Name: Un metodo modificato per eterotopica mouse Cuore Trapianto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-23T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Impara la tecnica di trapianto cardiaco eterotopico nel topo, inclusi prelievo del cuore del donatore e anastomosi dei vasi del ricevente. Questo metodo consente di studiare rigetto e compatibilità genetica.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio nazionale della sanità e ricerca medica (NHMRC) dell&#39;Australia progetto di Grant 1.029.205, dalla Fondazione Microsearch dell&#39;Australia, e dalla Myee Codrington Research Foundation medica.

Prima dell&#39;inizio degli esperimenti, ottenere l&#39;approvazione da Animal Care comitato etico dell&#39;istituzione competente per gli esperimenti previsti. Mantenere i topi in conformità con i requisiti della vostra istituzione. Il seguente protocollo è stato approvato dai comitati Sydney University e Royal Prince Alfred Hospital. Prima di iniziare l&#39;intervento, tutti gli strumenti devono essere puliti a fondo e sterilizzati immergendo nel 80% di etanolo. Alcuni istituti prevedono la sterilizzazione in autoclave tuttavia questo potrebbe danneggiare gli strumenti di microchirurgia sottili a lungo termine. Ove possibile uso sterile materiale monouso. 1. Anestesia <ol><li> Anestetizzare mouse con isoflurano in un contenitore sigillato poi metterlo in posizione supina su una scheda operativa, che collega rapidamente cono di anestetico. Test di adeguatezza dell&#39;anestesia pizzicando il piede posteriore per garantire che non vi è alcun riflesso. </li><li> Shave la pelle con una lama chirurgica esterilizzare con l&#39;80% di etanolo. Inoltre, 2% clorexidina nel 70% di alcol isopropilico può essere utilizzata per la sterilizzazione pelle. Durante l&#39;induzione dell&#39;anestesia concentrazione isoflurano è 3% ma ridurre questo fino a 1-1,5% per manutenzione. Apportare piccole modifiche a questa concentrazione per mantenere la respirazione regolare e la frequenza cardiaca. Mantenere la temperatura dell&#39;animale su una piastra elettrica. </li></ol> 2. Funzionamento donatori <ol><li> Effettuare una toracotomia per esporre il cuore ed i vasi tagliando il torace attraverso entrambi i lati della gabbia toracica dal bordo costola fino al cavo ascellare seguita da un taglio trasversale a livello del xiphisternum per formare un lembo parete toracica. Sollevare questo lembo accanto alla testa e il pin alla scheda operativa. Strappare pericardio per esporre cuore e dei vasi. </li><li> Sollevare la vena cava inferiore con una pinza in una mano e con l&#39;altra iniettare 1 ml di soluzione fisiologica fredda prossimale eparinata al cuore attraverso la vena cava inferiore, poi mettere una fascetta piccola arteria sulla IVC di prevenzionet flusso della soluzione di perfusione attraverso il foro dell&#39;ago. </li><li> Utilizzo di garza e un cotton fioc, ritrarre il cuore verso il basso per esporre l&#39;aorta ascendente e l&#39;arteria polmonare. Passare una lama di una coppia di microscissors attraverso il canale (seno trasverso) posteriormente al fascio di aorta e l&#39;arteria polmonare e tagliare l&#39;aorta e l&#39;arteria polmonare insieme come distalmente possibile per garantire lunghezza sufficiente per anastomosi. </li><li> Legame e dividere la IVC, vena cava superiore destro (SVC), a sinistra SVC e vene polmonari con 6-0 filo di seta. Legare il IVC e SVC destra separatamente quindi inserire un singolo thread posteriore al cuore per circondare la SVC sinistra insieme a vene polmonari e legarlo. Raccolto il cuore dal sito donatore tagliando i vasi distali ai legami, poi riporla in freddo soluzione salina sterile a 4 ° C fino al momento del trapianto. Questo comporta la morte del donatore per dissanguamento. </li></ol> 3. Funzionamento del destinatario <ol><li> Anestetizzare l&#39;destinatario come sopra (sezione 1). Radersi con cura addome per evitare l&#39;irritazione, poi fare una laparotomia dalla mediana incisione dal pube al xiphisternum e ritrarre con graffette piegate a formare divaricatori. Avvolgere l&#39;intestino in soluzione salina calda imbevuta garza sterile e ritrarre in alto a destra dell&#39;addome. </li><li> Per esporre l&#39;aorta infra-renale e IVC, liberare i segmenti bundle di aorta e IVC dalla arteria renale sinistra e la vena alla biforcazione iliaca, suddividendoli dai vasi lombari utilizzando un dispositivo di cauterizzazione. Fate attenzione che la cauterizzazione è alla giusta temperatura ed utilizzato per un tempo sufficiente per dividere e