Name: Singola lunghezza donda Ombra Imaging di Caenorhabditis elegans Stime Locomotion compresa Forza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Impara a misurare velocità e forze di nematodi in nuoto libero con imaging a ombra monocromatica su Caenorhabditis elegans. Questa tecnica a basso costo sostituisce la microscopia tradizionale per studiare la locomozione microscopica.

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Siamo grati per il sostegno del Research Institute Vassar College Undergraduate Summer (URSI), il salmone Fondo di ricerca Lucy Maynard, premio NASA No. NX09AU90A, National Science Foundation Center for Research Excellence in Scienza e Tecnologia (NSF-CREST) ​​award No. 0630388 e la NSF premio n ° 1058385.

1. C. elegans Preparazione <ol><li> Preparare le piastre di Petri di giovane adulto C. elegans come descritto in precedenti esperimenti che comportano la sospensione di C. elegans in un pieno di liquido cuvetta 11. </li><li> Il giorno della video analisi, raccogliere i giovani vivono nematodi adulti direttamente in una vaschetta riempita con acqua deionizzata, acqua distillata con un plettro di platino, come descritto al punto 2. </li><li> Preparare morti C. elegans all&#39;esposizione cloroformio. Proseguire seguendo la procedura descritta per la raccolta di nematodi vivi di cui al punto 2. </li></ol> 2. Setup ottico per l&#39;analisi video <ol><li> Assemblare setup sperimentale per creare immagini ombra come mostrato in Figura 1. La telecamera può essere collocata in qualsiasi distanza dallo schermo finché è in grado di acquisire una vista frontale dello schermo. Un buon posto è accanto alla cuvetta di fronte allo schermo. <ol><li> Utilizzando almeno due specchiguidare il sintonizzabile uscita laser a elio-neon in un espansore del fascio Galileo modo che il fascio è espanso ad un diametro di 12 mm. </li><li> Posizionare uno o due fori nel percorso ottico in modo che il fascio passa attraverso i forellini senza essere ostacolati. Utilizzare i fori per assicurare l&#39;allineamento viene mantenuto. </li><li> Dirigere il fascio esteso su una cuvetta di quarzo montato che è largo 10 mm, 10 mm di profondità e altezza 4 cm. </li><li> Ingrandire il fascio utilizzando una lente piano-convessa con una lunghezza focale positiva di 75 mm. </li><li> Collocare uno schermo di proiezione circa 120 cm dalla lente. Distanze maggiori di questo produrrà un maggiore ingrandimento dell&#39;immagine ombra. Tuttavia, la qualità dell&#39;immagine diminuisce con una intensità di luce inferiore e una maggiore noticeability di interferenza diffrazione. </li><li> Posizionare una telecamera ad alta velocità, che è capace di almeno 60 fps, proprio accanto alla cuvetta di fronte allo schermo. </li></ol></li><li> Posizionare un microscopio da dissezione vicino al set otticaper rapido trasferimento di nematodi nella cuvetta. </li><li> Fissare temporaneamente un righello trasparente con divisione mm al centro del supporto cuvetta perpendicolare al fascio espanso in modo che i progetti raggio un&#39;immagine ingrandita del righello sullo schermo. Impostare la scala di lunghezza per l&#39;analisi video. <ol><li> Sullo schermo di proiezione, marcare la distanza scala utilizzando un righello trasparente fuori centro dall&#39;immagine proiettata per evitare di interferire con la proiezione. <a href="Video_1_633nm.MOV" target="_blank">Clicca qui per il video.</a> </li><li> Registrare questa immagine e misurare l&#39;ingrandimento. Rimuovere il righello dal setup. Ripetere questa operazione per altre lunghezze d&#39;onda come l&#39;angolo di rifrazione della luce per ogni lunghezza d&#39;onda attraverso la lente può variare a causa di aberrazioni cromatiche. </li></ol></li><li> Rimettere la cuvetta e riempirlo di meno di 1 mm del cerchio con acqua distillata. </li><li> Iniziare la registrazione mentre la luce della stanza è in modo che la distanza scala è incluso nella stessametraggio come l&#39;immagine proiettata. Spegnere la luce. </li><li> Utilizzando un sottile, appiattito scelta filo di platino, spostare la persona giovane adulto C. elegans uno alla volta dalla piastra di agar nella cuvetta toccando il pick alla superficie dell&#39;acqua. Il nematode diventerà visibile nella colonna d&#39;acqua quando entra il fascio a causa di luce diffusa. <a href="Video_2_CB678_633nm.mov" target="_blank">Clicca qui per il video.