Name: Lineage-riprogrammazione di cellule pericyte-derivate del cervello umano adulto in neuroni indotti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T21:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Scopri come riprogrammare periciti cerebrali umani in neuroni indotti mediante vettori retrovirali con Sox2 e Ascl1. Questo metodo consente la conversione diretta di cellule endogene per strategie innovative di riparazione cerebrale.

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Siamo grati al Dr. Magdalena Götz per il suo ingresso durante lo sviluppo di questo protocollo. Ringraziamo il Dr. Marius Wernig (Stanford University) per generosamente ci fornisce la sequenza codificante Sox2. Siamo anche molto grati al Dr. Alexandra Lepier per la produzione di virus. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) e il BMBF (01GN1009A) a BB e il Ministero bavarese delle Scienze, la Ricerca e le Arti a MK e BBCS ricevuto finanziamenti dal SYSTHER-binazionale INREMOS virtuale Institute (Ministeri federale tedesco e sloveno dell&#39;Istruzione e della Ricerca) e il DFG (SFB 824).

1. Isolamento e Coltura di cellule adulte cervello umano Gli esperimenti che coinvolgono il tessuto umano devono essere eseguite in conformità a tutte le normative governative e istituzionali pertinenti riguardanti l&#39;uso di materiale umano per scopi di ricerca. Il presente protocollo è stato sviluppato in conformità con l&#39;approvazione da parte del comitato etico della Facoltà di Medicina della LMU di Monaco di Baviera e il consenso informato per iscritto da tutti i pazienti. Questo protocollo di culture preparazione dell&#39;adulto corteccia cerebrale umana è stata stabilita utilizzando campioni di pazienti di entrambi i sessi affetti da epilessia del lobo temporale o di altre lesioni profonde non traumatiche, non maligne. Il tessuto ottenuto dalla sala chirurgica composto esclusivamente il canale di accesso alla lesione cerebrale e quindi è considerato sano. La fascia d&#39;età dei pazienti era di 19-70 anni. <ol><li> Preparare mezzo di crescita aggiungendo siero di vitello fetale inattivato al calore(FCS) ad alto glucosio DMEM con GlutaMAX per ottenere una concentrazione finale di 20% FCS. Aggiungere 5 ml di penicillina / streptomicina per un totale di 500 ml mezzo di crescita. Eseguire questa e di tutte le fasi successive che richiedono condizioni di coltura sterile in una cappa a flusso laminare adeguata. </li><li> Mantenere la biopsia del cervello umano adulto ottenuto dalla sala operatoria in soluzione salina bilanciata Hanks &#39;con CaCl 2 e MgCl 2 (HBSS) medio compreso HEPES (10 mM concentrazione finale) sul ghiaccio fino al trattamento. Avviare l&#39;elaborazione il più presto possibile. </li><li> Per avviare la dissociazione in celle singole, trasferire il tessuto in una capsula di Petri 65 millimetri e tritare a pezzetti utilizzando due sterili monouso bisturi. Per digestione enzimatica usare 3-6 ml TrypLE in un tubo da 15 ml ed incubare per 15-30 minuti a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Aggiungere 1 volume di mezzo di crescita preriscaldato ad agevolare dissociazione e triturare lentamente la soluzione contenente pezzi di tessuto su e giù utilizzando primauna pipetta monouso 5 ml, seguita utilizzando una pipetta Pasteur di vetro fino omogeneizzazione della sospensione cellulare. Tipicamente, alcuni pezzi di tessuto residui, per lo più costituiti da materia bianca, rimarranno in sospensione. </li><li> Centrifugare a 157 xg per 5 min e risospendere il pellet in quantità appropriata di mezzo di crescita (10 ml per non rivestito pallone di coltura T75). Utilizzare un pallone di coltura T75 per una biopsia di 5-10 mm di diametro dimensioni e estrapolare da questo nel caso di campioni più grandi. </li><li> Posizionare cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 e 5% O 2. </li><li> Sostituire metà del mezzo ogni 3-4 giorni finché le cellule hanno raggiunto la confluenza. Questo richiede di solito fino a due settimane (di seguito il passaggio 0 [P0]). </li></ol> 2. Espansione in vitro e caratterizzazione di cellule cervello umano adulto <ol><li> Espansione in vitro: <ol><li> Aspirare il terreno di coltura e lavare con tampone fosfato salino (PBS), conservato a temperatura ambiente temperatura, prima di aggiungere 3 ml TrypLE. </li><li> Incubare a 37 ° C per 5-10 minuti finché la maggior parte delle cellule staccate. Battere delicatamente i palloni per facilitare il sollevamento delle cellule; dopo l&#39;aggiunta di 3 volumi di mezzo di crescita, trasferire le cellule in una provetta conica da 15 ml e centrifugare a 157 xg per 5 min e risospendere