Name: MALDI-Mass spettrometria di imaging per le inchieste sui metaboliti in Medicago truncatula Root noduli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Scopri l'imaging spettrometrico MALDI per analizzare metaboliti endogeni nei noduli radicali di Medicago truncatula. Questo metodo consente di mappare la distribuzione spaziale delle molecole biologiche in vivo.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Jean-Michel Ané presso il Dipartimento di Agronomia a UW-Madison per la fornitura di campioni truncatula Medicago. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un finanziamento della National Science Foundation (NSF) concessione CHE-0957784, l&#39;Università del Wisconsin Graduate School e la Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) e il programma Romnes Ricerca Faculty Fellowship (LL). EG riconosce un NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1.256.259).

1. Strumentazione <ol><li> MALDI-TOF/TOF MSI. Utilizzare uno spettrometro di massa equipaggiati con una sorgente MALDI per l&#39;analisi di piccole molecole (vedi Tabella dei Materiali / Equipment). Effettuare acquisizioni in modalità ione positivo o negativo a seconda degli analiti di interesse. Specificare un intervallo di massa di interesse e raccogliere 500 colpi laser / spot a 50 micron intervalli in entrambe le dimensioni X e Y attraverso la superficie del campione per generare immagini di ioni. La larghezza raster e numero di colpi laser possono essere regolati per ottenere rispettivamente maggiore risoluzione spaziale e l&#39;intensità del segnale massimo. Utilizzare picchi matrice DHB o standard interni applicati alla slitta o direttamente al tessuto per calibrare gli spettri di massa. </li><li> Alta Risoluzione LC-MS. (Vedi Tabella dei materiali / attrezzature) estratti del campione eseguito con LC-MS utilizzando fase inversa (RP) LC con una colonna C-18, o fase normale (NP), con una colonna HILIC a seconda delle analiti di interesse. Usa fasi mobili esfumature come appropriati per il tipo di campione specifico. Effettuare acquisizioni in modalità ioni positivi o negativi a seconda del tipo di campione. </li></ol> 2. Tissue Preparazione <ol><li> Tagliare il nodulo della radice della pianta, lasciando 3-4 mm di radice collegati al nodulo. </li><li> Subito dopo la dissezione, utilizzare pinze per posizionare il tessuto in una tazza criostato e coprire con gelatina (100 mg / ml in acqua deionizzata). E &#39;essenziale per il tessuto da attaccata al fondo della tazza con bolle d&#39;aria. </li><li> Flash congelare il tessuto posizionando la coppa in un bagno di ghiaccio / etanolo secco finché la gelatina si indurisce e diventa opaca. Conservare i campioni a -80 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Rimuovere i campioni dal -80 ° C freezer, tagliare via la coppa criostato plastica e tagliare via l&#39;eccesso di gelatina. Montare il tessuto incorporato per il mandrino criostato con una monetina piccola quantità di temperatura di taglio ottimale (OCT) i media, pur non lasciando l&#39;ottobre toccare il tessuto. Mettere in criostatobox fino a quando i solidifica ottobre. </li><li> Lasciare il mandrino e gelatina equilibrare nella casella criostato (insieme a -20 o -25 ° C) per circa 15 min. </li><li> Utilizzare il criostato (vedi TABELLA MATERIALI / Equipment) alla sezione di tessuto circa lo spessore di una cella (8-20 micron a seconda del tipo di tessuto) e disgelo montare ogni fetta sul vetro ITO rivestite riscaldando la parte posteriore (non-ITO lato) di un vetrino ITO rivestito sul dorso della mano rivestita. Posizionare il lato ITO rivestito del vetrino riscaldato vicino alla fetta di tessuto congelato e lasciare la fetta di bastone sul vetrino. Posizionamento delle sezioni vicine sulla diapositiva fornirà un migliore allineamento durante MSI. </li></ol> 3. Matrix Applicazione <ol><li> Airbrush Applicazione di MALDI Matrix <ol><li> Tutte le procedure aerografo devono essere eseguite in una cappa aspirante. </li><li> Pulire accuratamente il contenitore della soluzione aerografo e ugello (vedi Tabella dei materiali / attrezzature) con metanolo eriempire il contenitore della soluzione con soluzione di matrice DHB (150 mg / ml nel 50% methanol/0.1% TFA v / v). </li><li> Tenere l&#39;aerografo di circa 35 cm dal campione e applicare 10-15 strati di matrice sulla superficie del vetrino con una durata di 10 sec spray e 30 sec tempo di asciugatura tra ogni cappotto. </li><li> Pulire accuratamente l&#39;aerografo nuovo con metanolo al termine per evitare di intasare dalla soluzione matrice. </li></ol></li><li> Spruzzatore automatico Applicazione di MALDI Matrix <ol><li> Seguire le istruzioni di start-up forniti dai produttori del sistema di spruzzatore automatico. </li><li> Per MSI di metaboliti in noduli radicali utilizzando 40 mg / ml (50% in methanol/0.1% TFA v / v) DHB come matrice, impostare la temperatura a ~ 80 ° C, velocità a 1250 mm / min, portata a 50 microlitri / min, e il numero di passaggi a 24. Per copertura ottimale, si raccomanda di ruotare l&#39;ugello 90 ° e / o compensare l&#39;ugello 1,5 millimetri tra ogni passata. Avviare il metodo spruzzatore. Come SIde nota, il particolare sistema di spruzzatore utilizzato qui riscalda l&#39;ugello per un&#39;evaporazione più rapida del