</a> </li><li> Filmare le immagini proiettate dei vermi che passano attraverso il fascio laser espanso. È importante notare che l&#39;immagine proiettata è invertita ed i vermi sembrerà muoversi in direzione opposta del loro moto attuale. Worms che scendono con la gravità appariranno a muoversi verso l&#39;alto sullo schermo (Figura 2). </li></ol> Dati Preparazione Video 3. <ol><li> Importare il video nel programma di analisi video. </li><li> Impostare la scala utilizzando il fattore di ingrandimento precedentemente determinata. </li><li> Track lo spostamento lineare della testa del nematode ombreggiato con almeno 10 punti di dati per l&#39;intero percorso di presa. </li><li> Trovare la velocità nella direzione verticale prendendo derivato (&quot;Y&quot;, &quot;Time&quot;) e dividere il valore per il fattore di ingrandimento determinata nella fase 2.2. </li></ol> 4. Analisi dei dati <ol><li> Analizzare la discesa lineare di un C. elegans: <ol><li> Verificare che i punti dati sulla posizione verticale rispetto al grafico in tempo formano generalmente una linea retta. Alcune deviazioni possono essere ignorati a causa del movimento della testa del nematode. Se i punti dati formano generalmente una linea retta, continuano al punto 4.1.2, in caso contrario la discesa è lineare e l&#39;analisi deve essere continuato con passo 5.1 in questo protocollo. </li><li> Creare una linea di regressione lineare da una linea retta 12 ai dati dal menu Analysis. La pendenza di questa linea è poi la velocità verticale della C.elegans. La pendenza è il cambiamento di posizione diviso per il cambiamento nel tempo in un determinato intervallo. Determinare la velocità di discesa dei vermi vivi e morti in questo modo (figura 3). </li><li> La media delle velocità di nuoto verticale dal nematodi. Un campione di circa 50 vermi è sufficiente. Confronto velocità di nuotata in vermi vivi con velocità di deriva di vermi morti. </li></ol></li></ol> 5. Analisi non lineare Mozione di C. elegans <ol><li> Dalla sezione 3, selezionare un file video analizzato, che mostra una discesa lineare all&#39;interno della colonna d&#39;acqua (Figura 4). Una discesa non lineare può essere identificato con passo 4.1.1 in questo protocollo. </li><li> Selezionare &#39;Curve Fit&#39; dal menu &#39;analisi&#39; nel software di analisi video. Selezionare un secondo ordine (quadratica) polinomiale. Montare la curva. </li><li> Per una regione di interesse, regolare la calzata sul grafico facendo scorrere le staffe su ciascun lato of la misura sul grafico finché la curva è molto vicino ai punti di dati all&#39;interno della forma e / o ben all&#39;interno delle barre di errore. Il programma di montaggio dà una espressione matematica per la curva attrezzata, che è in posizione verticale rispetto al tempo. Considerare gli errori curva adattata trovati nel programma associato con le proprietà fisiche. Un errore relativo del 15% o inferiore è generalmente accettabile. </li><li> Aggiungere più curva adatta a coprire ulteriori sezioni di dati. Spline 13 le funzioni per una copertura ottimale: accertarsi che la curva si adatta sovrapposizione e cercare di allineare le curve adiacenti in modo che la partita piste nelle regioni di sovrapposizione. </li><li> Avere la velocità per una regione di interesse prendendo la derivata della curva adattata usando l&#39;espressione matematica ottenuto nella fase 5.1.3. Le velocità possono variare nel tempo. Si noti che la derivata è la pendenza di una funzione. Il derivato può essere ottenuta matematicamente o graficamente. In questo caso è pratico usare il dato expr matematicaessione. </li><li> Prendere la derivata seconda delle curve montati avere la accelerazione. L&#39;accelerazione può variare nel tempo. </li><li> Moltiplicare l&#39;accelerazione dalla massa worm per calcolare la spinta che il worm esercita. Una massa ragionevole stimata è di 3 mg assumendo che il worm consiste principalmente di acqua. </li></ol>

<ol><li>Ward, A., Lie, J., Feng, Z., Xu, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neurosci. 11, 916-922 (2008).