le cellule in quantità appropriata di terreno di crescita. </li><li> Passaggio le celle in un rapporto di 1:3 per la resa ottimale in nuove fiasche di coltura cellulare T75. Nota: Abbiamo diversi passaggi queste cellule fino a P5, senza alcun segno di ridotta efficienza riprogrammazione. Mentre a P0 la coltura contiene una considerevole frazione di cellule endoteliali (valutata mediante espressione CD34), a passaggi successivi il loro numero diventa trascurabile. </li></ol></li><li> Caratterizzazione delle culture cervello umano adulto: <ol><li> Immunocytochemistry: <ol><li> Per la caratterizzazione delle cellule, seme ~ 60.000 cellule su poli-D-lisina rivestite con copertura in vetro scivola in 500 microlitri fresca Mediu crescitam in 24 pozzetti piastre di coltura tissutale e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 e 5% O 2. </li><li> Per l&#39;analisi immunocitochimica delle cellule coltivate cervello umano rimuovere il supporto e lavare 3x con 1 ml di PBS. </li><li> Fix cellule aggiungendo 500 ml di paraformaldeide al 4% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire la copertura in vetro scivola in un apposito camera di colorazione umidificata e bloccare con 80 microlitri di PBS contenente il 3% di albumina di siero bovino (BSA) e 0,5% Triton X-100 per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere anticorpi primari diluiti nella stessa soluzione (per fattori di diluizione vedi tabella di reagenti e attrezzature specifiche) e incubare una notte a 4 ° C o 1 ora a temperatura ambiente. Nota: Una frazione sostanziale ma variabile delle cellule in questa fase della coltura sono immunoreattivi per β del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRβ), cluster di differenziazione 146 (CD146), NG2 condroitin solfato proteoglicani, e actina muscolo liscio (SMA), vale a dire i marcatori caratteristici pericytes microvasali associati. Solo una minoranza (&lt;1%) esprimono il marker gliale fibrillare astrogliali proteina acida (GFAP) e S100β. Inoltre, in questa fase la coltura deve essere privo di cellule che esprimono il marcatore neuronale βIII-tubulina. Utilizzare più combinazioni di anticorpi primario per co-etichettatura dei diversi marcatori. Un&#39;ulteriore conferma dell&#39;espressione di gliali, neuronali, endoteliali e periciti marcatori può essere ottenuto mediante trascrizione inversa e tempo reale PCR quantitativa (non descritto in questo protocollo). </li><li> Dopo l&#39;incubazione con l&#39;anticorpo primario lavata tre volte con 1 ml di PBS e aggiungere i corrispondenti anticorpi secondari (nelle opportune diluizioni) alla soluzione colorante e incubare 1 ora a temperatura ambiente al buio. Lavare le cellule 3 volte con PBS. Se necessario, prima del montaggio includono colorazione con DAPI per 5 min a temperatura ambientetemperatura. </li><li> Utilizzare antifading mezzo di montaggio e analizzare i vetrini coprioggetto utilizzando un microscopio a epifluorescenza o un microscopio confocale. </li></ol></li><li> Citometria a flusso: <ol><li> Per l&#39;analisi di espressione marcatore di superficie con citometria a flusso, crescere le cellule a confluenza in T25 non rivestito o T75 fiasche di coltura cellulare. </li><li> Staccare celle utilizzando TrypLE come descritto prima e risospendere in soluzione colorante costituito da PBS + 0,5% BSA. Per reazione a colorazione, risospendere 100.000-200.000 cellule in 100 ml di soluzione colorante. Preparare le reazioni di colorazione singoli per anticorpi utilizzati (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, rispettivi anticorpi di controllo isotipo). </li><li> Aggiungere anticorpi coniugati con fluorocromi per ogni soluzione colorante (per diluizioni vedi tabella di reagenti e attrezzature specifiche) direttamente nella sospensione cellulare e incubare a 4 ° C per 30 minuti al buio. </li><li> Lavare le cellule tre volte con 500 microlitri di PBS e spin giù tra ognifase di lavaggio a 157 xg per 5 min. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 0,5-1 ml di soluzione di colorazione e le cellule di trasferimento attraverso un colino cella (70 micron) per tubi FACS. Proteggere il campione dall&#39;esposizione alla luce. </li><li> Campioni Vortex prima di metterli in strumento FACS. </li><li> Per analizzare le cellule viventi ed escludere detriti e di cella aggregati, cancello per FSC-A e SSC-A. Duine cellulari sono specificamente gated da FSC-A e FSC-W. Per determinare le condizioni gating giuste per i marcatori di superficie cellulare impostare le porte con il controllo isotipo-abbinato coniugato al rispettivo fluorocromo. Quindi determinare la proporzione di cellule anticorpo-bound. