delicatamente la piastra per garantire una distribuzione uniforme delle cellule e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius, 21% di ossigeno e 5% di anidride carbonica per consentire l'adesione delle cellule.Il giorno successivo, rimuovere cinque delle piastre dall'incubatore. Lasciare inalterata la piastra rimanente. Essa verrà utilizzata come controllo positivo normossico.Posizionare quattro delle piastre nella stazione di lavoro in condizioni di ipossia. Esporre le cellule a condizioni ipossiche per 75 minuti, 90 minuti, due ore e 24 ore. All'altra piastra.Aggiungere l'actinomicina D al mezzo fino a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e reinserire la piastra nell'incubatore a 37 gradi in condizioni di ossigeno normale per quattro ore. Questa piastra funge da controllo negativo normossico. Mentre le cellule sono in incubazione, preparare e raccogliere i seguenti reagenti in previsione del saggio click it.Il kit per il saggio click it contiene PBS a un pH di 7,2–7,6, paraformaldeide al 3,7% in PBS, Triton X-100 all'1% in PBS, acqua deionizzata, dimetilsolfossido, idrossido di sodio 10 molare, acido cloridrico al 37% e strisce indicatrici di pH. È necessario pianificare di essere pronti per iniziare un saggio con etichettatura in condizioni non trattate. Un'ora prima della fine del trattamento in ipossia, per etichettare le cellule preparare una soluzione lavorativa 2x di EU partendo dalla soluzione madre 100 millimolare in mezzo completo preriscaldato.Successivamente, aggiungere un volume pari di due XEU al mezzo nella piastra contenente le cellule trattate con actinomicina D, diluendo così l'EU alla concentrazione di lavoro. Poi, all'interno della camera da ipossia, aggiungere il preparato stock di EU alle cellule trattate con ipossia. Incubare per un'ora nelle condizioni di coltura cellulare previste per il trattamento, oppure per quattro ore nei controlli.Lavare ogni piatto una volta con PBS e aggiungere un millilitro della soluzione madre di paraformaldeide al 3,7% nelle condizioni di trattamento, quindi incubare per 15 minuti nelle condizioni di trattamento. Dopo la fissazione, rimuovere le cellule dalla camera a ipossia e posizionarle nella cappa chimica. Versare il fissativo avendo cura di smaltire i rifiuti di paraformaldeide in modo responsabile.Quindi lavare le cellule una volta con PBS. Eseguire i passaggi successivi a temperatura ambiente, mantenendo tutte le soluzioni sul ghiaccio a due-sei gradi Celsius. Per permeabilizzare le cellule, rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere un millilitro di Triton X-100 al 1% in PBS a ciascun pozzetto, incubando per 15 minuti a temperatura ambiente.Rimuovere il buffer di permeazione e lavare ogni pozzetto una volta con PBS. Rimuovere la soluzione di lavaggio dalle cellule e aggiungere 500 microlitri di cocktail di reazione del kit per imaging dell'RNA appena preparato a ogni campione. Proteggere le cellule dalla luce e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.Dopo l'incubazione, rimuovere la reazione del kit per imaging dell'RNA, il cocktail e il lavaggio. Una volta con un millilitro di reazione del kit per imaging dell'RNA, risciacquare; a questo punto, eseguire qualsiasi ulteriore marcatura con anticorpi. Per colorare il DNA, lavare i campioni con PBS, quindi diluire l'Hoecsht 33342 da uno a 1000.In PBS, aggiungere un millilitro della soluzione di HERC diluita a ciascun pozzetto. Proteggere dalla luce e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione di HERC e lavare le cellule due volte con PBS per montare i cover slip.Posizionare 10 microlitri di mezzo di montaggio al centro di un normale microscopio. Far scivolare il vetrino coprioggetto con il lato delle cellule rivolto verso il basso sulla goccia di mezzo di montaggio. Evitare la formazione di bolle d'aria, poiché ostacolerebbero l'acquisizione successiva delle immagini.Applicare uno smalto