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La tecnica SWSI fornisce un ulteriore modo per capire le capacità locomotorie di organismi microscopici, come i nematodi a vita libera. Con questa tecnica abbiamo distinto tra locomozione attiva (nuoto) e la deriva passive dovute alla circolazione gravità su nematodi morti. Inoltre, quando nematodi privo di nuoto cambiare direzione durante la locomozione in acqua, siamo in grado di misurare le forze di resistenza e le forze angolari, che operano sui nematodi e esercitate dai nematodi. Nematodi incontrano diverse condizioni ambientali nel suolo. Ci sono sacche d&#39;acqua all&#39;interno del suolo, nonché particelle solide e materiali biologici di diverse forme e texture. Inoltre, esistono nematodi in un ambiente gravitazionale che rispondono a 14. Inoltre, nematodi vicino alla superficie del terreno sono esposti a differenti lunghezze d&#39;onda della luce, variazioni di temperatura e umidità, e anche biologicovariabili come batteri, funghi predatori e altri organismi del suolo. Nematodi devono rispondere a tutte queste diverse variabili, il nuoto e strisciando in diversi media, trasformando e modificando le strategie di navigazione. Tutti questi calcoli complessi vengono svolte solo da 302 neuroni, un sottoinsieme dei quali sono coinvolti nella locomozione, e 95 cellule muscolari della parete del corpo. Misure del genere descritto dalla tecnica SWSI forniscono importante comprendere come i nematodi realizzare questa complessità di navigazione. Per la prima parte, abbiamo misurato il tasso complessivo discendente di tipo selvatico C. elegans a 633 nm luce. Utilizzando queste misure, possiamo stimare la forza di resistenza un verme incontri. Per il caso di studio di un nematode accelerazione, le forze coinvolte cambiamento continuo in quanto i cambiamenti di forza di trascinamento con la velocità. Ci sono alcune affermazioni che siamo in grado di fare circa le forze che agiscono sul verme. Come il worm rallenta e cerca di swim verso l&#39;alto la componente verticale della forza di resistenza diminuisce fino a raggiungere zero al punto più basso della traiettoria del nematode. A questo punto, il verme deve avere una forza verso l&#39;alto per swim up. Questo metodo può essere modificata in diversi modi. Tutte le specie microscopiche che naviga in un liquido trasparente si possono seguire con SWSI. Studi possono essere condotti con eventuali lunghezze d&#39;onda che sono accessibili a fotocamere digitali. Le fotocamere digitali in genere raccogliere lunghezze d&#39;onda che vanno dal UV al vicino IR. Inoltre, studi orizzontali possono essere condotte da dirigere il laser verticalmente verso l&#39;alto. La specie possono essere collocati su una superficie orizzontale trasparente, come un vetrino da microscopio. Regolare l&#39;espansore trave o la lente d&#39;ingrandimento dopo l&#39;expander fascio può affinare le immagini sfocate. L&#39;utente deve assicurarsi di fissare tutti i componenti al tavolo per garantire l&#39;allineamento coerente e facile trave. Il metodo è limitato dalla wavelengt laserhs e la risoluzione. In sostanza i vantaggi di questo metodo rispetto microscopi esistenti, che sono la flessibilità in direzioni e lunghezze d&#39;onda, sono anche debolezze poiché la configurazione è semplice. L&#39;ottica sofisticati e macchie di laser limitano la risoluzione. Alcuni di questi inconvenienti può certamente essere migliorato in futuro includendo filtro spaziale e proietta l&#39;immagine direttamente su una telecamera CCD. Le fasi più critiche del protocollo possono essere facilmente apprese come l&#39;esperimento viene eseguita per la prima volta. Posizionamento del nematode nella cuvetta senza creare turbolenze è critica. Inoltre, le vibrazioni possono disturbare la configurazione e modificare il comportamento dei vermi. Assicurarsi di limitare la potenza, che viene utilizzato per ombra dell&#39;immagine. 2 mW per un fascio laser che è di 1 mm di diametro dovrebbe essere il massimo per evitare effetti di riscaldamento. L&#39;installazione dovrebbe essere testato per la dispersione effetti quando si utilizzano liquidi diversi dall&#39;acqua distillata. Attualmente la maggior parte microscopes operano su un piano orizzontale mediante luminosi o di colore bianco filtri, che sono ancora molto ampio nella gamma di lunghezza d&#39;onda. Microscopi che utilizzano veramente singole lunghezze d&#39;onda e hanno flessibilità nello scenario visualizzazione, cioè posizionamento orizzontale, di solito non è un vantaggio o l&#39;altro. Inoltre, questi tipi di microscopi sono solitamente molto costosi e ancora limitata ai piani focali differenza nostro metodo. La nostra impostazione può essere facilmente costruito con un budget estremamente basso. Questo metodo è pronto per essere utilizzato da scuole, aziende ambientali nonché altri soggetti che operano con risorse limitate. In futuro, questo metodo può essere usato in una configurazione molto sofisticato per studiare effetti in tempo reale su locomozione e mechanosensation di specie microscopiche. Questo metodo rende studi singola lunghezza d&#39;onda in una vasta gamma di angoli e profondità di visione facilmente disponibili.

