RNAscope per

L'obiettivo generale del seguente esperimento è dimostrare un rilevamento sensibile e specifico dell'mRNA di E6 ed E7 dell'HPV ad alto rischio nelle cellule tumorali dei tumori della testa e del collo, utilizzando una nuova tecnica di ibridazione in situ per RNA chiamata RNA scope. Questo risultato si ottiene innanzitutto pretrattando i campioni di tessuto sui vetrini con calore e proteasi per permeabilizzare le cellule e consentire l'accesso delle sonde. Come secondo passaggio, si incubano i vetrini con un cocktail di sonde per l'HPV mirato a sette tipi di HPV ad alto rischio, che si ibrida all'mRNA di E6 ed E7.

Successivamente, amplificare i segnali di ibridazione ibridando in sequenza con l'amplificatore preamplificatore e la sonda marcatrice coniugata con HRP. Il segnale viene quindi rilevato mediante un cromogeno e visualizzato mediante microscopia in campo chiaro standard; i risultati ottenuti mostrano segnali di mRNA di HPVE sei E sette sotto forma di precipitati bruni puntiformi nei tumori positivi per HPV, ma non nei tumori negativi per HPV. Il saggio RRA scope utilizza una strategia innovativa e proprietaria di progettazione delle sonde per l'ibridazione in insetti.

Consente la visualizzazione di singole molecole e la quantificazione del bersaglio. Questa tecnologia apre la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sui biomarcatori e dello sviluppo di acidi diagnostici per identificare e validare qualsiasi biomarcatore RNA scoperto attraverso studi di macro race o di sequenziamento di nuova generazione. La maggior parte dei ricercatori con esperienza precedente in IHC o in ciascuna tecnica può apprendere rapidamente questo metodo.

Ora illustrerò l'intero flusso di lavoro, evidenziando i passaggi chiave per aiutarvi a padroneggiare la tecnica. I campioni di tessuto da sottoporre a questa tecnica di ibridazione in situ per RNA sono fissati in formalina. Sezioni incluse in paraffina di spessore pari a cinque più o meno uno micron, montate su vetrini un'ora prima del saggio.

Scaldare le vetrate in un forno asciutto a 60 gradi Celsius mentre le vetture sono in cottura. Preparare il forno per ibridazione. Portare la temperatura a 40 gradi Celsius e posizionare un foglio umidificante nel vassoio di controllo dell'umidità.

Aggiungere 50 millilitri di acqua distillata alla carta umidificante per inumidirla completamente. Inserire il vassoio coperto nel forno per preriscaldarlo per almeno 30 minuti prima dell'uso. Preparare 700 millilitri di soluzione di pretrattamento 1x diluendo la soluzione di pretrattamento 10x in acqua distillata.

Riscaldare la soluzione di pretrattamento 1x fino all'ebollizione e mantenere la temperatura tra 100 e 104 gradi Celsius, evitando il sobbollimento. Preparare tre litri di tampone di lavaggio 1x diluendo il tampone di lavaggio 50x preriscaldato in acqua distillata sotto cappa.

Preparare le xylene, l'etanolo al 70% e l'etanolo al 100% per la delipidificazione finale e la disidratazione. Preparare una soluzione colorante all'ematina al 50% e acqua ammoniacale allo 0,01% o reagente bluing per la colorazione post-trattamento. Riscaldare preventivamente le sonde bersaglio a 40 gradi Celsius per 10 minuti.

Portare tutti i reagenti del kit di rilevamento RTU, ad eccezione del cromogeno DAB marrone A e marrone B, a temperatura ambiente. Per iniziare il saggio, desparaffinare le sezioni di tessuto cotte in xilene due volte per cinque minuti ciascuna, con agitazione frequente. Disidratare due volte in etanolo al 100% per tre minuti ciascuna, con agitazione frequente.

Lasciare asciugare all'aria per cinque minuti, quindi tracciare una barriera idrofoba intorno alla sezione di tessuto utilizzando una penna per barriera idrofoba. Iniziare il pretrattamento delle sezioni di tessuto incubandole con la soluzione di pretrattamento 1 per 10 minuti a temperatura ambiente. Questo passaggio inibirà l'attività della perossidasi endogena.

Risciacquare in acqua distillata. Successivamente, recuperare l'RNA incubando le sezioni di tessuto per 15 minuti con la soluzione pre-trattamento due, mantenuta a temperatura di ebollizione per 15 minuti, quindi risciacquare due volte in acqua distillata per la digestione delle proteine. Trattare le sezioni di tessuto con la soluzione pre-trattamento tre e incubare nel forno di ibridazione a 40 gradi Celsius per 30 minuti.