sigillare le estremità dei vasi. </li><li> Applicare piccoli morsetti vasi atraumatica per l&#39;aorta e segmenti IVC distalmente e prossimalmente. Fare un&#39;incisione nella parete anteriore dell&#39;aorta dapprima fora un buco con un ago 30 G; poi tagliare un&#39;incisione verticale con microscissors per adattarsi alle dimensioni dell&#39;aorta donatore. Lavare il lume dell&#39;aorta con soluzione salina eparinizzata per rimuovere eventuali blcoaguli OOD. </li><li> Portare il cuore donatore al sito ricevente coperto con garza imbevuta di soluzione salina fredda e posizionarlo sul lato destro dell&#39;addome. Assicurarsi che l&#39;aorta donatore è posizionato vicino alla incisione sull&#39;aorta destinatario e l&#39;arteria polmonare donatore posizionato accanto al destinatario IVC. </li><li> Anastomose lato end-to-aorta donatore all&#39;aorta destinatario utilizzando esecuzione 10-0 suture in nylon partire dall&#39;angolo prossimale e sutura sul lato sinistro prima fino a raggiungere l&#39;angolo distale, in quale fase l&#39;animale è ruotato di 180 °. Spostare delicatamente il cuore del donatore al lato sinistro dell&#39;addome per esporre il lato destro dell&#39;aorta e continuare sutura attraverso il lato destro della parete aortica dall&#39;estremità distale all&#39;estremità prossimale. Prima di chiudere l&#39;anastomosi aortica, lavare delicatamente il lume con soluzione fisiologica eparinizzata per rimuovere eventuali coaguli e l&#39;aria. </li><li> Anastomose l&#39;arteria polmonare donatore (PA) end-to-side con il destinatario IVC. Praticare un&#39;incisione verticamente con microscissors nella parete anteriore della IVC in un sito in conformità con l&#39;anastomosi dell&#39;arteria. Anastomose il donatore PA al destinatario IVC con l&#39;esecuzione di 10-0 suture in nylon a partire dalla fine distale della parete sinistra all&#39;interno del lume della IVC. Dopo aver raggiunto l&#39;estremità prossimale, continuare suture lungo la parete laterale anteriore destro fino all&#39;estremità distale per completare l&#39;anastomosi. Prima di chiudere l&#39;anastomosi, lavare delicatamente il lume per eliminare eventuali grumi e aria. </li><li> Prima di rilasciare la nave morsetti, posto pezzi di Gelfoam intorno ai siti di anastomosi, e applicare una leggera pressione con un applicatore di cotone fino a raggiungere l&#39;emostasi. Al momento della rivascolarizzazione, allentare il blocco distale prima, seguita dalla pinza prossimale. </li><li> Dopo rivascolarizzazione, applicare salina calda a 37 ° C per l&#39;innesto esternamente per aiutare il recupero. L&#39;innesto di solito inizia fibrillazione immediatamente e ritorna spontaneamente a ritmo sinusale in pochi minuti. Iniettare 0,6 ml caldisalina per via sottocutanea per mantenere l&#39;idratazione del destinatario. Iniettare per via sottocutanea buprenorfina per l&#39;analgesia prima del completamento di un intervento chirurgico </li><li> Chiudere la ferita addominale con una sutura 5-0 assorbibile corsa per entrambi gli strati. Inizia completando lo strato interno e proseguire lungo la pelle. </li></ol> 4. Recupero e Graft monitoraggio <ol><li> Iniettare ampicillina per la profilassi di infezioni e collocare il recipiente su una piastra elettrica a 37 ° C per il recupero. La maggior parte degli animali recuperano rapidamente e di solito bevono e spesso mangia nel raggio di 3 ore. Se il mouse mostra segni di sofferenza, esaminare attentamente per determinare la causa. Se nessuna causa evidente, il trattamento con buprenorfina e monitorare attentamente. Consultare un veterinario se i sintomi sono gravi o persistono per più di 8 ore e prendere in considerazione l&#39;eutanasia. Se necessario, dare continuando 12 iniezioni orarie di buprenorfina fino alla scomparsa dei sintomi. Se il mouse mostra segni di sofferenza dopo 8 ore, dare continuando 12iniezioni orarie di buprenorfina fino a che non risolvono. Consultare il veterinario se i sintomi persistono per più di 48 ore e euthanize se necessario. </li><li> Controllo innesto battito cardiaco con la palpazione addominale diretta e registrare la forza del ritmo come + + + + per un innesto sano + per battere debole a causa di rifiuto avanzato e - come non battere a causa di completare il rigetto del trapianto. Controllo topi al giorno per i primi 10 giorni, poi 3 volte a settimana per tutta la durata dell&#39;esperimento. </li></ol>