solvente. Come solvente evapora, la concentrazione della matrice aumenta rapidamente. La matrice applicata al campione con l&#39;aerografo e lo spruzzatore automatico hanno concentrazioni confrontabili. </li><li> Seguire le istruzioni sullo spegnimento forniti dai produttori del sistema di spruzzatore automatico. </li></ol></li><li> Sublimazione Applicazione di MALDI Matrix <ol><li> Pesare 300 mg DHB nella parte inferiore della camera di sublimazione (vedi Tabella dei Materiali / Equipment). </li><li> Stick il vetrino al dito freddo (porzione superiore della camera di sublimazione) con le sezioni di tessuto rivolto verso il basso con biadesivo, nastro conduttivo. Coprire tutta la parte posteriore della diapositiva con il nastro biadesivo anche per conducibilità, producendo anche deposizione di matrice. </li><li> Bloccare le metà superiore e inferiore della camera di sublimazione insieme al C-clamp. Collegare il vuoto e add ghiaccio e acqua fredda al serbatoio superiore. </li><li> Posizionare camera di sublimazione in un mantello riscaldante che è a temperatura ambiente. </li><li> Accendere la pompa a vuoto. Attendere 15 minuti e accendere il mantello di riscaldamento. Il mantello riscaldante dovrebbe raggiungere 120 ° C nel corso di 10 min. </li><li> Dopo 10 min, spegnere il fuoco, chiudere la valvola a vuoto (quindi l&#39;interno della camera rimane sotto vuoto) e spegnere la pompa a vuoto. </li><li> Lasciare la camera per venire a temperatura ambiente, aprire la valvola rilasciando la pressione del vuoto e rimuovere il campione. Le dimensioni della camera di sublimazione determinerà la quantità di matrice sublimato al vetrino. Le grandi camere di sublimazione (delle dimensioni di un bicchiere da 400 ml) utilizzerà circa 300 mg di DHB mentre le camere più piccole (la dimensione di un bicchiere da 150 ml) utilizzerà circa 100 mg di DHB e richiederanno tagliare il vetrino in modo che si inserisce nella camera. </li></ol></li></ol> 4. Acquisizione Immagine <ol> &lt;li&gt; Mark un modello + su ogni angolo del campione con una penna correttore liquido WiteOut per essere usato come &quot;insegnare punti&quot;. Posizionare il vetrino nella piastra di adattamento scorrevole MALDI e prendere un&#39;immagine ottica del campione utilizzando uno scanner. </li><li> Impostare un file di acquisizione immagine utilizzando il software fornito dalla società strumento con un passo raster di 50 micron e un diametro laser uguale o inferiore alla dimensione del passo raster. Su questo particolare strumento, l&#39;impostazione minima laser spedisce un diametro laser di impostazione laser circa 10 micron e piccolo ha un diametro di 40-50 micron. </li><li> Caricare l&#39;immagine ottica nel software e allineare la piastra con l&#39;immagine ottica. </li><li> Calibrare lo strumento prima di iniziare l&#39;acquisizione utilizzando ioni comuni matrici di cluster, standard interni, o un mix di calibrazione. </li><li> Specificano le aree di tessuto da analizzare con MSI, compreso un punto di pura matrice sul vetrino per essere utilizzato come &quot;bianco&quot;. </li><li> Inizia acquisizione. </li></ol> 5. Generazione Immagine <ol><li> Aprire il file di immagini nel software disponibile in commercio fornito dal venditore e estrarre le immagini di ioni. Altri software open-source è disponibile per MSI elaborazione dei dati 19. </li></ol> 6. Identificazione di Metaboliti <ol><li> Selezionare uno specifico m / z di interesse da parte lo spettro di massa utilizzando il software specifico del fornitore (vedi Tabella dei Materiali / Equipment). Un analita può essere distinto da uno ione matrice quando un picco analita viene scelto dal spettro di massa e immagini ioni sono generati specificamente localizzata nella sezione di tessuto. </li><li> Generare un elenco di analiti di interesse e di effettuare esperimenti di MS / MS. Vedi Tabella 1 e Tabella 2 Risultati rappresentativi per le liste di campionamento di analiti. </li><li> Eseguire mirata analisi LC-MS su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione (o alta risoluzione MALDI-MS se disponibile) per ottenere accuratemisure di massa degli analiti di interesse e anche effettuare LC-MS/MS degli analiti bersaglio per ottenere modelli caratteristici di frammentazione. </li><li> Eseguire database di ricerca per determinare le identificazioni putativi per gli analiti mirati. Esempi di database metaboliti comprendono: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG, e HMDB. </li><li> Per confermare le identificazioni putativi di accurata ricerca nei database di massa, far corrispondere la MS / MS da parte degli analiti mirati per MS / MS spettri di standard, letteratura, e / o software di previsione frammentazione. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Come discusso sopra, la preparazione del campione è la fase più critica del flusso di lavoro MSI. Incorporare il tessuto non uniforme causerà sezionamento essere difficile o impossibile in alcuni casi. La dimensione del vano e adeguato tempo di equilibrio sono cruciali per mantenere l&#39;integrità dei tessuti ed evitando piegatura e lacrime. Selezione di matrice e tecnica di applicazione giocherà un ruolo nella determinazione dei tipi di analiti da rilevare, la risoluzione spaziale, e la riproducibilità dei risultati. ...