Al termine dell'incubazione di 30 minuti, sciacquare le sezioni di tessuto due volte con acqua distillata. Il passaggio successivo è l'ibridazione della sonda bersaglio mediante un pool di sonde che rilevano l'mRNA E6 E7 di sette genotipi di HPV ad alto rischio: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58. Aggiungere le sonde per HPV, la sonda per ubiquitina C e la sonda per il gene batterico DAPB separatamente su tre sezioni di tessuto adiacenti.

Ibridizzare a 40 gradi Celsius in forno per due ore al termine dell'incubazione di due ore. Risciacquare le sezioni di tessuto nel buffer di lavaggio due volte per due minuti ciascuna a temperatura ambiente per l'amplificazione del segnale. Iniziare incubando le sezioni di tessuto con l'amplificatore pre-AMP uno per 30 minuti a 40 gradi Celsius nel forno di ibridazione.

Risciacquare due volte nel buffer di lavaggio per due minuti ciascuna a temperatura ambiente. I passaggi successivi per l'amplificazione del segnale prevedono l'incubazione delle sezioni di tessuto con i seguenti reagenti a 40 gradi Celsius per il tempo indicato, con due risciacqui nel buffer di lavaggio a temperatura ambiente. Dopo ogni incubazione, aggiungere AMP two background reducer per 15 minuti.

Amplificare con l'amplificatore AMP tre per 30 minuti e con la sonda marcata AMP quattro per 15 minuti. Successivamente, incubare le sezioni di tessuto con AMP cinque per 30 minuti a temperatura ambiente; dopo due risciacqui nel buffer di lavaggio, incubare con AMP sei per 15 minuti a temperatura ambiente, seguiti da altri due risciacqui nel buffer di lavaggio. Per la rivelazione del segnale, preparare una miscela DAB uno a uno mescolando volumi uguali di marrone A e marrone B. Aggiungere la soluzione ai vetrini e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.

Risciacquare due volte con acqua distillata. Controstainare le sezioni di tessuto con una soluzione al 50% di ematossilina per due minuti a temperatura ambiente, quindi risciacquare con acqua distillata fino a quando le diapositive diventano trasparenti mantenendo i tessuti. Immergere le diapositive in acqua ammoniacale allo 0,01% per cinque volte, seguite da cinque immersioni in acqua distillata; disidratare le sezioni di tessuto incubando per due minuti ciascuna in etanolo al 70%, etanolo al 100% ed etanolo al 100%, seguito da xilene per cinque minuti.

Infine, montare i vetrini con un mezzo di montaggio a base di xilene, come mostrato. Di seguito sono riportate immagini di esempio di sezioni colorate, fissate in formalina e incluse in paraffina, di carcinoma a cellule squamose della testa e del collo di Sonoma. Nel caso positivo per HPV, le sonde per HPV ad alto rischio (HR HPV) hanno rilevato segnali puntiformi intensi specificamente nelle cellule tumorali. Questo è chiaramente visibile nell'insetto a un ingrandimento di 40x.

La sonda del controllo positivo UBC ha rilevato numerosi segnali citoplasmatici puntiformi sia nelle cellule tumorali che nelle cellule stromali. Mentre la sonda del controllo negativo DAP B ha mostrato uno sfondo pulito nel caso negativo per HPV, sia la sonda HR HPV che la sonda DAP B non hanno rilevato segnali, mentre la sonda UBC ha rilevato segnali intensi. La valutazione per la determinazione dello stato di HPV prevede l'esame di tutti e tre i vetrini per ogni caso.

Il livello di colorazione sul vetrino del controllo negativo DAP B viene utilizzato come soglia; la positività al VPH è definita dalla presenza di una colorazione puntiforme, citoplasmatica e/o nucleare superiore al segnale presente sul vetrino DAP B. Il saggio RNA scope può essere completato entro otto ore, se eseguito correttamente durante lo svolgimento del saggio. È fondamentale aggiungere una quantità sufficiente di soluzione per coprire interamente l'area del tessuto a ogni passaggio.

È inoltre fondamentale rimuovere qualsiasi tampone residuo agitando leggermente le lamelle tra un passaggio e l'altro, mantenendole comunque bianche. La tecnologia rescope può essere applicata per la rilevazione di praticamente qualsiasi biomarcatore a RNA in qualsiasi cellula o tessuto di qualsiasi specie.