<ol><li>Aramaki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10+but+not+transforming+growth+factor-beta+is+essential+for+generation+and+suppressor+function+of+regulatory+cells+induced+by+intratracheal+delivery+of+alloantigen%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10 but not transforming growth factor-beta is essential for generation and suppressor function of regulatory cells induced by intratracheal delivery of alloantigen.</a> Transplantation. 79, 568-576 (2005).</li>
<li>Chen, R. H., Bushell, A., Fuggle, S. V., Wood, K. J., Morris, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+granzyme+A+and+perforin+in+mouse+heart+transplants+immunosuppressed+with+donor-specific+transfusion+and+anti-CD4+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Expression of granzyme A and perforin in mouse heart transplants immunosuppressed with donor-specific transfusion and anti-CD4 monoclonal antibody.</a> Transplantation. 61, 625-629 (1996).</li>
<li>Poulin, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-9+promotes+eosinophilic+rejection+of+mouse+heart+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-9 promotes eosinophilic rejection of mouse heart allografts.</a> Transplantation. 76, 572-577 (2003).</li>
<li>Ono, K., Lindsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+technique+of+heart+transplantation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thorac.+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">Improved technique of heart transplantation in rats.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 57, 225-229 (1969).</li>
<li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primarily+vascularized+allografts+of+heart+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Primarily vascularized allografts of heart in mice.</a> Transplantation. 16, 343-350 (1973).</li>
<li>Larsen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-gp39+interactions+play+a+critical+role+during+allograft+rejection.+Suppression+of+allograft+rejection+by+blockade+of+the+CD40-gp39+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">CD40-gp39 interactions play a critical role during allograft rejection. Suppression of allograft rejection by blockade of the CD40-gp39 pathway.</a> Transplantation. 61, 4-9 (1996).</li>
<li>Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+induction+of+transplantation+tolerance+with+a+nondepleting+anti-Cd4+monoclonal+antibody+and+donor-specific+transfusion+before+transplantation.+A+critical+period+of+time+is+required+for+development+of+immunological+unresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness.</a> Transplantation. 61, 1642-1647 (1996).</li>
<li>Callaghan, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+allograft+survival+by+inhibitory+FcgammaRIIb+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of allograft survival by inhibitory FcgammaRIIb signaling.</a> J. Immunol. 189, 5694-5702 (2012).</li>
<li>Qian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+donor+MHC+Class+I+or+Class+II+antigen+deficiency+on+first-+and+second-set+rejection+of+mouse+heart+or+liver+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Impact of donor MHC Class I or Class II antigen deficiency on first- and second-set rejection of mouse heart or liver allografts.</a> Immunology. 88, 124-129 (1996).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+acceptance+of+mouse+kidney+allografts+is+associated+with+increased+Foxp3+expression+and+differences+in+the+B+and+T+cell+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous acceptance of mouse kidney allografts is associated with increased Foxp3 expression and differences in the B and T cell compartments.</a> Transpl. Immunol. 24, 149-156 (2011).</li>
<li>Liu, F., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+Heart+Transplantation+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Heterotopic Heart Transplantation in Mice.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Mottram, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocardiographic+monitoring+of+cardiac+transplants+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice.</a> Cardiovasc. Res. 22, 315-321 (1988).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Trapianto di cuore Mouse è un metodo microchirurgico impegnativo, che richiede una notevole abilità chirurgica da padroneggiare. L&#39;aspetto più difficile è il piccolo diametro dei vasi. Inoltre, è necessario limitare il tempo di funzionamento destinatario e sanguinamento. La tecnica per il mouse trapianto di cuore è stato descritto da Corry et al. nel 1973 e successivamente da Mottram et al 12. I nostri modifiche includono i seguenti punti. In primo luogo, la perfusione immediata del cuor...