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Arricchimento per le celle pericyte-derivate da cellule Fluorescence Activated Ordinamento <ol><li> Purificare la popolazione di cellule periciti (risospese in terreno di crescita) prima trasduzione tramite FACS classificare usando un ugello di 70 micron. Utilizzare CD34-APC in combinazione con la CD140b-PE e CD146-FITC per selezionare per pericytes. Ordina per, cellule CD140b-e CD146-CD34 positivi-negativi. </li><li> Raccogliere le cellule filtrate in mezzo di crescita e piastra su poli-D-lisina rivestite con copertura in vetro scivola in piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 e 5% O 2. </li><li> 48 ore dopo l&#39;ordinamento sostituire il supporto con mezzo di crescita fresco ed eseguono trasduzione come descritto nel protocollo 4. </li></ol> 4. Retrovirale trasduzione delle cellule pericyte-derivati ​​e Riprogrammazione in neuroni indotti Nota: Fare riferimento alle linee guida di biosicurezza locali durante la manipolazione di particelle retrovirali. In Germania l&#39;uso dei retrovirus impiegati qui richiede livello di biosicurezza 2. Per la produzione di particelle retrovirali riferimento al protocollo 6. Per costrutti retrovirali usati per la riprogrammazione, fare riferimento a Karow et al. (2012). I retrovirus sono stati pseudotyped con VSV-G (stomatite vescicolare virus-glicoproteina) 5. Per la produzione di consultare Gavrilescu et al 6. <ol><li> 24 ore prima della trasduzione retrovirale seme ~ 60.000 cellule su poli-D-lisina rivestite con copertura in vetro scivola in 500 microlitri terreno di coltura fresco in piastre da 24 pozzetti di coltura tissutale e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 e 5% O 2 . </li><li> Il giorno seguente, sostituire il mezzo di crescita con 500 microlitri fresco mezzo di crescita preriscaldata, e aggiungere 1 ml di rispettivi surnatanti concentrati contenenti particelle retrovirali (pCAG-IRES-DsRed per il controllo, specialmente durante stabilisce il protocollo in laboratorio), pCAG-ascl1 -IRES-DsRed, pCAG-Sox2-IRES-GFP. </li><li> Un giorno dopo, rimuovere il mezzo comprese le particelle virali dalle cellule e aggiunge 1 ml freschi, preriscaldata medio B27-differenziazione, composto da 49 ml DMEM con elevato glucosio GlutaMAX e 1 ml integratore privo di siero B27. Mantenere le cellule in coltura a 37 ° C in 5% CO 2 e 5% O 2 per 4-8 settimane senza cambiare il mezzo come variazioni medie ripetitive diventano dannose come INS maturare. </li></ol> 5. Caratterizzazione dei neuroni indotta da Immunocytochemistry <ol><li> Per determinare l&#39;identità cellulare delle cellule trasdotte, in particolare per dimostrare l&#39;acquisizione di un fenotipo neuronale, effettuare immunocitochimica contro antigeni neuronali come bIII-tubulina, MAP2, e NeuN (per gli anticorpi e le loro rispettive diluizioni, vedere tabella di reagenti specifici e attrezzature; seguire la stessa procedura indicata al punto 2.2.1). </li><li> Per migliorare la maturazione di PdiNs, co-coltura queste cellule con neuroni derivati ​​da E14 topo cortecce cerebrali. A tal fine, sezionare la corteccia cerebrale e dissociare il tessuto meccanicamente con una pipetta Pasteur di vetro lucidati a fuoco. Aggiungi 10,000-50,000 neuroni murini di colture di cellule pericyte derivate da 2-3 settimane dopo trasduzione con re-Sox2 e ascl1 di codificatroviruses e continuare la coltura. Cellule trasdotte possono essere distinte dai neuroni murini per la loro reporter (GFP e DsRed) espressione, sia per epifluorescenza dal vivo o in seguito immunocitochimica per la GFP e DsRed. </li><li> Per valutare la formazione di sinapsi su PdiNs di neuroni murini, eseguire immunocitochimica contro recettori per i neurotrasmettitori vescicolari come vescicolare del glutammato trasportatore 1 (VGLUT1). </li><li> Sonda cellule trasdotte per le loro proprietà elettriche (cioè la capacità di generare potenziali d&#39;azione) e la creazione di sinapsi funzionali da patch-clamp elettrofisiologia. Per i dettagli della procedura vedi Heinrich et al. (2011). </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il presente protocollo descrive l&#39;espansione in vitro e l&#39;arricchimento di cellule pericyte-derivate a seguito isolamento dal adulta corteccia cerebrale umana e la successiva conversione in Ins dall&#39;espressione retrovirus-mediata della trascrizione neurogena fattori Sox2 e Ascl1. Tale protocollo prevede un sistema sperimentale in vitro per studiare la stirpe di conversione delle cellule cerebrali residente in neuroni e potenzialmente anche glia, con l&#39;obiettivo in mente di tradurre in u...