incolore lungo il perimetro del vetrino coprioggetto per fissarlo al vetrino del microscopio. Lasciare asciugare lo smalto per cinque minuti a temperatura ambiente. I campioni protetti dalla luce possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius.Dopo il montaggio, acquisire le immagini utilizzando un microscopio a campo luminoso in grado di rilevare la fluorescenza. Eseguire l'acquisizione con un obiettivo ad immersione in olio da 40 V e 1,30 NA e catturare le immagini con una camera CCD refrigerata. Un minimo di 30 cellule dopo l'acquisizione delle immagini.Utilizzare un software di elaborazione delle immagini per correggere le immagini. Questo permette di correggere le distorsioni ottiche applicando una formula matematica basata su software alle immagini acquisite. Il risultato è un'immagine più nitida che garantisce che l'analisi successiva sia limitata esclusivamente alle cellule immaginate.Successivamente, importare le immagini nel client Omero. Verranno visualizzate le miniature di tutte le immagini ottenute, accanto alle quali normalizzare le impostazioni di rendering per tutte le immagini dello stesso esperimento. Applicare le impostazioni di rendering ottenute dalle cellule controllo normoiche a tutte le altre condizioni utilizzando lo strumento di area di interesse (ROI) nel software di analisi.Selezionare i nuclei da ciascuna immagine nel software. Scegliere l'opzione di analisi dell'intensità e ottenere le intensità medie per ciascuna ROI relative a 30-50 cellule. Salvare i dati e quindi calcolare la media e la deviazione standard per ciascuna condizione.Infine, utilizzando un software di rappresentazione grafica dei dati, costruire grafici a dispersione di tutti i valori medi individuali di intensità per evidenziare la variabilità tra le cellule in ciascuna condizione. Riportare i dati di intensità in questo modo è utile perché consente un confronto rapido dei risultati dei trattamenti e dimostra chiaramente una significativa eterogeneità all'interno della popolazione cellulare sottoposta a trattamento, che altrimenti sarebbe oscurata usando rappresentazioni grafiche standard. In alternativa, costruire grafici a barre per rappresentare l'intensità media media più la deviazione standard dell'RNA nascente al fine di determinare quantitativamente la sintesi totale di RNA. Le cellule U2 OS trattate con ipossia e coltivate in presenza di al uridina o EU sono state quindi processate e analizzate.Come dimostrato in questo video, le intensità di fluorescenza di tutte le cellule appartenenti a ciascuna popolazione trattata sono state mediate e riportate in grafico. In questo istogramma, un test t di Student è stato utilizzato per calcolare la probabilità statistica che ciascun gruppo trattato differisca in modo significativo dal controllo. In modo interessante, questi dati mostrano un aumento statisticamente significativo della sintesi globale di RNA nel tempo.Quando le cellule U2 OS sono trattate con ipossia per un periodo superiore a un'ora e mezza, come previsto, il trattamento con ACTO micina D elimina completamente l'intensità di fluorescenza. Questi dati suggeriscono che, dopo lunghi periodi di trattamento in condizioni di ipossia, la cellula concentra i suoi sforzi sulla produzione di RNA, anche in questo ambiente ipossico ostile. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come etichettare e quantificare l'RNA nascente a livello di singola cellula in condizioni di ipossia e normossia; una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore seguendo questa procedura.Altri metodi, come la doppia colorazione con anticorpi per la RNA polimerasi e HIF-1, possono essere eseguiti per determinare se i livelli di RNA polimerasi sono alterati e se HIF è attivato. Non dimenticare che lavorare con formaldeide può essere estremamente pericoloso durante l'esecuzione di questa procedura. Indossare sempre guanti e lavorare in una cappa aspirante.

