Name: RNAscope per In situ Rilevamento di trascrizionale attivo Papillomavirus Umano in Cervico Carcinoma a cellule squamose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Scopri la tecnica RNAscope per la rilevazione dell'mRNA E6/E7 dell'HPV ad alto rischio in tumori della testa e del collo. Questo metodo consente la visualizzazione sensibile di biomarcatori in sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina.

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1. Campione, Attrezzatura e Preparazione dei reagenti <ol><li> Tagliare campione di tessuto in blocchi di 3-4 mm di spessore, fissare in fresco 10% formalina neutra tamponata per 16-32 ore a temperatura ambiente (25 ° C) e incorporare in paraffina. Tagliare FFPE in sezioni di 5 ± 1 micron di spessore da blocchi FFPE, montare sezioni su scivoli e aria secca. Nota: Le diapositive possono essere conservati a temperatura ambiente sotto essiccazione per un massimo di 3 mesi. I vetrini di tessuto montati dovrebbero essere cotte in un secco sopra a 60 ° C per 1 ora prima del test RNAscope. </li><li> Portare ibridazione forno a 40 ° C. Mettere una carta di umidificazione nel Umidità di controllo Cassetto. Aggiungere 50 ml di dH 2 O del Libro di umidificazione per bagnare completamente. Inserire il vassoio coperto nel forno per preriscaldare per almeno 30 minuti prima dell&#39;uso. </li><li> Rendere 700 ml 1x Pretrattare 2 Soluzione (10 nl, pH 6 tampone citrato) diluendo 10x Soluzione di pretrattamento in dH 2 O. Riscaldare il 1x Pretrattare 2 Soluzione a bollire e maintain la temperatura tra 100-104 ° C evitando sovra-bollente. </li><li> Fai 3 L 1x Wash Buffer (0.1x SSC) diluendo preriscaldata 50x Wash Buffer in dH 2 O. </li><li> Preparare 2 x 200 ml di xilene e 2 x 200 ml di 100% EtOH per deparaffinizzazione sotto una cappa aspirante. </li><li> Preparare il 50% soluzione colorante ematossilina e il reagente brunitura (ammoniaca 0,01%) per il post-colorazione sotto una cappa aspirante. </li><li> Preparare 200 ml di xilene, 200 ml di 70%, e 2 x 200 ml di EtOH 100% per disidratazione sotto una cappa aspirante. </li><li> Sonde Preriscaldare target a 40 ° C per 10 min e portare Detection RTU Kit di reagenti a temperatura ambiente, tra cui RTU Amp1, Amp2, Amp3, AMP4, Amp 5-Brown, e AMP6-Brown, tranne cromogeno DAB Brown-A e Brown-B . </li></ol> 2. RNAscope Assay Deparaffinizzazione e disidratazione Dopo la cottura, Deparaffinare sezioni di tessuto in xilene per 2 x 5 minuti con agitazione, e disidratarein 100% EtOH per 2 x 3 min sotto agitazione. Asciugare all&#39;aria per 5 min e disegnare una barriera idrofoba intorno alla sezione di tessuto con un idrofobo Barriera Pen. Pretrattamenti <ol><li> Incubare sezioni di tessuto con Pretrattare 1 per 10 min a RT per tempra di attività della perossidasi endogena, sciacquare in dH 2 O. </li><li> Incubare sezioni di tessuto con Pretrattare 2 mantenuti ad una temperatura di ebollizione per 15 minuti per il recupero di RNA, lavare due volte in dH 2 O. </li><li> Incubare sezioni di tessuto con Pretrattare 3 per 30 minuti a 40 ° C per la digestione delle proteine ​​in HybEZ forno, lavare due volte in dH 2 O. </li></ol> Obiettivo della sonda di ibridazione Sonde target HPV-HR 7 piscina includono: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58. Aggiungi sonde HPV, ubiquitina C (UBC) e batteriche sonde gene dapB separatamente su tre sezioni di tessuto adiacenti. Ibridare a 40 ° C in forno per 2hr, quindi risciacquare in 1x tampone di lavaggio per 2 x 2 min a RT. Amplificazione del segnale <ol><li> Incubare sezioni di tessuto con Amp1 (preamplificatore) per 30 min a 40 ° C, Amp2 (sfondo riduttore) per 15 min a 40 ° C, Amp3 (amplificatore) per 