Al contrario di riprogrammazione di cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), che a loro volta sono dotati di una pletora di potenziali di differenziazione, riprogrammare diretto mira per conversione diretta di uno specifico tipo cellulare in un altro. Per quanto riguarda la loro applicazione nel contesto della modellazione malattie e potenziali terapie a base di cellule, entrambi gli approcci di riprogrammazione hanno vantaggi e svantaggi specifici. Riprogrammazione in iPSCs (i) fornisce una fonte pressoché infinita di cellule; (Ii) consente di ingegneria genetica; (Iii) conferisce con un potenziale di differenziazione quasi illimitate. Tuttavia, principali svantaggi di iPSCs comportano il rischio di tumorigenicità delle cellule indifferenziate (formazione teratoma in vivo) e la necessità di coltura ex vivo e successivo trapianto se queste cellule devono essere utilizzati per terapie cellulari. Viceversa, diretto lignaggio riprogrammazione è limitata dalla minore resa delle cellule desiderateche correla direttamente con il numero di cellule bersaglio della popolazione di partenza, ma possiede il vantaggio che cellule della linea-riprogrammato sembrano mostrare alcun rischio oncogeno dopo trapianto 1,2; Inoltre, riprogrammazione diretta può anche essere realizzato in situ, cioè all&#39;interno dell&#39;organo dove sarebbero necessarie queste cellule, evitando così la necessità di trapianto. Con questo in mente, il nostro laboratorio ha perseguito la possibilità delle cellule cerebrali residente-lignaggio riprogrammazione in Ins come un nuovo approccio verso terapie cellulari delle malattie neurodegenerative. Le cellule cerebrali residente che possono essere potenzialmente considerati bersagli cellulari per lignaggio riprogrammazione comprendono diversi tipi di macroglia (astrociti, cellule NG2 e oligodendrociti), microglia e cellule dei microvasi associate (cellule endoteliali e periciti). Abbiamo ampiamente studiato il potenziale riprogrammazione in vitro della astroglia del cor cerebraletex dei primi topi postnatale 3-5. Alla ricerca di fonti di cellule simile adatti per lignaggio riprogrammazione diretta nel cervello umano adulto, abbiamo incontrato una popolazione di cellule che può essere riprogrammato con successo in Ins e caratteristiche espositive di periciti. Qui si descrive un protocollo di come raccogliere queste cellule adulte da biopsie del cervello umano, per espandere e arricchire queste cellule in vitro, e infine riprogrammare successo una frazione sostanziale di queste cellule espanse in vitro (nell&#39;intervallo 25-30%) in Ins. Riprogrammazione può essere ottenuto mediante simultanea retrovirus-mediata co-espressione di due fattori di trascrizione, Sox2 e ascl1. Questi PdiNs sono stati trovati per acquisire la capacità di azione ripetitiva potenziale di cottura e servire bersagli sinaptici per altri neuroni che indicano la loro capacità di integrare nelle reti neurali. Il nostro protocollo prevede una procedura semplice per l&#39;isolamento e lignaggio conversione di adulti pericytes cervello umano in Ins. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>anti-CD140b-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>558821</td><td>uso 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD146-FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA2141FT</td><td>uso 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD13-FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>MVA1270A488T</td><td>uso 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD34-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>560940</td><td>uso 1:100</td></tr><tr><td>anti-PDGFR&beta;</td><td>Cell Signaling</td><td>3169S</td><td>uso 1:200</td></tr><tr><td>anti-CD146</td><td>Abcam</td><td>Ab75769</td><td>uso 1:400</td></tr><tr><td>anti-NG2</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td>uso 1:400</td></tr><tr><td>anti-SMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2547</td><td>uso 1:400</td></tr><tr><td>anti-&beta; III-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8660</td><td>uso 1:400</td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4403</td><td>uso 1:200</td></tr><tr><td>anti-GFAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3893</td><td>uso 1:600</td></tr><tr><td>anti-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP 10-20</td><td>uso 1:1.000</td></tr><tr><td>anti-RFP</td><td>Chromotek</td><td>5F8</td><td>uso 1:500</td></tr><tr><td>anti-S100&beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td>uso 1:300</td></tr><tr><td>anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td>uso 1:200</td></tr><tr><td>anti-GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2052</td><td>uso 1:500</td></tr><tr><td>anti-Calretinina</td><td>Millipore</td><td>AB5054</td><td>uso 1:500</td></tr><tr><td>anti-vGluT1</td><td>SYnaptic SYstems</td><td>135511</td><td>uso 1:1.000</td></tr><tr><td>Controllo dell'isotipo di Rat IgG1 FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>11-4301-81</td><td>uso 1:100</td></tr><tr><td>Controllo dell'isotipo IgG1 di ratto PE</td><td>AbD Serotec</td><td>12-4301-81</td><td>uso 1:100</td></tr><tr><td>Controllo dell'isotipo IgG1 di ratto APC</td><td>AbD Serotec</td><td>17-4301-81</td><td>uso 1:100</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glucosio alto, GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>61965</td><td></td></tr><tr><td>B27 integratore senza siero</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>siero fetale di vitello</td><td>Invitrogen</td><td>10106-169</td><td>esegue l'inattivazione del calore mediante incubazione a 56 ° C per 30 min</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (soluzione salina bilanciata di Hanks)</td><td>Invitrogen</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>PBS di Dulbecco senza CaCl2 e MgCl2 (D-PBS, 1x)</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina bromidrato (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>PFA (paraformaldeide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1648</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-Diamidin-2-fenilindolo) dilattato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>042M4005</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Poly/ Monta</td><td>Polysciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Tubi a fondo tondo in polipropilene&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tubi in polistirene a fondo tondo con tappo a filtro cellulare.</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 24 pozzetti</td><td>Orange Scientific</td><td>5530305</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi per coltura da 75 cm2</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi per coltura da 25 cm2</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>Pipette monouso 10 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette (150 mm)</td><td>Fisherbrand</td><td>FB50251</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti diametro 12 mm</td><td>Menzel</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi chirurgici monouso&nbsp;</td><td>B. Braun</td><td>5518083</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352095</td><td></td></tr><tr>Cappa <td></td><td></td><td></td>a<td>flusso laminare</td></tr><tr><td>Centrifuga e rotore oscillante con adattatori per provette da 15 ml e 50 ml</td><td>Hettich Lab Technology</td><td>1406</td><td></td></tr><tr><td>Selezionatore di cellule per citometria a flusso: FACSAria l con software FACSDiva&nbsp;</td><td>BD Biosciences Incubatore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>per colture cellulari umificate</td><td>Eppendorf Galaxy 170R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua a 37 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSFirto della guaina del fluido&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a epifluorescenza BX61</td><td>Microscopio confocale Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lineage-riprogrammazione di cellule pericyte-derivate del cervello umano adulto in neuroni indotti