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Biologia

L'RNA cellulare totale fornisce un modello povero per studiare variazioni a breve termine in sintesi dell'RNA e il decadimento nonché la cinetica di RNA processing. Qui, descriviamo marcatura metabolica di RNA trascritto recente con 4 thiouridine seguito da biotinylation tiolo-specifica e purificazione dell'RNA trascritto appena consentano di superare queste limitazioni.

Marcatura metabolica di RNA recentemente trascritto per Alta Risoluzione profili di espressione genica di RNA di sintesi, trattamento e Decay in coltura cellulare

La purificazione dell'affinità ribosomiale traducente (TRAP) è in grado di catturare la traduzione specifica del tipo di cellula dell'mRNA. Qui riportiamo il primo protocollo TRAP dedicato all'isolamento dell'mRNA in rare popolazioni cellulari di embrioni di Drosophila.

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification da popolazioni di cellule rare<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Qui, presentiamo protocolli di coltura cellulare umana per analizzare i fattori di inizio della traduzione che legano il cappuccio 5' dell'mRNA durante le condizioni fisiologiche di ossigeno. Questo metodo utilizza un analogo del tappo m7GTP legato all'agarosio ed è adatto per studiare i fattori di legame del tappo e i loro partner interagenti.

Analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno

Qui, presentiamo un protocollo utilizzando RNA-seq per monitorare i livelli di mRNA nel tempo durante la risposta hypoxic delle cellule di S. cerevisiae . Questo metodo può essere adattato per l'analisi di espressione genica durante qualsiasi risposta cellulare.

Misurazione dei livelli di mRNA nel tempo durante la risposta Hypoxic lievito s. cerevisiae

Questo protocollo descrive l'uso combinatoria di ChIP-seq, 4sU-seq, totale RNA-seq e profilatura per linee cellulari e cellule primarie del ribosoma. Esso consente di tenere traccia delle modifiche in fattore di trascrizione binding, trascrizione de novo , elaborazione di RNA, fatturato e traduzione nel corso del tempo e la visualizzazione il corso generale degli eventi in cellule attivate e/o cambiare rapidamente.

In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

Questo metodo può essere utilizzato per misurare la sintesi del RNA. 5-Bromouridine è aggiunto alle cellule e integrare nel RNA sintetizzato. Sintesi di RNA viene misurata mediante estrazione di RNA immediatamente dopo la marcatura, seguita da 5-Bromouridine-mirati immunoprecipitazione di etichettati RNA e analisi di trascrizione inversa e reazione a catena della polimerasi quantitativa.

Indagine della sintesi di RNA usando 5-Bromouridine di etichettatura e di immunoprecipitazione

Il protocollo qui descritto si basa sulla quantificazione genoma di nuova sintesi mRNA purificato da cellule di lievito etichettate con 4-tiouracile. Questo metodo permette di misurare la sintesi di mRNA disinserita dalla degradazione del mRNA e, quindi, fornisce una misurazione accurata della trascrizione del RNA polimerasi II.

Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II

Qui presentiamo un protocollo per la scissione dell'RNA dipendente da DNAzyme. Ciò consente un'analisi rapida e dipendente dal sito dell'RNA 2'-O-metilazione. Questo approccio può essere utilizzato per la valutazione preliminare o importante dell'attività dello snoRNA.

Analisi dipendente da DNAzyme del rRNA 2'-O-Metilazione

Il cross-linking cinetico e l'analisi del cDNA è un metodo che consente di studiare la dinamica delle interazioni proteina-RNA nelle cellule viventi ad alta risoluzione temporale. Qui il protocollo è descritto in dettaglio, compresa la crescita delle cellule di lievito, la reticolazione UV, la raccolta, la purificazione delle proteine e le fasi di preparazione della libreria di sequenziamento di prossima generazione.

Monitoraggio delle dinamiche di interazione proteina-RNA in vivo ad alta risoluzione temporale utilizzando χCRAC

Presentiamo una tecnica per stabilizzare rapidamente complessi traslazionali (biosintesi proteica) con reticolazione di formaldeide in cellule di lievito vivo e di mammifero. L'approccio consente di sezionare intermedi transitori e interazioni dinamiche RNA:proteina. I complessi reticolati possono essere utilizzati in molteplici applicazioni a valle come nei metodi di profilazione basati sul sequenziamento profondo, nella microscopia e nella spettrometria di massa.

Rapida fissazione in vivo e isolamento dei complessi traslazionali dalle cellule eucariotiche

La struttura secondaria dell'RNA è stata osservata principalmente in RNA maturo con metodi di sondaggio strutturale. Il sequenziamento co-transcriptional Structure Tracking (CoSTseq) unifica il funzionamento nucleare, che è stato utilizzato per studiare la posizione della polimerasi sull'RNA nascente, con il sondaggio strutturale. CoSTseq consente così l'osservazione della struttura secondaria dell'RNA nell'RNA sotto trascrizione attiva.

Analisi comparativa della struttura dell'RNA di trascrizioni nascenti e mature in Saccharomyces cerevisiae

Scopri come analizzare la sintesi globale di RNA a livello di singola cellula in condizioni di ipossia utilizzando la marcatura con click-chemistry e la microscopia a fluorescenza.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

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