Modelli animali di trapianto di organi in grado di fornire informazioni preziose per migliorare il trattamento dei pazienti sottoposti a trapianto clinici. Modelli murini sono particolarmente utili per studiare il meccanismo immunitario di rigetto del trapianto o accettazione a causa della vasta gamma di topi e reagenti specifici per i topi che non sono disponibili per altri modelli animali 1-3 geneticamente modificati. Una sfida con i modelli murini di trapianto è la piccola dimensione dei donatori e dei riceventi che richiede notevole abilità tecnica per ottenere risultati soddisfacenti. Una tecnica è stata descritta per la prima per il trapianto eterotopico di cuori nei ratti 4 che è stato successivamente adattato per il mouse trapianto di cuore da Corry et al 5. Questa tecnica, nella redazione del destinatario prima dell&#39;operazione donatore e non perfusione del cuore del donatore, entrambi i quali sono suscettibili di compromettere la sopravvivenza del cuore o t trapiantatoegli destinatario. Il procedimento è stato ampiamente utilizzato come originariamente descritto per esaminare i meccanismi di rigetto del trapianto e tolleranza 6-8. Altri hanno adattato il ratto cuore procedura di trapianto originale di Ono e Lindsey per i trapianti di cuore nei topi 9,10. Più recentemente, è stata pubblicata una tecnica per il mouse trapianto cardiaco che ha superato alcuni dei problemi associati al metodo di Corry et al 11. Il protocollo qui descritto incorpora nostre modifiche, sulla base del metodo di Mottram et al 12, che comprendono: in situ perfusione con soluzione salina eparinizzata freddo subito dopo toracotomia ed esecuzione dell&#39;operazione donatore prima dell&#39;operazione destinatario per minimizzare il tempo di funzionamento destinatario. Inoltre, utilizziamo i piccoli morsetti vasi atraumatica invece di 6-0 cravatte di seta. Sebbene pinze nave hanno lo svantaggio di prendere più spazio che sono più facili da controllare rispetto legami, che non dovrebbe essere troppo stretto o allentatoe sono meno semplici da rimuovere rispetto morsetti. Il nostro metodo utilizza una singola sutura continua per vaso anastomosi, sebbene nella formazione iniziale fasi alternativa è quella di utilizzare suture al prossimali e distali angoli per garantire uniformità di suture e quindi la pervietà delle anastomosi.

<table><tbody><tr><td>Microscopio operatorio&nbsp;</td><td>Leica, Heerbrugg, Svizzera</td><td>M651</td><td>Macchina per anestesia con ingrandimento 10-25X</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia</td><td>Vett3</td><td>In grado di erogare una miscela di isoflurano e ossigeno nell'aria&nbsp;</td></tr><tr><td>Tavola operativa&nbsp;</td><td>Negozio di ferramenta o fornitore</td><td></td><td>di ufficio Sughero denso o sintetico in grado di prendere perni</td></tr><tr><td>Soluzione salina eparinizzata (5 U/ml, 4 &deg; C)</td><td>Pfizer, USA</td><td>FW25</td><td>In siringa da 1 ml con ago da 23 G su ghiaccio</td></tr><tr><td>Soluzione salina normale (37 &deg; C)</td><td>AstraZeneca Pty Ltd, Australia</td><td>4538</td><td>In siringa da 1 ml con ago da 23 G su tampone caldo</td></tr><tr><td>Suture 10- nylon, 5-0 Vicryl</td><td>Ethicon, Inc. NJ, USA</td><td>2870G/J421H</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (0,05 mg/kg in soluzione fisiologica da 0,1 ml)</td><td>Reckitt Benckiser, Sydney, Australia</td><td></td><td>In siringa da 1 ml con ago da 23 G su ghiaccio</td></tr><tr><td>Ampcillina (5 mg/kg in soluzione salina da 0,1 ml)</td><td>Aspen, Sydney, Australia</td><td></td><td>In siringa da 1 ml con ago da 23 G su ghiaccio</td></tr><tr><td>Gel Schiuma</td><td>Pharmacia & Upjohn Co. USA</td><td>801289304</td><td>Tagliare in piccoli