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Diretto lignaggio riprogrammazione di cellule non neuronali nei neuroni indotti (INS) può fornire approfondimenti sui meccanismi molecolari alla base neurogenesi e attivare nuove strategie per la modellazione in vitro o la riparazione del cervello malato. Identificazione dei tipi di cellule non neuronali cerebrali residente suscettibili di conversione diretta in Ins potrebbe consentire per il lancio di un tale approccio in situ, cioè all&#39;interno del tessuto cerebrale danneggiato. Qui si descrive un protocollo sviluppato nel tentativo di identificare cellule derivate dal cervello umano adulto che soddisfano questa premessa. Questo protocollo prevede: (1) la coltura di cellule umane dalla corteccia cerebrale ottenuto da biopsie cerebrali adulte umane; (2) l&#39;espansione in vitro (approssimativamente richiede 2-4 settimane) e caratterizzazione di coltura mediante immunocitochimica e citofluorimetria; (3) l&#39;arricchimento da cellule fluorescenza-attivato (FACS) usando anti-recettore PDGF-β e anticorpi anti-CD146;(4) il retrovirus trasduzione mediata con la trascrizione neurogenica fattori Sox2 e ascl1; (5) e, infine, la caratterizzazione della risultante neuroni indotti periciti-derivato (PdiNs) mediante immunocitochimica (14 giorni a 8 settimane dopo trasduzione retrovirale). In questa fase, in possono essere sondato per le loro proprietà elettriche mediante registrazione patch-clamp. Questo protocollo prevede una procedura altamente riproducibile per la conversione in vitro stirpe di pericytes cervello residente in Ins umane funzionali.