Caenorhabditis elegans è un nematode terreno favorevole a vita libera che è un potente organismo modello per lo studio dei meccanismi di regolazione genica, sviluppo e più recentemente per la comprensione della biologia e del comportamento sensoriale. Pur avendo solo 302 neuroni, C. elegans sono capaci di modelli complessi locomotoria, comportamenti riproduttivi, la navigazione, la chemiotassi e molti altri comportamenti. C. elegans possiedono meccanocettori, chemiorecettori e persino di rilevare le lunghezze d&#39;onda di luce blu (Ward et al., 2008) 1. Mentre si sa molto circa i circuiti neurali della funzione sensomotoria e modelli locomotore generali in C. elegans, meno si sa circa le risposte a molteplici stimoli simultanei o condizioni ambientali più complessi di quanto può essere modellata sotto un microscopio. Alcuni studi hanno rivelato modelli locomotore più complessi che sono 2,3,4 altamente plastica. Il nostro approccio metodologico permetterà studi di nematodes in soluzione in tempo reale in cui possiamo facilmente fornire molteplici condizioni ambientali contemporaneamente. Questa domanda è difficile da affrontare utilizzando tecniche di imaging basata microscopio convenzionali. Abbiamo sviluppato una tecnica di imaging che ci permette di collocare nematodi all&#39;interno di una colonna d&#39;acqua di esaminare comportamenti locomotoria, nonché determinare le capacità di nematodi cambiare locomozione in risposta a differenti condizioni ambientali. Singola lunghezza d&#39;onda Ombra Imaging (SWSI) viene presentato in questo lavoro per la prima volta ad affrontare le carenze di microscopi tradizionali. Microscopi tradizionali sono limitati a osservare specie in un piano focale orizzontale pochi micron di profondità 5,6. Per quanto riguarda gli studi singola lunghezza d&#39;onda, la maggior parte dei microscopi tradizionali usano filtri colorati per filtrare la luce bianca molto ampia, in genere, 50-100 nm. Utilizzando un laser per SWSI restringe la selezione di lunghezza d&#39;onda inferiore a 1 nm mantenendo segnoificant intensità della luce 7. Analogamente, singole lunghezze d&#39;onda sono state utilizzate per misurare frequenze nuoto di C. elegans in tempo reale 8. Per la prima dimostrazione del nostro metodo, abbiamo monitorare la posizione orizzontale, x, e la posizione verticale, y, di una C. banche nuoto elegans in una colonna d&#39;acqua, per una distanza di circa un centimetro. In particolare, ci interessa il movimento verticale da gravità agisce anche in verticale. La pendenza di una misura lineare alla posizione verticale fornisce la velocità verticale, v y, del nematode mentre scende nella colonna d&#39;acqua: <img alt="Formula" fo:content-width="0.5in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq1.jpg" width="50" /> (1) Il quadratico medio dell&#39;errore (RMSE) 9 indica la qualità della forma e indica se la velocità di discesa è generalmente costante. Le velocità verticali sono poi mediati per each specie e vermi morti. L&#39;utilizzo di questi risultati, la resistenza, che l&#39;esperienza worm può essere stimato. Per la seconda dimostrazione del nostro metodo, abbiamo selezionato C. elegans che non scendono a velocità costante a differenza della maggior parte dei vermi osservati. I vermi selezionati sia girato e nuotato verso l&#39;alto o aleggiava per un po &#39;prima di continuare la discesa. Fisicamente, questo caso studio mostra che la spinta di un microrganismo nuoto può essere calcolato. Leggi di Newton dettano che un corpo che cambia indicazioni accelera, il che implica una forza netta, <img alt="Formula 1" fo:content-width="0.3in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq.jpg" width="25" /> , Agisce su quel corpo 10: <img alt="Formula 2" fo:content-width="0.7in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq2.jpg" width="70" /> (2) dove <img alt="p" fo:content-width="0.1in" src="/files/ftp_upload/51424/51424p.jpg" width="10" /> èla quantità di moto e t è il tempo. L&#39;accelerazione del verme è direttamente proporzionale alla forza che agisce sul verme poiché la massa del verme rimane costante. Come risultato, la forza netta verticale è: <img alt="Formula 3" fo:content-width=".8in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq3.jpg" width="70" /> (3) dove m è la massa di un verme e un y rappresenta l&#39;accelerazione verticale. La forza netta nella direzione verticale rappresenta la propulsione verme nella stessa direzione. La spinta totale può essere calcolato dalla componente orizzontale in considerazione.