Il settore in crescita della metabolomica ha molte importanti applicazioni biologiche, tra cui la scoperta di biomarcatori, decifrando vie metaboliche nelle piante e negli altri sistemi biologici, e tossicologia profiling 4,6-10. Una grande sfida tecnica quando si studiano i sistemi biologici è quello di studiare percorsi metabolomica senza interrompere il loro 11. MALDI-MSI consente per l&#39;analisi diretta dei tessuti intatti che consente il rilevamento sensibile di analiti in singoli organi 12,13 e perfino singole cellule 14,15. La preparazione del campione è un passo cruciale nella produzione di immagini spettrali di massa riproducibili e affidabili. La qualità delle immagini dipende molto da fattori come il tessuto mezzo di inclusione, spessore di strato, matrice MALDI e tecnica di applicazione matrice. Per applicazioni di imaging, spessore della sezione ideale è la larghezza di una cella (8-20 micron a seconda del tipo di campione). MALDI richiede deposizione di un organico, crystallinpreparato a matrice e, tipicamente un acido debole, sul campione per assistere l&#39;ablazione analita e ionizzazione. 16 differenti matrici forniscono diverse intensità di segnale, ioni interferenti, e l&#39;efficienza di ionizzazione di diverse classi di composti. La tecnica di applicazione matrice gioca anche un ruolo nella qualità delle immagini di spettri di massa e tecniche diverse è adatto per diverse classi di analiti. Tre modalità applicative matrice vengono presentati in questo protocollo: aerografo, spruzzatore automatico, e la sublimazione. Applicazione matrice aerografo è stato ampiamente utilizzato nella diagnostica per immagini MALDI. Il vantaggio dell&#39;applicazione matrice aerografo è che è relativamente semplice e veloce. Tuttavia, la qualità dell&#39;applicazione matrice aerografo dipende fortemente dall&#39;abilità dell&#39;utilizzatore e tende ad essere meno riproducibile e provocare la diffusione di analiti, in particolare piccole molecole 17. Sistemi di spruzzatore automatici devono meccanici simili a aerografo applicazione della matrice, ma have sviluppato per rimuovere la variabilità visto con applicazione aerografo manuale, rendendo lo spray più riproducibile. Questo metodo può essere a volte più in termini di tempo di applicazione matrice aerografo tradizionale. Sia aerografo manuale e sistemi di spruzzatore automatici sono metodi di applicazione della matrice a base di solventi. Sublimazione è una tecnica di applicazione matrice secca che sta diventando sempre più popolare per l&#39;imaging spettrale di massa dei metaboliti e piccole molecole perché riduce analita diffusione, tuttavia, manca la necessaria solvente per estrarre e osservare composti massa superiore 18. Individuazione Fiducioso di metaboliti in genere richiede misurazioni di massa accurata avere identificazioni putativi seguiti da massa tandem (MS / MS) esperimenti di convalida con MS / MS spettri di essere rispetto agli standard, la letteratura, o spettri teorici. In questo protocollo alta risoluzione (massa potenza di 60.000 m / z 400 risoluzione), cromatografia liquida (LC)-MS è accoppiato MALDI-MSI per ottenere sia informazioni spaziali e identificazioni sicure di metaboliti endogeni, utilizzando Medicago truncatula radici e noduli radicali come il sistema biologico. Esperimenti MS / MS possono essere eseguite direttamente sul tessuto con MALDI-MSI o su estratti di tessuto con LC-MS e utilizzati per la validazione delle identificazioni dei metaboliti. Questo protocollo fornisce un metodo semplice per mappare metaboliti endogeni in M. truncatula, che può essere adattato e applicato al MSI di piccole molecole in vari tipi di tessuto e sistemi biologici.