pezzi</td></tr><tr><td>Dispositivo di cauterizzazione ad alta temperatura</td><td>Medtronic, USA</td><td>8444000</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo / Temperatura destra</td><td>Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strumenti di microchirurgia: </td><td>Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.,&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microneedleholders</td><td>Shanghai, Cina</td><td>WT2020</td><td></td></tr><tr><td>Microforbici</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td><td>WT1020</td><td></td></tr><tr><td>Micropinze (punta dritta)</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td><td>WA3010</td><td></td></tr><tr><td>Micropinze (punta curva)</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td><td>WA3020</td><td></td></tr><tr><td>Morsetti per microzanzare (1 paio)</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td><td>W40350</td><td></td></tr><tr><td>Morsetti atraumatici per microvasi (1 paio)</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td><td>W40130/W40150</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo modificato per eterotopica mouse cuore trapianto

A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

I topi sono spesso usati come donatori e riceventi trapianto di cuore negli studi di immunologia dei trapianti grazie alla vasta gamma di topi transgenici e reagenti disponibili. Una difficoltà è presentato a causa delle ridotte dimensioni dell&#39;animale e le considerevoli sfide tecniche della microchirurgia coinvolto nel trapianto di cuore. In particolare, un alto tasso di guasto tecnico subito dopo il trapianto può risultare dalla morte del destinatario e complicanze post-operatorie come la paralisi degli arti posteriori o un cuore non batte. Qui, la tecnica completa per il mouse eterotopico trapianto cardiaco è dimostrata, coinvolgendo raccolta del cuore del donatore e del suo successivo impianto in un topo ricevente. Il cuore del donatore viene raccolto subito dopo in situ perfusione con soluzione salina eparinizzata e freddo recisione dell&#39;aorta ascendente e l&#39;arteria polmonare. L&#39;operazione destinatario prevede la preparazione dell&#39;aorta addominale e la vena cava inferiore (IVC), seguita daend-to-side anastomosi dell&#39;aorta donatore con l&#39;aorta destinatario utilizzando una singola corsa 10-0 microsuture e una simile anastomosi dell&#39;arteria polmonare donatore con il destinatario IVC. A seguito dell&#39;operazione l&#39;animale viene iniettato con 0,6 ml di soluzione salina normale per via sottocutanea e permesso di recuperare su una piastra elettrica 37 ° C. I risultati di 227 trapianti di cuore del mouse sono riassunti con un tasso di successo a 48 ore del 86,8%. Dei fallimenti del 13,2% entro 48 ore, 5 (2,2%) hanno sperimentato la paralisi degli arti posteriori, 10 (4,4%) hanno avuto un cuore non batte a causa di innestare lesione ischemica e / o trombosi, mentre il 15 (6,6%) sono morti entro 48 ore .

Dopo un periodo di formazione iniziale, sono stati analizzati 227 casi di topo eterotopico trapianto di cuore nel nostro gruppo. Il tasso di successo nelle prime 24 ore è stata 90,3% e al 48 hr era 86,8%. Dei 30 (13,2%) guasti entro 48 ore, 5 (2,2%) hanno sperimentato paralisi degli arti posteriori e doveva essere l&#39;eutanasia, 10 (4,4%) aveva un cuore non batte a causa di lesioni ischemia trapianto e / o trombosi, mentre il 15 (6,6%) sono morti entro 48 ore. Alcuni sopravvivenza dell&#39;innesto sperimentali sono mo...

È stata dimostrata una tecnica per la procedura microchirurgica per il trapianto eterotopico di cuori nei topi, compresi i metodi semplificati per il prelievo del donatore e l'anastomosi del vaso ricevente.