30 min a 40 ° C, e AMP4 (sonda etichetta) per 15 min a 40 ° C in forno HybEZ. Dopo ogni fase di ibridazione, sciacquare in 1x tampone di lavaggio per 2 x 2 min a RT. </li><li> Incubare sezioni di tessuto con AMP5 per 30 min e AMP6 per 15 minuti a RT. Dopo ogni fase di incubazione, sciacquare in 1x tampone di lavaggio per 2 x 2 min a RT. </li></ol> Rilevamento segnale Incubare sezioni di tessuto con il 1:1 DAB Miscela miscelando un volume uguale di Brown-A e Brown-B per 10 minuti a RT, lavare due volte in dH 2 O. Di contrasto <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; sezioni di tessuto macchia con soluzione di ematossilina al 50% per 2 min a RT, sciacquare con dH 2 O fino a quando le diapositive sono chiare mentre il tessuto resta viola. Immergere i vetrini in 0,01% di ammoniaca in dH 2 O per 5x e seguita con 5 tuffi in dH 2 O. Cursore di montaggio Disidratare sezioni di tessuto a 70%, 100% e 100% EtOH per 2 min ciascuna, xilene per 5 min, montare con un mezzo di montaggio a base di xilene.

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Tutti gli autori sono impiegati da e proprie azione in Advanced Diagnostics cella, Inc.

Il test HPV RNAscope permesso la visualizzazione diretta di E6/E7 mRNA in situ in testa HPV-associata collo e carcinoma a cellule squamose. Il saggio RNAscope è pienamente compatibile con il tessuto tumorale fisso di routine e conserva la morfologia del tessuto per correlazioni istopatologiche (Figura 2). Uno dei principali vantaggi del test RNAscope rispetto ai metodi convenzionali CISH è che amplifica specificamente i segnali di ibridazione (Figure 2B e 2E), senza amplificare il rumore di fondo (Figure 2C e 2F). In pratica, la procedura di analisi RNAscope HPV può essere completato entro 8 ore o comodamente divisa in due giorni. Il saggio RNAscope HPV è stato utilizzato per determinare lo stato di HPV in testa e del collo carcinoma a cellule squamose 12-16, dimostrando il 97% di sensibilità e specificità del 93% utilizzando qRT-PCR come metodo di riferimento 16. Chr convenzionaleISH omogenic per HR-HPV DNA è altamente specifica, ma ha una sensibilità del 12 ~ 80%. Immunoistochimica (IHC) colorazione per il cellulare surrogato marcatore p16 dimostra sensibilità eccellente, ma può generare risultati falsi positivi 15,18, soprattutto in nonoropharyngeal tumori testa e collo 15. L&#39;attuale metodo &quot;gold standard&quot; di qRT-PCR per l&#39;HPV E6/E7 mRNA rilevamento richiede tessuto fresco congelato per ottenere risultati ottimali ed è tecnicamente complessa, che ne limita l&#39;utilizzo solo al laboratorio di ricerca. Inoltre, richiede l&#39;estrazione di RNA che rende impossibile correlare espressione HR-HPV E6/E7 mRNA con istopatologia. Ci sono diversi fattori critici per il successo del saggio RNAscope. In primo luogo, per i migliori risultati, i tessuti dovrebbero essere fissati in fresco 10% formalina neutra tamponata a temperatura ambiente per 16-32 ore secondo le linee guida ASCO / CAP 19. In secondo luogo, il forno HybEZ è altamente raccomandato in quanto consentonos controllo ottimale della temperatura e dell&#39;umidità per sonda di ibridazione e gradini amplificazione del segnale. In terzo luogo, è importante rimuovere buffer residuo in eccesso prima di ogni passo, ma ancora mantenere la sezione di tessuto da asciugare durante tali operazioni. La procedura RNAscope manuale qui descritto è stato completamente automatizzato su un vetrino sistema di auto-colorazione commerciali 10. Ciò dovrebbe facilitare notevolmente la standardizzazione delle condizioni di saggio e di risparmiare prezioso lavoro manuale nei laboratori di patologia clinica. Inoltre, il software di analisi di