<table><tbody><tr><td>Gelatina</td><td>Difco</td><td><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=214340">214340</a></td><td>heat per sciogliere</td></tr><tr><td>Cryostat- HM 550</td><td>Thermo Scientific</td><td>956564A</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini rivestiti di ossido di indio stagno (ITO)&nbsp;</td><td>Delta Technologies</td><td>CB-90IN-S107</td><td>25 mm x 75 mm x 0,8 mm (larghezza x lunghezza x spessore)</td></tr><tr><td>Matrice di acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB)&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals</td><td><a href="http://www.labsource.com/Catalog/Item.aspx? ItemID=1787195">PI90033</a></td><td></td></tr><tr><td>Aerografo</td><td>Paasche Aerografo Azienda</td><td>TG-100D</td><td>accoppiato con contenitore in acciaio da 75 ml</td></tr><tr><td>Sistema di spruzzatura a matrice automatica - TM-Sprayer</td><td>HTX Technologies, LLC</td><td>HTX. TMSP. H021-U</td><td>Istruzioni specifiche per l'avvio e lo spegnimento verranno fornite al momento dell'installazione dello strumento</td></tr><tr><td>Apparecchio a sublimazione&nbsp;</td><td>Chemglass Life Science</td><td><a href="http://www.chemglass.com/product_view.asp?pnr=CG-3038">CG-3038-01</a></td><td></td></tr><tr><td>Pompa per vuoto- Alcatel 2008 A</td><td>Ideal Vacuum Products</td><td>P10976</td><td>Pressione finale = 1 x 10-4 Torr</td></tr><tr><td>ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF</td><td>Bruker Daltonics</td><td>276601</td><td></td></tr><tr><td>FlexImaging</td><td>Bruker Daltonics</td><td>269841</td><td>Un esempio di "software specifico per il venditore"</td></tr><tr><td>MALDI LTQ Orbitrap</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMASZ</td><td>Strumento MALDI ad alta risoluzione per misurazioni accurate della massa</td></tr><tr><td>Q Exactive</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>Strumento LC-MS ad alta risoluzione per misurazioni accurate della massa</td></tr></tbody></table>

