Ricostituzione della β-catenina degradazione nel Xenopus Estrai Egg

Un metodo è descritto per l'analisi degradazione delle proteine ​​usando radioattivo e proteine ​​luciferasi-fusione in estratto uovo Xenopus e il suo adattamento per lo screening high-throughput per piccoli modulatori molecola di degradazione delle proteine.

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare il sistema biochimico di estratto di uova xenopus privo di cellule per analizzare la beta catina nel turnover. Ciò si ottiene aggiungendo e/o esaurendo gli effettori sospetti all'estratto di uovo xip attivato al fine di identificare i modulatori del turnover della beta-catenina come secondo passaggio esogeno in vitro, la beta-catenina trascritta e tradotta, radiomarcata con S 35 o fusa con luciferasi, viene aggiunta all'estratto di uovo XUS, che viene attivamente degradato in condizioni native. Successivamente, raccogli i punti temporali per valutare i cambiamenti nei livelli di beta katina e proteine nel tempo.

Si ottengono risultati che mostrano se una particolare modulazione dell'estratto di uova di xenopus aumenta o diminuisce i tassi di beta catina e degradazione in base all'autoradiografia e/o al rilevamento della luminescenza. Il vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come gli esperimenti di inseguimento dell'impulso o di inseguimento del ciclo di heide in cellule in coltura, è che l'estratto di uovo di xenopus fornisce un sistema biochimico privo di cellule in cui è possibile analizzare la regolazione delle proteine a livello proteico e manca della complessità aggiuntiva della trascrizione attiva. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo della trasduzione del segnale identificando i regolatori di proteine di segnalazione chiave come la beta catina.

Lavorare con l'estratto di xenopus consente all'utente di esaurire prontamente i componenti di un percorso e aggiungere una quantità definita di una proteina. Per determinarne gli effetti dose-dipendenti, utilizzare l'estratto di uova XUS appena preparato o scongelare rapidamente, congelare l'estratto e metterlo sul ghiaccio. Eseguire tutte le manipolazioni a freddo, preparare anticorpi pellettati o perle di affinità a un decimo del volume dell'estratto per ridurre al minimo la diluizione dell'estratto, prelevare quanto più liquido possibile dalle perle prima dell'aggiunta dell'estratto.

Utilizzando punte di caricamento in gel con estremità lunghe e affusolate, qui l'estratto viene aggiunto alla resina legante GST. Ruotare la miscela di perle di estratto a quattro gradi Celsius per un'ora. Quindi centrifugare la miscela di perle di estratto a 12, 600 Gs in una micro fuga a quattro gradi Celsius per 30 secondi.

Facendo attenzione a non trasferire perline con l'estratto. Trasferire l'estratto esaurito in un tubo di microfuge fresco con ghiaccio. Confermare l'efficienza della deplezione mediante immunoblotting, sia l'estratto impoverito che le perle.

Poiché la T e la degradazione dipendono dall'energia, esauriscono rapidamente le riserve endogene di A TP. Di conseguenza, per mantenere una robusta degradazione del T, è necessario utilizzare un mix di rigenerazione dell'energia. Preparare una miscela di rigenerazione energetica o ER 20 x come descritto nel protocollo di testo.

Scongelare rapidamente l'estratto di uovo di opus strofinando il tubo congelato tra le mani. Metti il tubo sul ghiaccio appena prima che tutto l'estratto si sia sciolto. Aggiungere 10 microlitri di rigenerazione energetica.

Mescolare in un'aliquota di estratto di uova di xenopus. Mescolare accuratamente muovendo rapidamente il tubo e pulsare la rotazione del polso a vortice e posizionarla immediatamente sul ghiaccio. Aliquotare i volumi appropriati per il saggio di degradazione in provette micro-fuge pre-raffreddate su ghiaccio.

Per prepararsi ai test di beta katina e degradazione radiomarcati, prelevare da due a cinque microlitri di estratto per ogni punto temporale per eseguire il test di degradazione della beta-catenina radiomarcato nell'estratto di uovo XUS. Innanzitutto, preparare la beta-catenina marcata con la radio come descritto nel protocollo di testo. Quindi aggiungere da uno a tre microlitri di beta-catenina tradotta in vitro a 20 microlitri di miscela di reazione xip su ghiaccio, mescolare accuratamente con un rapido movimento del tubo e un breve impulso di vortice.

