Una pelle piena Difetto modello per valutare Vascolarizzazione di Biomateriali In Vivo

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare i vasi sanguigni in costrutti di ingegneria tissutale. Ciò si ottiene creando un difetto standardizzato della pelle completa sul dorso dei topi. Successivamente, un campione del materiale di ingegneria tissutale viene impiantato nel difetto della pelle.

Quindi, al termine del tempo di osservazione, il materiale viene impiantato e inserito in un dispositivo di transilluminazione. Infine, le foto ad alta risoluzione della rete vascolare vengono acquisite con una normale fotocamera digitale. Infine, la rete di vasi viene analizzata mediante segmentazione e quantificazione digitale utilizzando il software Vest egg tool.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia, la tomografia computerizzata o la risonanza magnetica, è che consente una visualizzazione e una quantificazione efficaci dei processi vascolari all'interno dei biomateriali focalizzando tutti i nuovi vasi funzionali. Questo metodo può fornire informazioni sulla vascolarizzazione dei materiali di sostituzione dermica. Può anche essere applicato ad altri organismi modello o per studiare la vascolarizzazione in altri organi.

Per iniziare, utilizzare punzoni per biopsia da 12 millimetri per generare campioni di scaffold, ad esempio da bovini, materiali di sostituzione dermica a base di collagene tagliati da pezzi di rete rotonda di tetin di 14 millimetri di diametro da posizionare sotto ogni impalcatura. Dopo aver anestetizzato un topo, controllare la profondità dell'anestesia con un pizzico di dita dei piedi e rimuovere il pelo posteriore secondo il protocollo di testo. Posiziona l'animale in posizione prona e usa un recinto permanente a punta fine per segnare la linea mediana della schiena del topo.

Definire un'area di escissione che non sia troppo lontana per evitare che l'animale rimuova l'impalcatura. Utilizzando un punzone per biopsia da 10 millimetri, creare difetti bilaterali rotondi forzando con cura il punzone contro la pelle. Per delineare l'area di escissione con una pinza, sollevare delicatamente la pelle contrassegnata e utilizzare le forbici chirurgiche per incidere lungo il cerchio segnato.

In caso di sanguinamento, utilizzare una garza sterile per comprimere con cura l'area in modo da fare spazio alla rete del Titanic. Estendere la separazione della pelle e del tessuto sottostante al bordo della ferita e altri due o quattro millimetri. Posizionare la rete nel difetto direttamente sul letto della ferita e sotto i bordi della ferita.

Quindi posizionare le impalcature direttamente sopra la rete. Usa da quattro a sei nodi singoli per suturare l'impalcatura, in modo che i bordi della ferita adiacenti lascino i bordi leggermente sopra l'impalcatura. Quindi sutura una medicazione trasparente sopra i difetti per proteggere l'impalcatura e consentire il monitoraggio dell'area della ferita.

Valutare, valutare quotidianamente lo stato generale dell'animale monitorando l'attività motoria, il peso corporeo, i segni di dolore, la tolleranza alla medicazione e l'automutilazione. Inoltre, monitorare l'area della ferita per verificare la presenza di sanguinamento, segni locali e sistemici di infezione e la posizione della medicazione. Dopo l'eutanasia dell'animale nel momento desiderato.

Secondo il protocollo di testo, utilizzare un pennarello indelebile per contrassegnare il sito di escissione che include gli scaffold. Utilizzare un paio di forbici o un bisturi per incidere la pelle lungo le linee segnate attraverso un'escissione smussata, staccare l'intera pelle, compresi gli scaffold e la rete dal tessuto sottostante, posizionare un fazzoletto steso a testa in giù in una capsula di Petri. Per visualizzare il campione, posizionarlo su un dispositivo di illuminazione trans.

In modalità macro, è possibile scattare foto dell'intera impalcatura e di aree di pelle normale di uguali dimensioni e memorizzare le immagini in formato TIFF per ulteriori analisi digitali. Dopo aver scaricato il software dello strumento ves EQ, aprire un'immagine e selezionare una regione di interesse per l'analisi premendo il tasto backspace. Quindi premere inverti.

Per visualizzare la rete vascolare in bianco, scegliere l'immagine, il filtro di miglioramento del vaso, l'isteresi, la soglia di soglia, la trasformazione del cappello a cilindro e calcolare il miglioramento del vaso in tutti i passaggi precedenti. Scorri per ingrandire e ridurre l'immagine. Segmenta la mappa dell'imbarcazione selezionando la prima soglia o la copertura dell'imbarcazione in modo che ogni pixel che è anche lontanamente simile a un'imbarcazione venga etichettato come un'imbarcazione.

Premere calcola. Per visualizzare l'anteprima della selezione, selezionare la seconda soglia o copertura dello sfondo in modo che solo i pixel particolarmente simili a recipienti vengano etichettati come vasi. Per calcolare la lunghezza delle imbarcazioni e l'area complessiva da esse coperta, fare clic su immagine, statistiche dell'immagine e statistiche dell'immagine binaria.

La lunghezza del vaso è meglio stimata preassottigliando la rete vascolare a una larghezza di un pixel. Per questo, vai ai filtri morfologici dell'immagine e alla scheletratura prima del calcolo. Il rapporto tra l'area del vaso e la lunghezza del vaso fornisce un valore per le dimensioni del vaso nella regione di interesse.

Se necessario, elimina gli artefatti selezionando solo i vasi di interesse. Facendo clic sotto la modalità di selezione, premere backspace per copiare le imbarcazioni selezionate in una nuova immagine. Infine, analizzare l'area cutanea nativa con gli stessi parametri di uno scaffold, assegnando un valore del 100% al tessuto nativo e mettere in relazione lo scaffold con tale valore.

Ad esempio, se la percentuale di pixel bianchi è del 30% nel tessuto normale e del 15% nello scaffold, ciò rappresenta una vascolarizzazione del 50% dell'area totale dello scaffold. Si prega di notare che i valori corrispondono all'intera area dell'immagine. Pertanto, è necessario correggerlo nell'area della regione selezionata come mostrato qui.

Due settimane dopo l'impianto del tessuto, la transilluminazione ha permesso una chiara visualizzazione delle strutture vascolari fino a 30 micrometri di larghezza in un intero campione di tessuto che comprendeva sia il tessuto nativo che gli scaffold impiantati. Utilizzando la segmentazione digitale per analizzare i livelli di vascolarizzazione del tessuto espiantato del 62,28, più o meno l'8,6% sono stati osservati nello scaffold rispetto alla pelle nativa. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di creare difetti riproducibili su tutta la pelle e fissare il biomateriale in modo affidabile alla ferita.

Seguendo questa procedura, il tessuto espanso può essere utilizzato per ulteriori analisi come l'istologia o l'espressione di RNA e proteine.