immagine dedicato è stato sviluppato 10 per identificare automaticamente le cellule e segnali di colorazione su un vetrino digitalizzato, che dovrebbe contribuire ad eliminare soggettività e migliorare la riproducibilità nel punteggio. In sintesi, il saggio RNAscope HPV rileva la presenza di trascritti HR-HPV E6/E7 mRNA in situ nei tessuti FFPE. Ha un flusso di lavoro che è familiare a patologia clinica laboratori per consentire la diretta visualizzazione di questi in sezioni di tessuto. Esso offre una piattaforma ideale per l&#39;esame (FFPE) campioni di tessuto, e può essere facilmente adottata dai laboratori diagnostici di patologia.

Conti di papillomavirus umano ad alto rischio (HR-HPV) per circa il 5% di tutti i tumori in tutto il mondo 1. L&#39;incidenza del cancro orofaringeo HPV-associata è aumentata negli ultimi decenni, soprattutto tra gli uomini. Orofaringeo a cellule squamose HPV-positive (OPSCC) probabilmente costituirà la maggioranza di tutti i tumori della testa e del collo negli Stati Uniti nei prossimi 20 anni 2. Orofaringei carcinomi a cellule squamose causati da HPV sono associati con la sopravvivenza favorevole, e lo stato del tumore HPV è un fattore prognostico forte e indipendente per la sopravvivenza 3. Prove per l&#39;attivazione trascrizionale di oncogeni virali E6 ed E7 è considerato il gold standard per la presenza di HPV clinicamente rilevante 4. Tuttavia, la scoperta di E6/E7 mRNA da tessuto tumorale fresco mediante tecnica RT-PCR non è pratico nella pratica clinica ed è stato limitato ai laboratori di ricerca. Recentemente, abbiamo HAVe ha sviluppato una nuova tecnologia chiamata RNA ISH RNAscope, che consente il rilevamento multiplex in celle singole, con il singolo di RNA sensibilità molecola nei campioni in formalina paraffina fissati incorporati tessuti (FFPE) 5-10. Abbiamo fornito tre linee di evidenza per singola molecola di rilevamento 5. In primo luogo, la progettazione e segnale del sistema di amplificazione sonda RNAscope permesso di rilevamento singola copia genomiche HER2 bersagli di DNA in HeLa e SK-BR-3 linee cellulari. In secondo luogo, se confrontato con HER2 segnali di DNA genomico, la distribuzione delle intensità di fluorescenza di punti di segnale HER2 mRNA in cellule HeLa era coerente con una molecola per punto. In terzo luogo, il numero di punti di segnale HER2 mRNA per cella corrisponde strettamente il numero di copie HER2 mRNA stimato mediante un saggio quantificazione basata soluzione, sostenendo ulteriormente rilevamento singola molecola. Inoltre, di contrasto dei nuclei con DAPI in microscopia a fluorescenza o con ematossilina in microscopia in campo chiaro permette la visualizzazione dei singoli nuclei, which a sua volta consente il rilevamento e la quantificazione degli obiettivi di RNA su base singola cellula 10. La capacità di analizzare l&#39;espressione genica in situ in campioni clinici di routine rende RNAscope una piattaforma promettente per patologia diagnostica, in particolare quelli di tessuto FFPE sezione basata saggi 10,11. Abbiamo sviluppato un saggio basato HPV-RNAscope per rilevare E6/E7 mRNA di sette genotipi ad alto rischio di HPV (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58) utilizzando un pool di sonde genotipo-specifici. I nostri recenti studi in OPSCC hanno dimostrato che il saggio RNAscope HPV è altamente sensibile e specifico per determinare lo stato di HPV sui tessuti FFPE 12-17, e anche informa la prognosi in OPSCC 12,16. Il principio della tecnologia RNAscope è stato descritto in precedenza 5. Qui, descriviamo il protocollo completo di analisi RNAscope e dimostrare il suo utilizzo nella rilevazione di HR-HPV in FFPE sezioni di tessuto tumorale.