maldi-mass spettrometria di imaging per le inchieste sui metaboliti in<em&gt; medicago truncatula</em&gt; root noduli

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

La maggior parte delle tecniche utilizzate per studiare piccole molecole, come farmaci o metaboliti endogeni, impiegare estratti tissutali che richiedono l&#39;omogeneizzazione del tessuto di interesse che potrebbe potenzialmente causare variazioni nelle vie metaboliche in fase di studio 1. Mass spettrometria di imaging (MSI) è uno strumento di analisi potente che può fornire informazioni spaziali di analiti all&#39;interno fette intatto di campioni di tessuti biologici 1-5. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata per studiare vari tipi di composti tra cui proteine, peptidi, lipidi, e piccole molecole come metaboliti endogeni. Con matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione (MALDI)-MSI, distribuzioni spaziali di più metaboliti possono essere rilevati simultaneamente. Qui, un metodo sviluppato specificamente per lo svolgimento di mirati metabolomica MSI esperimenti sulle radici di legumi e noduli radicali viene presentata, che potrebbe rivelare intuizioni processi biologici che avvengono. Ilmetodo qui presentato mostra un flusso di lavoro tipico MSI, dalla preparazione del campione per l&#39;acquisizione delle immagini, e si concentra sulla fase di applicazione matrice, dimostrando diverse tecniche applicative matrice che sono utili per rilevare piccole molecole. Una volta che vengono generate le immagini MS, l&#39;analisi e l&#39;identificazione dei metaboliti di interesse è discusso e dimostrato. Il flusso di lavoro standard qui presentato può essere facilmente modificato per diversi tipi di tessuto, specie molecolari, e la strumentazione.

Una panoramica sperimentale di MSI è mostrato in Figura 1. All&#39;inizio dell&#39;esperimento, preparazione del campione è un passaggio fondamentale. I noduli vengono tagliati dalla radice vegetale e incorporati in gelatina. Il tessuto deve essere appiattita contro la tazza criostato, in assenza di bolle, mentre viene congelato; questo garantirà allineamento facile e corretto del tessuto mentre viene sezionato. Quando il tessuto viene affettato, è importante tagliare il tessuto allo spessore adeguato; ...

Mass spettrometria di imaging (MSI) è un potente strumento che può essere utilizzato per scoprire e identificare le varie specie chimiche nei tessuti intatti, preservando i composti nel loro ambiente naturale, in grado di fornire nuove intuizioni in processi biologici. Qui un metodo MSI sviluppato per l&#39;analisi di piccole molecole è descritto.

MALDI-Mass spettrometria di imaging per le inchieste sui metaboliti in<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Root noduli