<table><tbody><tr><td>Laser elio-neon sintonizzabile&nbsp;</td><td>Ricerca Elettro-Ottica</td><td>30602</td><td>È possibile selezionare quattro lunghezze d'onda tra 543 nm e 633 nm.</td></tr><tr><td>2 Specchi in alluminio con superficie frontale</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-F01</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera Exilim ad alta velocità</td><td>Cuvetta</td> al quarzo Casio <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Starna Cells</td><td>21/G/5</td><td></td></tr><tr><td>LoggerPro (Software)</td><td>Vernier</td><td></td><td>http://www.vernier.com/products/software/lp/</td></tr> <tr><td>Mathematica 8</td><td>Wolfram</td><td></td><td>http://www.wolfram.com/</td></tr><tr><td>Zoom variabile 5x-10x Espansore di fascio galileiano</td><td>Thorlabs</td><td>BE05-10-A</td><td></td></tr><tr><td>Lente piano-convessa con una lunghezza focale positiva di 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1257</td><td></td></tr></tbody></table>

singola lunghezza d&#39;onda ombra imaging di<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; stime locomotion compresa forza

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Questo studio dimostra una tecnica poco costoso e semplice che permette la misura di proprietà fisiche come posizione, velocità, accelerazione e forze coinvolte nel comportamento locomotorio di nematodi sospesi in una colonna di acqua in risposta a singole lunghezze d&#39;onda della luce. Dimostriamo come valutare la locomozione di un organismo microscopico utilizzando Lunghezza d&#39;onda singola ombra Imaging (SWSI) utilizzando due diversi esempi. Il primo esempio è uno studio sistematico e statisticamente valida della discesa media di C. elegans in una colonna d&#39;acqua. Per questo studio, abbiamo utilizzato vivi e morti di tipo selvatico C. elegans. Quando abbiamo confrontato la velocità e la direzione del nematode movimento attivo con la discesa passivo di vermi morti all&#39;interno del campo gravitazionale, questo studio ha mostrato alcuna differenza nella discesa volte. La discesa media è stata di 1,5 mm / sec ± 0.1 mm / sec per entrambi i vermi vivi e morti con 633 nm coerenteluce. Il secondo esempio è un caso di studio di selezione individuale C. elegans cambiare direzione durante la discesa in una colonna d&#39;acqua verticale. Accelerazione e forza vengono analizzati in questo esempio. Questo studio dimostra la portata di altre proprietà fisiche che possono essere valutati utilizzando SWSI durante la valutazione del comportamento utilizzando singole lunghezze d&#39;onda in un ambiente che non è accessibile con microscopi tradizionali. Utilizzando questa analisi abbiamo stimato un individuo nematode è in grado di spingere con una forza superiore a 28 nN. I nostri risultati indicano che i nematodi vivono esercitano 28 nN quando si gira, o muoversi contro il campo gravitazionale. I risultati suggeriscono inoltre che nematodi passivamente discendono in una colonna d&#39;acqua, ma possono resistere attivamente la forza di gravità principalmente dal senso di rotazione.

Discesa costante La prima indagine mostra alcuna differenza distinguibile nei tassi discendenti della C. elegans durante SWSI usando 633 nm. I tassi discendente sono risultati essere costante a 1,5 mm / sec ± 0.1 mm / sec sia per il vivo e il morto C. elegans. Un campione di 50 worm ha generato una variazione ragionevole del 7% sia per vivere e vermi morti. Non c&#39;è accelerazione agendo sulle viti senza fine poiché la velocità di discesa è costante, in modo che la forza di resistenza è uguale alla forza gravitazionale meno la forza di galleggiamento. Ciò implica che la densità del verme è leggermente più grande di quella dell&#39;acqua; tuttavia, per le stime sottostanti è ancora pratico supporre che la densità di un nematode è all&#39;incirca quella dell&#39;acqua. Modifica della Direzione La seconda indagine, un caso di studio, dimostra che i nematodi sono in grado di cambiare direzione e possono nuotare verso l&#39;alto controgravità. Due curve sono stati montati allo spostamento verticale del nematode modo che le seconde derivate di quelle curve potrebbero essere calettato grafico dell&#39;accelerazione in funzione del tempo (Figura 5). &#160; È consigliabile mantenere l&#39;ordine polinomiale più basso possibile, pur mantenendo una buona misura. Un polinomio inferiore indica meno variazione dell&#39;accelerazione nel tempo. I termini polinomiali di ordine superiore saranno trascurabili, e quindi inutile, se l&#39;ordine del polinomio è troppo alta. Questo verme decelera a una velocità costante di 0,110 millimetri / sec 2 ± 0,002 millimetri / sec 2, gira e accelera allo stesso tasso 0,110 millimetri / sec 2 ± 0,002 millimetri / sec 2 fino a poco dopo il punto di svolta. La C. elegans continua a muoversi verso l&#39;alto con un&#39;accelerazione diminuzione di 1,252-,00708 t in mm / sec 2 finché l&#39;accelerazione scende a zero. Tenendo presente Eq. 3, ed una massa verme stimato 3 e #956, g, il worm viene sottoposto ad una forza netta verticale, F Ny, di 0,33 pN fino a poco dopo il punto di svolta. Discesa: Ci sono tre tipi di forze che agiscono sul verme fino a quando il verme raggiunge il punto di svolta: la gravità, trascinare, galleggiabilità e di spinta (Figura 6a). La forza netta è uguale alla somma vettoriale delle tre forze. Qui consideriamo solo i componenti verticali: F Ny = F + F Dy Ty-F g + F B (4) dove F B è la forza di galleggiamento. F g è uguale in grandezza ma opposto in direzione della forza di galleggiamento supponendo che la densità del verme è quello dell&#39;acqua. Eq. 4 può essere scritta nel seguente modo: F Ny = F + F Dy Ty (5) F Ny rimane costante durante la discesa. Ciò implica cheF Dy + F Ty rimane costante fino a quando il nematode raggiunge il punto di svolta. F Dy è più grande nella parte superiore, che è l&#39;inizio del percorso, e si riduce gradualmente fino a zero la velocità è zero al punto svolta mentre F Ty deve aumentare per mantenere costante F Ny. Turnaround: Non c&#39;è forza di trascinamento in senso verticale alla svolta in quanto la velocità verticale pari a zero in quel punto. Le sole forze che agiscono nella direzione verticale