<table><tbody>Kit <tr><td>di reagenti FFPE</td> per 310011, 310012 310014 <td></td><td></td> RNAscope 2.0 per forni, teglie e rack Fisher Scientific 12-550-15 HybEZ Advanced Cell Diagnostics , RNAscope - Brown Advanced Cell Diagnostics 310035 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Sonda HPV-HR7 per HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58, 312351 Advanced Cell Diagnostics a mRNA E6/E7 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Idrofobica Barriera Penna</td><td>Vettore Laboratorio</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>ALREAGAL</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Gill's Hematoxylin I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>HXGHE1LT</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di ammoniaca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320145-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-F</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-300-49SHP</td><td></td></tr><tr><td>Forno</td><td></td><td></td> di essiccazione <td>In grado di mantenere la temperatura a 60&plusmn; 1 &deg; C</td></tr><tr>Bagno <td></td><td></td><td>d'acqua</td><td>In grado di mantenere la temperatura a 40&plusmn; 1 &deg; E</td></tr></tbody></table>

rnascope per<em&gt; in situ</em&gt; rilevamento di trascrizionale attivo papillomavirus umano in cervico carcinoma a cellule squamose

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Il &#39;gold standard&#39; per la rilevazione di HPV oncogeni è la dimostrazione di trascrizionalmente attivo HPV ad alto rischio nel tessuto tumorale. Tuttavia, l&#39;individuazione di E6/E7 mRNA da parte quantitativa trascrizione inversa reazione a catena della polimerasi (qRT-PCR) richiede l&#39;estrazione di RNA che distrugge il tessuto tumorale contesto critico per la correlazione morfologica ed è stato difficile da adottare nella pratica clinica di routine. Il nostro RNA recentemente sviluppato in tecnologia situ ibridazione, RNAscope, permette la visualizzazione diretta di RNA in, inclusi in paraffina (FFPE) tessuto fissato in formalina con la sensibilità di singola molecola e la risoluzione singola cellula, che consente altamente sensibile e specifica analisi in situ di un biomarker RNA in campioni clinici di routine. Il saggio RNAscope HPV è stato progettato per rilevare la E6/E7 mRNA di sette genotipi HPV ad alto rischio (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58) con un pool di sonde genotipo-specifici. Si è dimostrato eccellente sensibilitàe specificità contro l&#39;attuale metodo &#39;gold standard&#39; per l&#39;individuazione di E6/E7 mRNA da qRT-PCR. Stato determinato da HPV RNAscope è fortemente prognostico di outcome clinico nei pazienti con cancro orofaringeo.