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un'analisi spettrometrica di massa multipla affidabile di piccole molecole in tessuti radicali vegetali. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando i campioni di tessuto alle dimensioni appropriate. Il secondo passaggio consiste nell'ottimizzare e applicare la matrice maldi al campione di tessuto.Successivamente, il campione viene sottoposto a MALDI e vengono raccolti spettri MSI su tutto il tessuto. L'ultima fase consiste nell'elaborazione dei dati, nella quale possono essere identificati analiti biologicamente importanti. In definitiva, la MSI con MALDI viene utilizzata per rilevare metaboliti endogeni presenti nei noduli radicali delle leguminose.Questo metodo può fornire informazioni sui metaboliti presenti nel tessuto radicale delle piante, ma può essere applicato anche allo studio di piccole molecole e tessuti di altri sistemi modello, inclusi mammiferi, crostacei, insetti e altri ancora. Prima di tutto, rimuovere i campioni di tessuto vegetale precedentemente preparati dal congelatore a meno 80 gradi Celsius. Quindi, rimuovere la coppetta di plastica del criostato e tagliare via il gelatina in eccesso, fissare il tessuto incluso su un mandrino del criostato utilizzando una quantità delle dimensioni di una moneta da dieci centesimi di media ottimale per il taglio (OCT), avendo cura che l'OCT non entri in contatto con il tessuto.Posizionare il portacampioni del criostato in una scatola per criostato impostata a meno 20 gradi Celsius fino a quando l'OCT si solidifica. Dopo aver lasciato equilibrare il portacampioni e la gelatina nell'atmosfera controllata (AC) della scatola per criostato per circa 15 minuti, utilizzare il criostato per sezionare il tessuto a uno spessore approssimativamente pari a una cellula. Quindi, montare manualmente ogni sezione su un vetrino pre-raffreddato riscaldando il lato non rivestito del vetrino sul dorso della mano.Successivamente, posizionare il lato del vetrino rivestito con ITO, riscaldato, vicino alla sezione di tessuto congelato e lasciare che la sezione aderisca al vetrino per l'applicazione del matrix MALDI mediante airbrush. Pulire accuratamente il contenitore della soluzione dell'airbrush e l'ugello con metanolo e riempire il contenitore con la soluzione di matrix DHB. Tenere l'airbrush a circa 35 centimetri dal campione ed applicare da 10 a 15 strati di matrix sulla superficie del vetrino, con una durata di 10 secondi di spruzzo e 30 secondi di tempo di asciugatura tra un'applicazione e l'altra.Una volta terminato, pulire accuratamente l'aerografo con metanolo per evitare intasamenti. A causa della soluzione della matrice, è importante notare che, sebbene gli aerografi siano più facilmente reperibili, i sistemi automatici di nebulizzazione della matrice spesso producono una copertura della matrice più uniforme e riproducibile per l'applicazione per sublimazione della matrice maldi. Pesare 300 milligrammi di DHB e porli sul fondo della camera di sublimazione. Attaccare il vetrino al dito freddo con il nastro conduttivo bifacciale, con le sezioni di tessuto rivolte verso il basso. Tagliare il vetrino se è troppo grande.Per la camera di sublimazione, fissare insieme le due metà superiore e inferiore della camera di sublimazione con la morsetto a C. Quindi posizionare la camera di sublimazione in un mantello riscaldante a temperatura ambiente. Collegare il vuoto e aggiungere ghiaccio in acqua fredda al serbatoio superiore.Dopo aver acceso la pompa a vuoto, attendere 15 minuti e accendere il mantello riscaldante. Dopo 10 minuti, spegnere il riscaldamento, chiudere la valvola del vuoto e spegnere la pompa a vuoto. Una volta che la camera si è raffreddata a temperatura ambiente, aprire la valvola per rilasciare la pressione sotto vuoto ed estrarre il campione.Successivamente, segnare un modello a croce su ogni angolo del campione con la penna contenente il fluido correttivo, da utilizzare come punti di riferimento. Posizionare il vetrino nell'adattatore per vetrini Maldi e acquisire un'immagine ottica del campione utilizzando uno scanner. Verificare l'immagine sul computer e ruotare l'immagine in modo che appaia correttamente sullo schermo.Nella