Questo è un passo importante. Un estratto di uovo XUS è molto viscoso e una miscelazione incompleta influenzerà la consistenza dei risultati pulsando, centrifugando e mettendo sul ghiaccio. Avviare la reazione di degradazione della beta-catenina spostando le provette a temperatura ambiente nel momento designato.

Rimuovere da uno a cinque microlitri di campione e mescolare immediatamente con un volume di cinque volte il tampone per campioni SDS per arrestare la reazione e assicurarsi che la reazione di degradazione sia completamente terminata. Muovi il tubo più volte e agita energicamente per eseguire la pagina SDS. L'autoradiografia esegue l'equivalenza di un microlitro dell'estratto per ogni punto temporale per corsia.

I risultati possono essere quantificati utilizzando image, J image quant o un altro software di imaging preferito. La degradazione della beta-catenina nell'estratto di uovo xap dovrebbe essere evidenziata dalla diminuzione dipendente dal tempo dell'intensità della beta kaine radiomarcata nella banda. Per preparare la beta-catenina luciferasi, sintetizzare la luciferasi non radiomarcata con la beta-catenina.

Utilizzando il sistema accoppiato alla traduzione della trascrizione con un mix completo di aminoacidi. Confermare la produzione della luciferasi marcata con beta-catenina misurando l'attività della luciferasi da 0,5 a un microlitro di reazione. Valutare la luminescenza di fondo misurando la luminescenza da una miscela di reazione non tradotta per eseguire il saggio di degradazione della luciferasi beta catina Per prima cosa, scongelare e preparare l'estratto di uova di xenopus come prima.

Quindi aggiungere la beta catina tradotta in vitro e la fusione della luciferasi nella reazione xip preparata. Mescolare con ghiaccio e mescolare bene. Come prima, spostare l'estratto a temperatura ambiente per avviare la reazione di degradazione.

Rimuovere un'aliquota della reazione al punto temporale indicato e congelare a scatto in azoto liquido. Rimuovere i campioni triplicati per l'analisi in ogni momento. L'estratto congelato può essere conservato a meno 80 gradi Celsius fino al momento di essere analizzato.

Scongelare i campioni su ghiaccio e trasferirli su piastre bianche standard a 96 pozzetti su ghiaccio prima dell'elaborazione. Per l'attività della luciferasi, la degradazione dipendente da GS GSK tre della beta-catenina può essere facilmente dimostrata in diversi modi utilizzando l'estratto di uova XUS. La degradazione della beta-catenina radiomarcata S 35 nell'estratto XUS è inibita dall'aggiunta dell'inibitore del proteasoma MG 1 32.

Il mutante della beta-catenina è stabilizzato nell'estratto di uovo XUS rispetto alla betaina wild type e gli inibitori delle proteine di GSK tre inibiscono similmente la degradazione della beta-catenina. Infine, la deplezione di GSK tre dall'estratto di uovo xip inibisce la degradazione della beta-catenina e può essere salvata con l'aggiunta di GSK tre esogeno. Il saggio di degradazione della beta-catenina luciferasi nell'estratto di uovo xip è stato utilizzato per valutare la degradazione della beta katina e della luciferasi.

La velocità di degradazione della beta katina e della luciferasi è simile alla proteina beta-catenina non marcata. La regolazione della degradazione per la beta katina e la fusione della luciferasi è essenzialmente identica alla proteina di non fusione. Poiché l'aggiunta di cloruro di litio ha provocato l'inibizione della beta catina e del turnover della luciferasi, i cambiamenti nel segnale radioattivo della beta catina.

La proteina luciferasi è parallela ai cambiamenti nell'attività enzimatica della luciferasi nel tempo durante il tentativo di questa procedura. È importante mantenere tutti i reagenti in ghiaccio e mescolare accuratamente le reazioni prima di tentare questo test. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare i regolatori e analizzare la beta catina e il turnover utilizzando il sistema di estratto di uova xenopus privo di cellule.