Workflow test HPV RNAscope Il saggio RNAscope ha un flusso di lavoro altamente semplificato che è simile a IHC (Figura 1). Si compone di quattro fasi principali: pretrattamenti, ibridazione, amplificazioni del segnale, e rilevamento. Si avvale di una strategia progettuale sonda unico che garantisce il segnale ad alta fedeltà di amplificazione 5. Nel saggio RNAscope HPV, sette probe set HR-HPV sono raggruppati, tutti riconosciuta dallo stesso sistema di amplificazione di segnale collegato a perossidasi di rafano (HRP). Segnali di ibridazione specifiche vengono rilevati come precipitati marroni formate da HRP catalizzata reazione cromogena DAB usando come substrato, che può essere facilmente visualizzato mediante microscopia a campo chiaro standard. Colorazione Rappresentante per la rilevazione dell&#39;HPV La figura 2 mostra immagini di esempio da macchiati sezioni FFPE della testa e del collo, carcinoma a cellule squamose. Nel caso HPV-positive (Fig.ure 2A), le sonde HR-HPV rilevate forti segnali puntiformi specificamente nelle cellule tumorali. La sonda UBC rilevato numerosi segnali citoplasmatici puntiformi in entrambe le cellule tumorali e cellule stromali (Figura 2B). La sonda gene batterico dapB dimostrato un fondo pulito (Figura 2C). Nel caso HPV-negative, sia la sonda HR-HPV e la sonda dapB rilevati segnali (figure 2D e 2F), mentre segnali forti sono stati rilevati utilizzando la sonda UBC (Figura 2E). In questo saggio, UBC serve come controllo positivo per valutare la qualità del tessuto RNA e dapB come controllo negativo per segnali di fondo. Il punteggio per la determinazione dello status HPV comporta l&#39;esame tutte e tre le diapositive per ciascun caso. Il livello di colorazione sul vetrino di controllo negativo (dapB) cursore serve come cutoff: positività HPV è definita dalla presenza di punctate citoplasmatica e / o colorazione nucleare che era sopra il segnale sul vetrino dabpB. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso del test RNAscope. Illustrazione di workflow dosaggio RNAscope. Il saggio RNAscope contiene 4 fasi principali, pretrattamenti, sonda obiettivo ibridazione, amplificazione del segnale e la rilevazione del segnale. L&#39;intera procedura di dosaggio può essere completato in 8 ore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2.jpg" /> Figura 2. Immagini di esempio di diapositive RNAscope-colorati. Sezioni FFPE colorate con sonde per HR-HPV, UBC (controllo positivo) e dapB (controllo negativo)da due casi HNSCC. AC. Caso HPV-positive. A, espressione HR-HPV E6/E7 mRNA in cellule tumorali. Inset, 40X di ingrandimento per mostrare i segnali puntiformi. B e C) sezioni di tessuto adiacenti che mostrano una colorazione positiva UBC (B) e negativo per dapB (C), rispettivamente. DF) HPV-negative caso. D) nessuna colorazione per l&#39;HPV E6/E7 mRNA , simile al controllo negativo dapB (F). E) UBC colorazione positiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a>

La presenza di HPV ad alto rischio in testa e del collo tessuto tumorale è associata a esiti favorevoli. L&#39;RNA recentemente sviluppato nella tecnica di ibridazione in situ chiamata RNAscope permette la visualizzazione diretta di HPV E6/E7 mRNA in sezioni di tessuto FFPE.

RNAscope per<em&gt; In situ</em&gt; Rilevamento di trascrizionale attivo Papillomavirus Umano in Cervico Carcinoma a cellule squamose

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è dimostrare un rilevamento sensibile e specifico dell'mRNA di E6 ed E7 dell'HPV ad alto rischio nelle cellule tumorali dei tumori della testa e del collo, utilizzando una nuova tecnica di ibridazione in situ per RNA chiamata RNA scope. Questo risultato si ottiene innanzitutto pretrattando i campioni di tessuto sui vetrini con calore e proteasi per permeabilizzare le cellule e consentire l'accesso delle sonde. Come secondo passaggio, si incubano i vetrini con un cocktail di sonde per l'HPV mirato a sette tipi di HPV ad alto rischio, che