Un metodo modificato per eterotopica mouse Cuore Trapianto

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

L'obiettivo generale di questa procedura è trapiantare un cuore da un donatore a un topo ricevente. Questo viene ottenuto innanzitutto rimuovendo il cuore dalla cassa toracica del donatore e conservandolo in soluzione salina fredda. I passaggi successivi consistono nel trapiantare il cuore nell'addome del ricevente e quindi monitorare il battito cardiaco trapiantato.Infine, il rigetto del trapianto viene confermato mediante ispezione visiva e analisi patologica. In definitiva, i risultati mostrano che i cuori trapiantati tra ceppi non imparentati di topi vengono rigettati, mentre i cuori trapiantati all'interno dello stesso ceppo vengono accettati. Una dimostrazione video a lungo termine di questa metodica è fondamentale, poiché le fasi microchirurgiche sono difficili da apprendere a causa delle dimensioni molto ridotte degli animali donatori e riceventi.La complessa procedura chirurgica richiesta e la necessità di aumentare precisione e velocità nell'esecuzione delle operazioni sul ricevente richiedono sempre di assicurarsi che tutti gli strumenti siano accuratamente puliti e sterilizzati in un bagno di etanolo al 80%. È fortemente consigliabile l'uso di dispositivi sterili monouso. Dopo aver anestetizzato il topo donatore in una camera contenente isoflurano, posizionarlo in posizione supina sulla tavola operatoria.Quindi collegare rapidamente il cono nasale, somministrando l'anestetico. Assicurarsi di verificare la qualità dell'anestesia mediante una leggera pressione sul piede posteriore. Se non si osserva alcuna reazione di ritrazione, procedere con la rasatura della pelle utilizzando una lama chirurgica.Quindi sterilizzare la cute con tre passate alternate di clorhexidina al 2% in alcol isopropilico al 70% durante tutta la durata dell'intervento chirurgico. Monitorare visivamente la respirazione e il battito cardiaco dell'animale. Regolare di conseguenza l'erogazione di isoflurano.Iniziare eseguendo una toracotomia per esporre il cuore e i vasi, aprendo il torace attraverso entrambi i lati della gabbia toracica. Tagliare dal margine delle costole fino all'ascella e in senso trasversale all'altezza dello sterno xifoideo. In questo modo si ottiene un lembo della parete toracica.Fissare con spilli il lembo aperto sulla tavola operatoria vicino alla testa. Quindi rimuovere il pericardio intorno al cuore. Sollevare la vena cava inferiore con una pinza ed iniettare un millilitro di soluzione salina eparinizzata fredda nella vena cava inferiore in prossimità del cuore.Quindi applicare una piccola pinza arteriosa alla VCI per evitare che la soluzione refluisca attraverso il foro dell'ago, utilizzando garza e un applicatore di cotone. Spostare il cuore verso il basso per esporre l'aorta e l'arteria polmonare. Il seno trasverso è il canale situato posteriormente al tronco dell'aorta e dell'arteria polmonare.Successivamente, recidere l'aorta e l'arteria polmonare il più distalmente possibile per massimizzare la lunghezza dei vasi per l'anastomosi. Ora dividere la VCI, la VCS destra, la VCS sinistra e le vene polmonari. Ognuna di queste deve essere legata separatamente utilizzando filo di seta 6.0.Prima, legare la vena cava inferiore (IVC) e la vena cava superiore destra (SVC). Quindi legare la vena cava superiore sinistra e le vene polmonari. A questo punto, rimuovere il cuore recidendo tutti i vasi a valle dei legamenti.Conservare il cuore in soluzione salina fredda e sterile a quattro gradi Celsius fino al trapianto. Dopo aver preparato l'animale per l'intervento chirurgico come descritto per il donatore, iniziare eseguendo una laparotomia. Tagliare lungo la linea mediana dal pube allo sterno xifoideo.Utilizzando graffette piegate a forma di retrattori, aprire l'addome, avvolgere l'intestino in garze imbevute di soluzione fisiologica calda e retrarle nell'angolo superiore destro dell'addome. Successivamente, esporre l'aorta infrarenale e la VCI tra la biforcazione iliaca e l'arteria e la vena renale sinistra.Liberare il segmento di aorta e VCI fascicolato. Successivamente, dividere l'aorta e la VCI dai vasi lombari utilizzando un dispositivo di cauterizzazione calibrato. Applicare piccole pinze atraumatiche alle estremità prossimale e distale del segmento di aorta e VCI liberato.Utilizzando un ago da 30 gauge, praticare un foro nella parete anteriore dell'aorta partendo dal taglio eseguito verticalmente, creando un foro delle dimensioni dell'aorta del donatore. Approfittare di questa fase per rimuovere eventuali coaguli sanguigni dalla luz dell'aorta mediante un risciacquo con soluzione salina