Il primo risultato di questo protocollo dopo aver stabilito con successo una cultura da un esemplare di umano adulto corteccia cerebrale consiste nell&#39;identificazione della composizione cellulare della cultura. Immunocitochimica di proteine ​​specifiche di tipo cellulare rivela un notevole grado di eterogeneità tra culture derivati ​​da esemplari di diversi pazienti (Figura 1A). Quantificata mediante citometria di flusso vi è sempre una frazione sostanziale di cellule che esprimono PDGFRβ (in media ...

Targeting cellule cerebrali residente per discendenza diretta-riprogrammazione offre nuove prospettive per la riparazione del cervello. Qui si descrive un protocollo di come preparare le culture arricchito da pericytes cervello residente da adulto corteccia cerebrale umana e convertirli in neuroni indotti dall&#39;espressione retrovirus-mediata dei fattori di trascrizione Sox2 e Ascl1.

Lineage-riprogrammazione di cellule pericyte-derivate del cervello umano adulto in neuroni indotti

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è convertire cellule derivate da parassiti cerebrali umani in neuroni indotti. Questo risultato si ottiene isolando e coltivando cellule derivate da parassiti prelevate da campioni cerebrali chirurgici. Successivamente, dopo l'espansione, le cellule in vitro vengono marcate mediante immunomarcatura per marcatori parassitari, il che consente la caratterizzazione e un ulteriore arricchimento delle cellule.Successivamente, le cellule derivate dal parassita vengono transdotte con vettori retrovirali che codificano per determinanti del destino neuronale al fine di convertirle direttamente in neuroni indotti. Si ottengono risultati che mostrano neuroni indotti ottenuti da cellule derivate dal parassita sottoposte a riprogrammazione della linea cellulare, in base alla colorazione immunoistochimica per il marcatore neuronale beta-tubulina III. Il vantaggio principale di questo approccio rispetto ai metodi esistenti, come il riprogrammamento di fibroblasti o la differenziazione di cellule staminali embrionali in neuroni, è che si mirano cellule endogene al cervello, il che potrebbe in ultima analisi aprire la strada alla conversione diretta dell

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Primaria, umani fetali di derivazione cerebrale, le cellule progenitrici multipotenti...

Progenitore di derivazione Sistema Cultura Oligodendrocyte dal cervello umano fetale

Questo video dimostra la riprogrammazione diretta di cellule progenitrici ematopoietiche geneticamente modificate in cellule staminali neuronali. I fattori di trascrizione espressi dalle cellule progenitrici ematopoietiche innescano una cascata di eventi molecolari che facilitano la loro trasformazione. Ulteriori terreni specifici vengono utilizzati per selezionare e far crescere le cellule staminali neuronali indotte.

Riprogrammazione diretta delle cellule progenitrici ematopoietiche in cellule staminali neurali

Questo video mostra il processo di differenziazione delle cellule progenitrici neurali indotte (iNPC) in neuroni e astrociti utilizzando mezzi specializzati.