stessa orientazione, il campione verrà posizionato nello strumento. Configurare un file di acquisizione dell'immagine utilizzando il software fornito dalla società dello strumento, con una dimensione del passo della scansione raster di 50 micrometri e un diametro del laser uguale o inferiore alla dimensione del passo della scansione raster. A questo punto, caricare l'immagine ottica nel software e allineare la piastra con l'immagine ottica.Dopo aver calibrato lo strumento, specificare le aree di tessuto da analizzare con MSI, inclusa una goccia di matrice pura sul vetrino da utilizzare come bianco. Successivamente, avviare l'acquisizione; al termine dell'acquisizione dei dati, aprire il file di imaging nel software fornito dal produttore ed estrarre le immagini ioniche selezionando dallo spettro di massa un rapporto massa/carica specifico di interesse. Mediante il software, creare un elenco di analiti specifici di interesse per un'ulteriore identificazione.Eseguire ricerche in database a massa esatta per determinare identificazioni presunte per gli analiti mirati. Per confermare le identificazioni presunte ottenute mediante ricerca in database a massa esatta, confrontare gli spettri MS degli analiti mirati con spettri MS/MS di standard, della letteratura e/o software di previsione della frammentazione. Qui sotto è mostrata un'immagine ottica di una sezione di nodulo radicale di Mego Tula.Di seguito è riportato un esempio di immagine ottica della copertura della matrice e delle dimensioni dei cristalli, ottenuti rispettivamente mediante spruzzatura automatica con aerografo e sublimazione. Il metodo di applicazione con aerografo genera cristalli di grandi e piccole dimensioni, mentre il metodo con spruzzatore automatico produce cristalli piccoli dalle dimensioni uniformi; la sublimazione invece genera un unico strato omogeneo di matrice.Matrici convenzionali come DHB producono molti ioni nell'intervallo di massa inferiore a 500 Dalton. Questi ioni di matrice possono interferire con il rilevamento dei metaboliti in questo intervallo. Qui vengono mostrati gli spettri MS della sola matrice DHB confrontati con quelli di tessuto di nodulo radicale rivestito con matrice DHB.I picchi della matrice possono essere distinti dai veri metaboliti utilizzando le immagini MS. Quando si fa clic su un picco, l'immagine ionica viene estratta e visualizzata sovrapposta all'immagine ottica. I picchi che generano immagini con una localizzazione distinta nel tessuto e che non sono presenti nelle aree immaginate contenenti solo matrice sono considerati metaboliti; qui vengono mostrate diverse immagini ioniche rappresentative di metaboliti riscontrati nel tessuto del nodulo radicale.Sebbene siano mostrati qui esempi di immagini di spettrometria di massa corrispondenti a picchi legati alla matrice, questa immagine mostra una localizzazione distinta nel tessuto del nodulo radicale e l'assenza di segnale nell'area della matrice che è stata analizzata. Questo segnale mostra una scarsa localizzazione ed è presente su tutto il tessuto. Il segnale è inoltre osservabile nell'area della sola matrice che è stata analizzata.L'obiettivo finale degli esperimenti di metabolomica non mirata è rilevare e determinare analiti biologicamente importanti e identificare i composti di interesse. Di seguito è riportato un esempio di uno dei metaboliti rilevati mediante MSI e LCMS. Questo metabolita è stato identificato come eme sulla base della massa esatta ottenuta con LCMS ad alta risoluzione e dello spettro MSM MSS.Questi dati MSMS sono stati confrontati con gli spettri MSM S precedentemente pubblicati da Shima e Sato, riscontrando una corrispondenza tra i due spettri MSM S. Pertanto, l'identità del rapporto massa/carica di 6 1 6 0,2 è stata assegnata con sicurezza come eme, sulla base della ricerca nel database delle masse accurate e del confronto dei dati Ms.MS con quelli presenti in letteratura. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare la spettrometria di massa con ionizzazione MALDI per rilevare e mappare la distribuzione spaziale di metaboliti biologicamente rilevanti, impiegando un metodo applicabile allo studio di molecole piccole in diversi tipi di tessuti e sistemi modello.