eparinizzata. Introdurre ora il cuore del donatore in soluzione salina fredda.Posizionare il cuore donatore accanto all'incisione sull'aorta del ricevente. Posizionare l'arteria polmonare del donatore accanto alla VCI del ricevente utilizzando suture continue di nylon 10/0. Anastomizzare le aorte estremità-laterale.Iniziare dall'angolo prossimale e suturare lungo il lato sinistro fino all'angolo distale. Quindi ruotare l'animale di 180 gradi. Spostare quindi il cuore e continuare le suture attraverso il lato destro della parete aortica dal distale al prossimale.Prima di chiudere l'anastomosi, sciacquare delicatamente il lume con soluzione salina eparinizzata per eliminare coaguli e aria. Quindi completare la sutura. Successivamente, praticare un'incisione verticale nella parete anteriore della VCI dove verrà anastomosata l'arteria polmonare.In secondo luogo, utilizzare 10 punti di sutura continui per l'anastomosi. I vasi iniziano all'estremità distale della parete sinistra all'interno del lume della VCI all'estremità prossimale. Proseguire lungo la parete anteriore destra e suturare fino all'estremità distale. Ancora una volta.Sciacquare accuratamente il lume prima di completare l'anastomosi. Successivamente, posizionare pezzi di gel schiuma attorno all'anastomosi. L'emostasi viene raggiunta applicando una leggera pressione con applicatori di cotone.Per rivascolarizzare il ricevente. Rilasciare prima la pinza distale, poi quella prossimale. Durante l'intervento sul ricevente, è fondamentale ottimizzare l'accuratezza e la velocità dell'intervento chirurgico.Quindi, il tempo di clampaggio crociato è idealmente inferiore a 30 minuti. Per favorire il recupero, applicare soluzione salina calda a 37 gradi Celsius sul sito del trapianto. La fibrillazione dovrebbe essere immediata e ritornare spontaneamente al ritmo sinusale entro pochi minuti.Prima della chiusura del sito chirurgico, deve essere somministrata un'iniezione di buprenorfina per via intramuscolare. Completare l'intervento chiudendo la ferita con una suture continua riassorbibile 5-0 per tutti gli strati tissutali. Dopo la chiusura della ferita chirurgica, iniettare l'animale ricevente con ampicillina e un'iniezione sottocutanea di 0,6 millilitri di soluzione fisiologica.Per favorire l'idratazione, posizionare l'animale su un tappetino riscaldante impostato a 37 gradi Celsius A fino al recupero della coscienza. La maggior parte degli animali beve e persino mangia entro tre ore dall'intervento chirurgico. Se dopo otto ore il topo mostra ancora segni di malessere, somministrare iniezioni di buprenorfina ogni 12 ore fino alla risoluzione dei sintomi.Se il topo mostra segni di malessere per più di 48 ore, contattare un veterinario nei primi 10 giorni successivi all'intervento. Monitorare direttamente il battito cardiaco del trapianto mediante palpazione addominale. Giornalmente, registrare l'intensità del battito come quattro più per un trapianto sano fino a uno più per un battito debole dovuto a un rigetto avanzato.Registrare un innesto non battente come innesto negativo a causa del rigetto completo dell'innesto dopo 10 giorni. Continuare a monitorare il battito cardiaco dell'innesto tre volte alla settimana. Dopo 227 trapianti eterotopici di cuore, il 90,3% ha avuto successo entro 24 ore e l'86,8% entro 48 ore. I fallimenti hanno incluso paralisi degli arti posteriori, cuore non battente dovuto all'innesto, lesione ischemica e/o trombosi e morte. I sopravvissuti all'innesto sono stati catalogati.La causa del fallimento del trapianto cardiaco è stata stabilita mediante esame istopatologico. L'analisi del cuore trapiantato, qui indicato da una freccia, ha evidenziato trombosi e infarto del tessuto cardiaco, causa del fallimento di questo innesto nella combinazione di ceppi C 57 Black six come donatore e ricevente; in questo caso, nessun rigetto è avvenuto e i cuori trapiantati sono sopravvissuti per oltre 100 giorni. In questo caso, il cuore si era ridotto leggermente di dimensioni a causa di atrofia muscolare secondaria al suo stato non vitalizio.Al contrario, nella combinazione di ceppi con rigetto da donatore DBA due a ricevente C57 Black sei, questo cuore trapiantato aveva cessato di battere entro il settimo giorno e mostrava segni di rigetto entro i 100 giorni. Lo stesso cuore era completamente fibrotico e rattrappito una volta analizzato. Questa tecnica può essere eseguita in 90 minuti o meno se effettuata correttamente, e non dimenticare che lavorare con gas anestetici può essere estremamente pericoloso.L'utilizzo di un sistema di aspirazione dei gas anestetici è ampiamente disponibile.

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