si ibrida all'mRNA di E6 ed E7.Successivamente, amplificare i segnali di ibridazione ibridando in sequenza con l'amplificatore preamplificatore e la sonda marcatrice coniugata con HRP. Il segnale viene quindi rilevato mediante un cromogeno e visualizzato mediante microscopia in campo chiaro standard; i risultati ottenuti mostrano segnali di mRNA di HPVE sei E sette sotto forma di precipitati bruni puntiformi nei tumori positivi per HPV, ma non nei tumori negativi per HPV. Il saggio RRA scope utilizza una strategia innovativa e proprietaria di progettazione delle sonde per l'ibridazione in insetti.Consente la visualizzazione di singole molecole e la quantificazione del bersaglio. Questa tecnologia apre la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sui biomarcatori e dello sviluppo di acidi diagnostici per identificare e validare qualsiasi biomarcatore RNA scoperto attraverso studi di macro race o di sequenziamento di nuova generazione. La maggior parte dei ricercatori con esperienza precedente in IHC o in ciascuna tecnica può apprendere rapidamente questo metodo.Ora illustrerò l'intero flusso di lavoro, evidenziando i passaggi chiave per aiutarvi a padroneggiare la tecnica. I campioni di tessuto da sottoporre a questa tecnica di ibridazione in situ per RNA sono fissati in formalina. Sezioni incluse in paraffina di spessore pari a cinque più o meno uno micron, montate su vetrini un'ora prima del saggio.Scaldare le vetrate in un forno asciutto a 60 gradi Celsius mentre le vetture sono in cottura. Preparare il forno per ibridazione. Portare la temperatura a 40 gradi Celsius e posizionare un foglio umidificante nel vassoio di controllo dell'umidità.Aggiungere 50 millilitri di acqua distillata alla carta umidificante per inumidirla completamente. Inserire il vassoio coperto nel forno per preriscaldarlo per almeno 30 minuti prima dell'uso. Preparare 700 millilitri di soluzione di pretrattamento 1x diluendo la soluzione di pretrattamento 10x in acqua distillata.Riscaldare la soluzione di pretrattamento 1x fino all'ebollizione e mantenere la temperatura tra 100 e 104 gradi Celsius, evitando il sobbollimento. Preparare tre litri di tampone di lavaggio 1x diluendo il tampone di lavaggio 50x preriscaldato in acqua distillata sotto cappa.Preparare le xylene, l'etanolo al 70% e l'etanolo al 100% per la delipidificazione finale e la disidratazione. Preparare una soluzione colorante all'ematina al 50% e acqua ammoniacale allo 0,01% o reagente bluing per la colorazione post-trattamento. Riscaldare preventivamente le sonde bersaglio a 40 gradi Celsius per 10 minuti.Portare tutti i reagenti del kit di rilevamento RTU, ad eccezione del cromogeno DAB marrone A e marrone B, a temperatura ambiente. Per iniziare il saggio, desparaffinare le sezioni di tessuto cotte in xilene due volte per cinque minuti ciascuna, con agitazione frequente. Disidratare due volte in etanolo al 100% per tre minuti ciascuna, con agitazione frequente.Lasciare asciugare all'aria per cinque minuti, quindi tracciare una barriera idrofoba intorno alla sezione di tessuto utilizzando una penna per barriera idrofoba. Iniziare il pretrattamento delle sezioni di tessuto incubandole con la soluzione di pretrattamento 1 per 10 minuti a temperatura ambiente. Questo passaggio inibirà l'attività della perossidasi endogena.Risciacquare in acqua distillata. Successivamente, recuperare l'RNA incubando le sezioni di tessuto per 15 minuti con la soluzione pre-trattamento due, mantenuta a temperatura di ebollizione per 15 minuti, quindi risciacquare due volte in acqua distillata per la digestione delle proteine. Trattare le sezioni di tessuto con la soluzione pre-trattamento tre e incubare nel forno di ibridazione a 40 gradi Celsius per 30 minuti.Al termine dell'incubazione di 30 minuti, sciacquare le sezioni di tessuto due volte con acqua distillata. Il passaggio successivo è l'ibridazione della sonda bersaglio mediante un pool di sonde che rilevano l'mRNA