Differenziazione delle cellule progenitrici neurali indotte in astrociti

Il video dimostra la generazione di neuroni da fibroblasti dermici umani adulti (aHDF). Gli aHDF vengono riprogrammati utilizzando un vettore lentivirale che trasporta geni per fattori di trascrizione neuronale e RNA a forcina corta (shRNA). Gli shRNA inibiscono l'espressione di un repressore trascrizionale neuronale e i fattori di trascrizione neuronale attivano i geni per differenziare gli aHDF in neuroni. Questi aHDF riprogrammati vengono coltivati in un mezzo di conversione neuronale...

Generazione di neuroni riprogrammando le cellule dei fibroblasti dermici umani

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte fornisce prospettive affascinanti per la derivazione di trapianto autologo. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e laborioso ri-differenziazione impedisce ancora di traduzione clinica. Qui si descrive la derivazione di fibroblasti umani adulti e la loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali indotte e la successiva differenziazione in linee neurali.

Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

La formazione immagine dal vivo è un potente strumento per studiare i comportamenti cellulari in tempo reale. Qui, descriviamo un protocollo per time-lapse video-microscopia delle cellule della corteccia cerebrale primario che consente un esame dettagliato delle fasi promulgata durante la progressione di lignaggio da cellule staminali neurali primarie a differenziato neuroni e cellule gliali.

Immagini di corteccia cerebrale primario celle utilizzando un sistema 2D cultura dal vivo

È descritto un protocollo robusto per monitorare le popolazioni neurali di time-lapse video-microscopia seguita da basati su software di post-elaborazione. Questo metodo rappresenta un potente strumento per identificare gli eventi biologici in una popolazione selezionata durante esperimenti dal vivo di formazione immagine.

Seguita dalla singola cellula di rilevamento a Monitor biologia cellulare e la progressione di lignaggio di popolazioni neurali Multiple immagini dal vivo

Riprogrammazione neuronale diretto genera neuroni che mantengono l'età della cellula somatica partenza. Qui, descriviamo un metodo basato su vettori per generare neuroni indotti dai fibroblasti cutanei ottenuti da donatori umani adulti.

Semplice generazione di una cultura ad alto rendimento dei neuroni indotti da fibroblasti umani della pelle adulta

Il protocollo presenta la riprogrammazione delle cellule mononucleari del sangue periferiche per indurre le cellule staminali neurali mediante l'infezione da virus Sendai, la differenziazione degli iNSC in neuroni dopaminergici, il trapianto di precursori DA nei precursori unilateralmente Modelli murini del morbo di Parkinson e valutazione della sicurezza e dell'efficacia dei precursori DA derivati da iNSC per il trattamento con LA PD.

Generazione di cellule staminali neurali indotte da cellule mononucleari periferiche e differenziazione verso i precursori dei neuroni dopaminergici per gli studi di trapianto

Descriviamo un protocollo per riprogrammare i fibroblasti derivati dalla pelle umana in cellule progenitrici neuronali indotte (INPC) e la loro successiva differenziazione in Astrociti indotti (iA). Questo metodo porta a una generazione rapida e riproducibile di iNPC e iA in grandi quantità.

Modellazione in vitro per malattie neurologiche utilizzando la conversione diretta dai fibroblasti alle cellule progenitrici neuronali e la differenziazione in astrociti

La capacità di marcare in modo permanente le cellule staminali e la loro progenie con un fluoroforo utilizzando una linea di topo di tracciamento del lignaggio transgenico inducibile consente l'analisi spaziale e temporale dell'attivazione, proliferazione, migrazione e / o differenziazione in vivo. Il tracciamento del lignaggio può rivelare nuove informazioni sull'impegno del lignaggio, sulla risposta agli interventi e sulla multipotenza.

Tracciamento del lignaggio delle cellule staminali fluorescenti inducibili nel cervello del topo adulto

Scopri come riprogrammare periciti cerebrali umani in neuroni indotti mediante vettori retrovirali con Sox2 e Ascl1. Questo metodo consente la conversione diretta di cellule endogene per strategie innovative di riparazione cerebrale.

Lineage-riprogrammazione di cellule pericyte-derivate del cervello umano adulto in neuroni indotti

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