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Un modo rapido per guadagnare è descritto lo studio della struttura di polisaccaridi in una matrice extracellulare. Il metodo sfrutta la specificità del glycosylhydrolases e la sensibilità della spettrometria di massa permette piccole quantità di materiale da analizzare. Questa tecnica è adattabile per essere utilizzato direttamente sul tessuto stesso.

Oligo Profiling di massa (OLIMP) di polisaccaridi extracellulari

Una sorgente di imaging per spettrometria di massa (MSI) operata a pressione atmosferica è stata sviluppata accoppiando il desorbimento laser nel medio infrarosso e la post-ionizzazione elettrospray. La matrice di ghiaccio esogena è stata utilizzata come matrice di assorbimento dell'energia per facilitare il desorbimento risonante del materiale correlato ai tessuti. Questo manoscritto fornisce un protocollo passo-passo per l'esecuzione dell'IR-MALDESI MSI di topo neonatale di tutto il corpo.

Tutto il corpo Imaging Mass Spectrometry da Infrared Matrix-Assisted Laser desorbimento per ionizzazione elettrospray (IR-Maldesi)

Spettrometria di massa di foglia spray è una tecnica di analisi chimica diretta che riduce al minimo la preparazione del campione ed Elimina cromatografia, consentendo per la rilevazione rapida di piccole molecole da tessuti vegetali.

Spettrometria di massa di foglia Spray: Una tecnica di ionizzazione ambiente rapido per valutare direttamente metaboliti dai tessuti vegetali

Questo metodo utilizza l'imaging della spettrometria di massa (MSI) per comprendere i processi metabolici nelle foglie di S. alba quando esposte agli xenobiotici. Il metodo consente la localizzazione spaziale dei composti di interesse e dei loro metaboliti previsti all'interno di tessuti specifici e intatti.

Indagine sul metabolismo degli xenobiotici nelle foglie di Alba Salix tramite imaging della spettrometria di massa

Viene presentato un protocollo per studiare il tessuto biologico ad alta risoluzione spaziale utilizzando la microscopia a risonanza magnetica ad altissimo campo (MRM) utilizzando micrococchi. Vengono fornite istruzioni dettagliate per caratterizzare i microcoil. Infine, l'ottimizzazione dell'imaging è dimostrata sulle radici delle piante.

Calibrazione e utilizzo delle prestazioni del microcoil MRM dimostrato sulle radici della trogola Medicago a 22 T

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire una guida dettagliata sulla preparazione del campione quando si pianificano esperimenti utilizzando MALDI MSI per massimizzare il rilevamento metabolico e molecolare in campioni biologici.

Preparazione del campione per la profilazione metabolica utilizzando la spettrometria di massa MALDI

In questo studio, viene presentata una serie di metodi per preparare campioni DESI-MSI dagli impianti e viene descritta in dettaglio una procedura di installazione dell'assemblaggio DESI, acquisizione dei dati MSI ed elaborazione. Questo protocollo può essere applicato in diverse condizioni per l'acquisizione di informazioni sul metaboloma spaziale nelle piante.

Visualizzazione dei metaboliti identificati nel metaboloma spaziale della medicina tradizionale cinese utilizzando DESI-MSI

Questo protocollo mirava a descrivere una guida dettagliata sulla preparazione di sezioni di campioni di semi duri a basso contenuto d'acqua per l'analisi MALDI-IMS, mantenendo la distribuzione e l'abbondanza originali degli analiti e fornendo un segnale di alta qualità e una risoluzione spaziale.

Preparazione di semi di palma dura per l'analisi di spettrometria di massa con desorbimento/ionizzazione-imaging laser assistita da matrice

È stato sviluppato un metodo avanzato per l'imaging con spettrometria di massa (MSI) di organoidi cerebrali che consente di mappare le distribuzioni dei metaboliti all'interno di questi modelli. Questa tecnologia offre informazioni sulle vie metaboliche cerebrali e sulle firme dei metaboliti durante lo sviluppo precoce e nella malattia, promettendo una comprensione più profonda della funzione cerebrale umana.

Imaging molecolare di organoidi cerebrali umani mediante spettrometria di massa 

Si dimostra come le piante radice pelosa compositi possono essere utilizzati per studiare le interazioni pianta-Rhizobium e nodulazione nelle difficili da trasformare la...

Generazione di piante Composite in Medicago truncatula Per saggi nodulazione

Scopri l'imaging spettrometrico MALDI per analizzare metaboliti endogeni nei noduli radicali di Medicago truncatula. Questo metodo consente di mappare la distribuzione spaziale delle molecole biologiche in vivo.

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