Singola lunghezza d'onda Ombra Imaging di

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare e valutare la velocità lungo il percorso verticale e le forze esercitate da un nematode in nuoto libero mediante radiazione monocromatica coerente. Questo risultato si ottiene innanzitutto configurando un esperimento di ombra monocromatica coerente per lo studio del nuoto libero di sea elegance. Successivamente, un singolo esemplare adulto di sea elegance viene posizionato nella camera di osservazione dell'esperimento in condizione di ombra, che è un vet.

L'ombra del verme mentre scende attraverso il fascio laser viene registrata come un filmato, e questo filmato viene utilizzato per analizzare il movimento dell'animale. Pertanto, viene determinato il percorso di un nematode in nuoto libero e le forze associate generate. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia tradizionale in un piano orizzontale, è che il movimento di microorganismi in nuoto libero può essere studiato utilizzando un'ampia gamma di luce monocromatica a basso costo.

Questo metodo può rispondere a domande fondamentali riguardo le forze generate da, o alle quali rispondono, i nematodi in un ambiente liquido. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo iniziato a esplorare il concetto di movimento verticale per specie microscopiche. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi procedurali sono difficili da apprendere, in quanto è necessario un po' di esercizio per ottenere un allineamento corretto del laser.

Inoltre, è necessario trascorrere un certo tempo in laboratorio biologico per imparare come preparare i vermi e allestire il dispositivo sperimentale per creare immagini d'ombra. Utilizzare due o più specchi per indirizzare il laser all'elio-neon nel dilatatore di fascio galileiano, dove il diametro del fascio dovrebbe aumentare fino a 12 millimetri. Posizionare uno o due fori stenopeici lungo il percorso del fascio per garantirne l'allineamento proveniente dal dilatatore.

Orientare il fascio verso una cella di quarzo montata. Dopo aver attraversato la cella, il fascio viene ampliato mediante una lente piano-convessa con una lunghezza focale positiva di 75 millimetri. Successivamente, posizionare uno schermo a circa 120 centimetri dalla lente, che corrisponde alla distanza di risoluzione ottimale.

Posizionare una telecamera ad alta velocità in un punto in cui possa riprendere lo schermo, ad esempio vicino al Q vet. Anche un microscopio stereoscopico per il prelievo dei vermi dovrebbe trovarsi nelle vicinanze del qve. Fissare temporaneamente un righello trasparente con divisioni in millimetri al centro del supporto QVAD sullo schermo, vicino al margine del campo visivo della telecamera.

Utilizzare le linee del righello per segnare la distanza della scala corrispondente a un millimetro. Eseguire questa operazione per ogni lunghezza d'onda utilizzata, poiché la rifrazione varierà a causa delle aberrazioni cromatiche nel QV e dei cambiamenti nell'ingrandimento come descritto in precedenza. In JoVE, avere pronti nematodi giovani adulti per il qve.

Preparare anche nematodi morti a seguito di esposizione al cloroformio. Iniziare riempiendo il Q Vet con acqua distillata fino a un millimetro dal bordo. Avviare una registrazione con le luci della stanza accese, in modo che la linea sullo schermo sia inizialmente visibile, quindi spegnere le luci della stanza.

Quindi raccogliere un nematode con un bastoncino di platino. È importante posizionare i vermi nel vetto leggermente toccando il bastoncino sulla superficie dell'acqua senza agitare il mezzo. L'immagine proiettata del verme e della colonna d'acqua è invertita.

I vermi che si muovono in discesa seguendo la forza di gravità appariranno spostarsi verso l'alto sullo schermo. Per ogni verme registrare circa 20 secondi e raccogliere circa 50 vermi per ogni condizione. Inizialmente, importare il video nel programma di analisi video.

Impostare la scala utilizzando le marcature di lunghezza nel video per determinare il fattore di ingrandimento. Quindi iniziare a tracciare lo spostamento lineare della testa del nematode in ombra. Selezionare almeno 10 punti dati lungo il percorso, uno ogni 0,3 secondi circa.