sono gravità, - F g, galleggiabilità, F B e il verme spinta verticale, F Ty, come illustrato nella Figura 6b. A questo punto, la spinta della C. elegans possono essere determinate: F Ty = F Ny (6) La spinta in basso della traiettoria è quindi pari a circa 0,33 pN, che è circa 0,001% del peso del verme. Tenendoconto che il peso stimato, F g di C. elegans è 28 nn, Salita: Allo stesso modo, durante la salita, trascinare aumenta ma è puntato verso il basso (Figura 6c): F Ny =-F Dy + F Ty (7) La spinta implementato dal verme deve ora essere ancora più grande e uguale alla somma della forza di resistenza e il peso. Il worm sta rallentando dopo aver iniziato a nuotare in su. Per risalire alla stessa velocità come il verme discese, il verme dovrebbe esercitare una spinta verso l&#39;alto pari ad almeno due volte il suo peso. Librarsi Un esempio di un verme che rallenta la discesa per circa 3 sec è presentato in Figura 7. &#160; Un polinomio di 3 ° grado è una misura ragionevole per il percorso complessivo. Gli errori in accelerazione e velocità di questa misura sono inferiori al 15%. Il verme inizia con un significativo upward di spinta, rallenta e comincia a girare intorno a 68 sec; tuttavia, l&#39;accelerazione diminuisce continuamente verso l&#39;alto (Figura 8) &#160; fino a quando l&#39;accelerazione netta uguale a zero intorno 68,5 sec. Questo conduce infine a una netta accelerazione nella direzione verso il basso seguito da un altro punto della velocità zero (Figura 9) &#160; e il nematode inizia a scendere nuovamente a 69 sec. È interessante notare che l&#39;accelerazione verticale massima osservata in questo caso è di 2,7 mm / sec 2. L&#39;accelerazione nei punti di svolta sono 0,455 millimetri / sec 2 e - 0,455 millimetri / sec, rispettivamente, 2; circa quattro volte più grande che nel caso del nematode che gira e nuota. Uso Eq. 6, si può stimare che la spinta verso l&#39;alto è di circa 1,32 pN al primo punto di svolta. Al secondo punto di svolta, l&#39;accelerazione netto è negativo in modo che la spinta verso l&#39;alto è 1.32 pN. o: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig1.jpg" /> Figura 1. Impostazione sperimentale. Il laser, il fascio di espansione, l&#39;obiettivo e lo schermo sono essenziali per il setup sperimentale. Gli specchi di sterzo e fori possono essere omessi, ma farà l&#39;allineamento ottico meno stabile. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig2.jpg" /> Figura 2. Lunghezza d&#39;onda singola ombra Image (SWSI). Usando 2 mW di luce laser 543 nm l&#39;ombra di un worm viene proiettata su uno schermo. L&#39;immagine viene invertito in modo che il nematode sembra rientrare verso l&#39;alto. 424/51424fig3highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51424/51424fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Discesa verticale di un unico tipo selvatico C. elegans in una colonna d&#39;acqua. Questo nematode è stato pedinato da 633 nm luce coerente. La pendenza della regressione lineare indica una velocità di discesa di 1,09 mm / sec ± 0.01 mm / sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig4.jpg" /> Figura 4. Grafico spostamento di un singolo rialzo nuoto di tipo selvatico C. elegans. due attacchi scanalati tracciano il percorso complessivo del nematode. La derivata seconda della forma rivela l&#39;accelerazione. L&#39;accelerazione massima è facilmente desumibile da primo fit: 0,110 millimetri<html> / Sec 2 ± 0,002 millimetri / sec 2. Solo poche barre di errore vengono visualizzati in modo che i punti dati e la vestibilità rimangono visibili. Questo nematode è stato pedinato da 633 nm luce coerente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig5.jpg" /> Grafico Figura 5 Accelerazione. Di un unico tipo selvatico C. elegans. Questo nematode mantiene una costante accelerazione verso l&#39;alto di 0,110 millimetri / sec 2 ± 0,002 millimetri / sec 2 inducendolo a rallentare e quindi spostare verso l&#39;alto. Poco dopo il punto di svolta l&#39;accelerazione diminuisce costantemente e l&#39;accelerazione netto diminuisce a zero.<html> g &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig6.jpg" /> Diagrammi di Figura 6. Forza per discesa, punto e risalita. Galleggiabilità e la gravità di tornitura sono uguali in modulo e direzione opposta in modo che l&#39;effetto di tali forze si annullano a vicenda. Essi non sono quindi mostrati in questi diagrammi. (A) Il worm sta scendendo con il drag e la spinta verso l&#39;alto. (B) Il worm è al punto più basso della traiettoria senza resistenza. Spinta è rivolta verso l&#39;alto. (C) Il worm è crescente con il drag rivolto verso il basso mentre la spinta è rivolta verso l&#39;alto. &quot;Src =&quot; / files/ftp_upload/51424/51424fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. Grafico spostamento del singolo nematode bilico. Il worm rallenta e comincia a girare intorno a circa 68 secondi, ma inizia a scendere intorno al 69 sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig7highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig8.jpg" /> .. Figura 8 grafico accelerazione di un singolo nematode bilico Questo worm inizia con un&#39;accelerazione verso l&#39;alto di 2,7 millimetri / sec 2, riduce a zero e, infine, ha una accelerazione verso il basso di -. 2,6 millimetri / sec 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig8highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere un grande vers</a>ione di questa figura. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig9.jpg" /> Figura 9. Grafico della velocità di un singolo nematode bilico. Questo worm si ferma a 68 sec e inizia a dirigersi verso l&#39;alto, rallenta e raggiunge la velocità zero nella direzione verticale a 69 sec seguita da una discesa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig9highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare un grande versione di questa figura.</a> <img alt="Tabella 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424table1.jpg" width="400" /> Tabella 1. Velocità media di discesa di N2 C. elegans. vivo 50 e 50 nematodi morti sono tracked durante la loro discesa. La velocità media per le discese è lo stesso per la vita e le vermi morti: 1,5 mm / sec ± 0.1 mm / sec.