E6 E7 di sette genotipi di HPV ad alto rischio: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58. Aggiungere le sonde per HPV, la sonda per ubiquitina C e la sonda per il gene batterico DAPB separatamente su tre sezioni di tessuto adiacenti.Ibridizzare a 40 gradi Celsius in forno per due ore al termine dell'incubazione di due ore. Risciacquare le sezioni di tessuto nel buffer di lavaggio due volte per due minuti ciascuna a temperatura ambiente per l'amplificazione del segnale. Iniziare incubando le sezioni di tessuto con l'amplificatore pre-AMP uno per 30 minuti a 40 gradi Celsius nel forno di ibridazione.Risciacquare due volte nel buffer di lavaggio per due minuti ciascuna a temperatura ambiente. I passaggi successivi per l'amplificazione del segnale prevedono l'incubazione delle sezioni di tessuto con i seguenti reagenti a 40 gradi Celsius per il tempo indicato, con due risciacqui nel buffer di lavaggio a temperatura ambiente. Dopo ogni incubazione, aggiungere AMP two background reducer per 15 minuti.Amplificare con l'amplificatore AMP tre per 30 minuti e con la sonda marcata AMP quattro per 15 minuti. Successivamente, incubare le sezioni di tessuto con AMP cinque per 30 minuti a temperatura ambiente; dopo due risciacqui nel buffer di lavaggio, incubare con AMP sei per 15 minuti a temperatura ambiente, seguiti da altri due risciacqui nel buffer di lavaggio. Per la rivelazione del segnale, preparare una miscela DAB uno a uno mescolando volumi uguali di marrone A e marrone B. Aggiungere la soluzione ai vetrini e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.Risciacquare due volte con acqua distillata. Controstainare le sezioni di tessuto con una soluzione al 50% di ematossilina per due minuti a temperatura ambiente, quindi risciacquare con acqua distillata fino a quando le diapositive diventano trasparenti mantenendo i tessuti. Immergere le diapositive in acqua ammoniacale allo 0,01% per cinque volte, seguite da cinque immersioni in acqua distillata; disidratare le sezioni di tessuto incubando per due minuti ciascuna in etanolo al 70%, etanolo al 100% ed etanolo al 100%, seguito da xilene per cinque minuti.Infine, montare i vetrini con un mezzo di montaggio a base di xilene, come mostrato. Di seguito sono riportate immagini di esempio di sezioni colorate, fissate in formalina e incluse in paraffina, di carcinoma a cellule squamose della testa e del collo di Sonoma. Nel caso positivo per HPV, le sonde per HPV ad alto rischio (HR HPV) hanno rilevato segnali puntiformi intensi specificamente nelle cellule tumorali. Questo è chiaramente visibile nell'insetto a un ingrandimento di 40x.La sonda del controllo positivo UBC ha rilevato numerosi segnali citoplasmatici puntiformi sia nelle cellule tumorali che nelle cellule stromali. Mentre la sonda del controllo negativo DAP B ha mostrato uno sfondo pulito nel caso negativo per HPV, sia la sonda HR HPV che la sonda DAP B non hanno rilevato segnali, mentre la sonda UBC ha rilevato segnali intensi. La valutazione per la determinazione dello stato di HPV prevede l'esame di tutti e tre i vetrini per ogni caso.Il livello di colorazione sul vetrino del controllo negativo DAP B viene utilizzato come soglia; la positività al VPH è definita dalla presenza di una colorazione puntiforme, citoplasmatica e/o nucleare superiore al segnale presente sul vetrino DAP B. Il saggio RNA scope può essere completato entro otto ore, se eseguito correttamente durante lo svolgimento del saggio. È fondamentale aggiungere una quantità sufficiente di soluzione per coprire interamente l'area del tessuto a ogni passaggio.È inoltre fondamentale rimuovere qualsiasi tampone residuo agitando leggermente le lamelle tra un passaggio e l'altro, mantenendole comunque bianche. La tecnologia rescope può essere applicata per la rilevazione di praticamente qualsiasi biomarcatore a RNA in qualsiasi cellula o tessuto di qualsiasi specie.

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