La velocità verticale viene quindi calcolata a partire dalla derivata divisa per il fattore di ingrandimento. È fondamentale creare curve separate per lo spostamento orizzontale e quello verticale, poiché la gravità agisce soltanto nella direzione verticale.

Se i punti dati formano una linea generalmente retta, il percorso è lineare. Alcune deviazioni del movimento della testa possono essere ignorate. Successivamente, dal menu di analisi, crea una retta di regressione lineare adattando una linea retta ai dati.

La pendenza della linea corrisponde alla velocità verticale del verme. Se un verme si muove in modo non lineare, selezionare l'adattamento curvilineo dal menu di analisi. Successivamente, adattare la curva a un polinomio del secondo o del terzo ordine.

Un polinomio per ogni curva nel percorso adatta una curva ai dati. Spostando le parentesi su ciascun lato del grafico, viene mostrata l'espressione matematica della curva. Un errore relativo fino al 15% è accettabile.

Aggiungere ulteriori curve secondo necessità per coprire i punti dati e tentare di interpolare le funzioni con una spline. Le curve interpolate devono avere la stessa pendenza nelle regioni di sovrapposizione. La prima e la seconda derivata della curva forniscono rispettivamente la velocità e l'accelerazione.

La spinta è calcolata utilizzando tre microgrammi come massa del verme durante la deriva; non è stata osservata una differenza distinguibile nei tassi di discesa tra esemplari vivi e morti di *C. elegans*. Il tasso di deriva verso il basso per entrambi era di 1,5 millimetri al secondo. Tuttavia, i nematodi vivi sono in grado di cambiare direzione e nuotare contro gravità; in tal caso, si adattano curve allo spostamento verticale del nematode e l'accelerazione è calcolata a partire dalle loro derivate seconde.

Le forze che agiscono sul verme fino a quando il verme raggiunge il punto di inversione sono la forza di gravità, la resistenza viscosa, la spinta di Archimede e la spinta propulsiva. La forza risultante è pari alla loro somma vettoriale. Considerare le componenti verticali della forza.

La forza gravitazionale è uguale in modulo alla forza di galleggiamento, assumendo che il verme abbia una densità circa pari a quella dell'acqua, quindi l'equazione può essere semplificata fino al punto di inversione. La resistenza più la spinta sono costanti. Inizialmente la resistenza è maggiore, ma si riduce gradualmente a zero mentre la spinta aumenta; al punto di inversione, non vi è alcuna resistenza verticale e la spinta è diretta verso l'alto durante il movimento del verme.

L'attrito di salita verticale aumenta in direzione discendente, quindi la forza di spinta deve essere maggiore della somma di attrito e peso. È stato analizzato il percorso non lineare di questo verme. Ha cambiato direzione.

Osservando lo spostamento, ha rallentato ed è iniziato a invertire la direzione a 68 secondi. Tuttavia, l'accelerazione verso l'alto è diminuita continuamente fino a quando l'accelerazione netta ha raggiunto zero a 68,5 secondi. Successivamente, ha iniziato ad accelerare nella direzione negativa per ridiscendere.

Pertanto, quando la velocità era nulla, il verme esercitava una spinta verso l'alto significativa, calcolata in 1,32 piconewton. Una volta acquisita padronanza della tecnica, i dati possono essere raccolti entro 10 minuti, a condizione che i vermi siano pronti per essere prelevati dall'archimede. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere costante la frequenza di registrazione della telecamera per tutti i dati acquisiti, poiché è necessario regolare la velocità dei fotogrammi nel programma di analisi video successivamente a questa procedura. Altri studi possono essere condotti, ad esempio studi a singola lunghezza d'onda, per rispondere a domande come quali forze vengono esercitate in diverse direzioni, verticale e orizzontale.

Ad esempio, questa tecnica ottica potrebbe essere utilizzata da altri biologi interessati alle proprietà della locomozione di piccoli organismi come Proti o altri organismi acquatici. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere un'idea abbastanza chiara di come analizzare il movimento di microorganismi in libera nuotata utilizzando l'ingrandimento delle immagini d'ombra e successivamente un programma di analisi video.