La tecnica qui presentata misura il percorso di nuotare liberamente specie microscopiche con esposizione singola lunghezza d&#39;onda. C. elegans sono utilizzati per dimostrare l&#39;imaging ombra come un&#39;alternativa economica ai costosi microscopi. Questa tecnica può essere adattata per ospitare diversi orientamenti, ambienti e specie per misurare direzione, velocità, accelerazione e forze.

Singola lunghezza d&#39;onda Ombra Imaging di<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Stime Locomotion compresa Forza

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare e valutare la velocità lungo il percorso verticale e le forze esercitate da un nematode in nuoto libero mediante radiazione monocromatica coerente. Questo risultato si ottiene innanzitutto configurando un esperimento di ombra monocromatica coerente per lo studio del nuoto libero di sea elegance. Successivamente, un singolo esemplare adulto di sea elegance viene posizionato nella camera di osservazione dell'esperimento in condizione di ombra, che è un vet.L'ombra del verme mentre scende attraverso il fascio laser viene registrata come un filmato, e questo filmato viene utilizzato per analizzare il movimento dell'animale. Pertanto, viene determinato il percorso di un nematode in nuoto libero e le forze associate generate. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia tradizionale in un piano orizzontale, è che il movimento di microorganismi in nuoto libero può essere studiato utilizzando un'ampia gamma di luce monocromatica a basso costo.Questo metodo può rispondere a domande fondamentali riguardo le forze generate da, o alle quali rispondono, i nematodi in un ambiente liquido. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo iniziato a esplorare il concetto di movimento verticale per specie microscopiche. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi procedurali sono difficili da apprendere, in quanto è necessario un po' di esercizio per ottenere un allineamento corretto del laser.Inoltre, è necessario trascorrere un certo tempo in laboratorio biologico per imparare come preparare i vermi e allestire il dispositivo sperimentale per creare immagini d'ombra. Utilizzare due o più specchi per indirizzare il laser all'elio-neon nel dilatatore di fascio galileiano, dove il diametro del fascio dovrebbe aumentare fino a 12 millimetri. Posizionare uno o due fori stenopeici lungo il percorso del fascio per garantirne l'allineamento proveniente dal dilatatore.Orientare il fascio verso una cella di quarzo montata. Dopo aver attraversato la cella, il fascio viene ampliato mediante una lente piano-convessa con una lunghezza focale positiva di 75 millimetri. Successivamente, posizionare uno schermo a circa 120 centimetri dalla lente, che corrisponde alla distanza di risoluzione ottimale.Posizionare una telecamera ad alta velocità in un punto in cui possa riprendere lo schermo, ad esempio vicino al Q vet. Anche un microscopio stereoscopico per il prelievo dei vermi dovrebbe trovarsi nelle vicinanze del qve. Fissare temporaneamente un righello trasparente con divisioni in millimetri al centro del supporto QVAD sullo schermo, vicino al margine del campo visivo della telecamera.Utilizzare le linee del righello per segnare la distanza della scala corrispondente a un millimetro. Eseguire questa operazione per ogni lunghezza d'onda utilizzata, poiché la rifrazione varierà a causa delle aberrazioni cromatiche nel QV e dei cambiamenti nell'ingrandimento come descritto in precedenza. In JoVE, avere pronti nematodi giovani adulti per il qve.Preparare anche nematodi morti a seguito di esposizione al cloroformio. Iniziare riempiendo il Q Vet con acqua distillata fino a un millimetro dal bordo. Avviare una registrazione con le luci della stanza accese, in modo che la linea sullo schermo sia inizialmente visibile, quindi spegnere le luci della stanza.Quindi raccogliere un nematode con un bastoncino di platino. È importante posizionare i vermi nel vetto leggermente toccando il bastoncino sulla superficie dell'acqua senza agitare il mezzo. L'immagine proiettata del verme e della colonna d'acqua è invertita.I vermi che si muovono in discesa seguendo la forza di gravità appariranno spostarsi verso l'alto sullo schermo. Per ogni verme registrare circa 20 secondi e raccogliere circa 50 vermi per ogni condizione. Inizialmente, importare il video nel programma di analisi video.Impostare la scala utilizzando le marcature di lunghezza nel video per determinare il fattore di ingrandimento. Quindi iniziare a tracciare lo spostamento lineare della testa del nematode in ombra. Selezionare almeno 10 punti dati lungo il percorso, uno ogni 0,3 secondi circa.La velocità verticale viene quindi calcolata a partire dalla derivata divisa per il fattore di ingrandimento. È fondamentale creare curve separate per lo spostamento orizzontale e quello verticale, poiché la gravità agisce soltanto nella direzione verticale.Se i punti dati formano una linea generalmente retta, il percorso è lineare. Alcune deviazioni del movimento della testa possono essere ignorate. Successivamente, dal menu di analisi, crea una retta di regressione lineare adattando una linea retta ai dati.La pendenza della linea corrisponde alla velocità verticale del verme. Se un verme si muove in modo non lineare, selezionare l'adattamento curvilineo dal menu di analisi. Successivamente, adattare la curva a un polinomio del secondo o del terzo ordine.Un polinomio per ogni curva nel percorso adatta una curva ai dati. Spostando le parentesi su ciascun lato del grafico, viene mostrata l'espressione matematica della curva. Un errore relativo fino al 15% è accettabile.Aggiungere ulteriori curve secondo necessità per coprire i punti dati e tentare di interpolare le funzioni con una spline. Le curve interpolate devono avere la stessa pendenza nelle regioni di sovrapposizione. La prima e la seconda derivata della curva forniscono rispettivamente la velocità e l'accelerazione.La spinta è calcolata utilizzando tre microgrammi come massa del verme durante la deriva; non è stata osservata una differenza distinguibile nei tassi di discesa tra esemplari vivi e morti di *C. elegans*. Il tasso di deriva verso il basso per entrambi era di 1,5 millimetri al secondo. Tuttavia, i nematodi vivi sono in grado di cambiare direzione e nuotare contro gravità; in tal caso, si adattano curve allo spostamento verticale del nematode e l'accelerazione è calcolata a partire dalle loro derivate seconde.Le forze che agiscono sul verme fino a quando il verme raggiunge il punto di inversione sono la forza di gravità, la resistenza viscosa, la spinta di Archimede e la spinta propulsiva. La forza risultante è pari alla loro somma vettoriale. Considerare le componenti verticali della forza.La forza gravitazionale è uguale in modulo alla forza di galleggiamento, assumendo che il verme abbia una densità circa pari a quella dell'acqua, quindi l'equazione può essere semplificata fino al punto di inversione. La resistenza più la spinta sono costanti. Inizialmente la resistenza è maggiore, ma si riduce gradualmente a zero mentre la spinta aumenta; al punto di inversione, non vi è alcuna resistenza verticale e la spinta è diretta verso l'alto durante il movimento del verme.L'attrito di salita verticale aumenta in direzione discendente, quindi la forza di spinta deve essere maggiore della somma di attrito e peso. È stato analizzato il percorso non lineare di questo verme. Ha cambiato direzione.Osservando lo spostamento, ha rallentato ed è iniziato a invertire la direzione a 68 secondi. Tuttavia, l'accelerazione verso l'alto è diminuita continuamente fino a quando l'accelerazione netta ha raggiunto zero a 68,5 secondi. Successivamente, ha iniziato ad accelerare nella direzione negativa per ridiscendere.Pertanto, quando la velocità era nulla, il verme esercitava una spinta verso l'alto significativa, calcolata in 1,32 piconewton. Una volta acquisita padronanza della tecnica, i dati possono essere raccolti entro 10 minuti, a condizione che i vermi siano pronti per essere prelevati dall'archimede. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere costante la frequenza di registrazione della telecamera per tutti i dati acquisiti, poiché è necessario regolare la velocità dei fotogrammi nel programma di analisi video successivamente a questa procedura. Altri studi possono essere condotti, ad esempio studi a singola lunghezza d'onda, per rispondere a domande come quali forze vengono esercitate in diverse direzioni, verticale e orizzontale.Ad esempio, questa tecnica ottica potrebbe essere utilizzata da altri biologi interessati alle proprietà della locomozione di piccoli organismi come Proti o altri organismi acquatici. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere un'idea abbastanza chiara di come analizzare il movimento di microorganismi in libera nuotata utilizzando l'ingrandimento delle immagini d'ombra e successivamente un programma di analisi video.

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