Indagare interazioni proteina-proteina in cellule vive utilizzando il trasferimento bioluminescenza Resonance Energy
26 maggio 2014
Le interazioni tra le proteine sono fondamentali per tutti i processi cellulari. Uso bioluminescenza Resonance Energy Transfer, l'interazione fra una coppia di proteine può essere monitorata in cellule vive e in tempo reale. Inoltre, gli effetti delle mutazioni potenzialmente patogeni possono essere valutati.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di osservare l'interazione tra due proteine e cellule vive in coltura. Ciò si ottiene subclonando i CDNA per le due proteine di interesse in plasmidi contenenti la sequenza di rivestimento per la luciferasi o proteina fluorescente gialla, abbreviata YFP per creare vettori per l'espressione di proteine in cellule di mammifero. In una seconda fase, i plasmidi vengono trasfettati in cellule in coltura, il che porta all'espressione delle proteine di fusione YFP e della luciferasi.
Successivamente, il substrato della luciferasi viene aggiunto alle cellule per avviare l'emissione di luce dalla luciferasi. Si ottengono risultati che mostrano l'interazione tra le due proteine di fusione sulla base del trasferimento di energia dalla luciferasi a YFP. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la precipitazione del conifere, è che consente di osservare le interazioni proteina-proteina nelle cellule vive.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della genomica funzionale, determinando se una mutazione trovata in un paziente influisce sulle interazioni proteina-proteina. A dimostrare il primo passo della procedura sarà RAB tric, uno studente di dottorato del mio laboratorio per iniziare a creare i plasmidi come descritto nel protocollo del testo. Stimare la concentrazione di essi in base all'assorbanza a 260 nanometri.
Determina la massa molecolare di ciascun plasmide moltiplicando il numero di coppie di basi per 650.Daltons. Utilizzare la concentrazione e la massa molecolare per calcolare la concentrazione molare di ciascun preparato plasmidico. Diluire i preparati di DNA plasmidico a una concentrazione di 36 nano molare.
Questi saranno i materiali di lavoro che verranno utilizzati per preparare le miscele di DNA. Per la trasfezione. L'aspetto più difficile di questa procedura è l'impostazione delle miscele di DNA Per garantire il successo, creiamo fogli di calcolo per precalcolare la quantità corretta di ciascun componente e prestiamo molta attenzione.
Nella configurazione dei mix DN. Preparare la prima miscela di DNA di controllo contenente 1800 nanogrammi di plasmide di riempimento in un volume finale di 20 microlitri di acqua. Quindi impostare una seconda miscela di DNA controllata preparando cinque microlitri del costrutto di controllo dell'aspetto P.
Aggiungi il plasmide di riempimento per portare la massa totale del DNA a 1800 nanogrammi. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri. Preparare una terza miscela di DNA di controllo contenente cinque microlitri di costrutto di controllo dell'aspetto P e cinque microlitri di costrutto di controllo PYFP.
Aggiungere il plasmide di riempimento e l'acqua come prima. Infine, impostare una quarta miscela di DNA di controllo contenente cinque microlitri del costrutto di controllo positivo. Anche in questo caso, aggiungere il riempitivo, il plasmide e l'acqua allo stesso modo.
Successivamente, preparare miscele 3D NA per testare l'omodimerizzazione di una proteina di interesse x. Per ogni miscela di DNA, combinare cinque microlitri del costrutto di aspetto P pertinente e cinque microlitri del costrutto PYFP, aggiungendo plasmide di riempimento e acqua. Per ogni miscela di DNA, combinare cinque microlitri del costrutto di aspetto P pertinente e cinque microlitri del costrutto PYFP insieme al plasmide di riempimento e raccogliere l'acqua sub confluente hec 2 9 3 cellule da un pallone di 75 centimetri quadrati diluire il 10% delle cellule totali in 13 millilitri di terreno di coltura.
Quindi erogare 130 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale bianca a fondo chiaro a 96 pozzetti prima di coltivare le cellule per 24 ore. Successivamente, calcola il numero di pozzetti da trasfettare moltiplicando per tre il numero di miscele di DNA. Preparare una miscela master contenente 6,3 microlitri di terreno privo di siero a temperatura ambiente e 0,18 microlitri di reagente di trasfezione per pozzetto miscelato mediante vortex prima di incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.
Quindi erogare 20 microlitri di miscela master di reagenti di trasfezione media priva di siero nel numero richiesto di provette. Aggiungere due microlitri della miscela di DNA corrispondente in ciascuna provetta, incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Infine, trasfettare tre pozzetti con ogni miscela di trasfezione.
Erogazione di 6,5 microlitri di miscela di trasfezione per pozzetto prima di coltivare le cellule per ulteriori 36-48 ore. Per misurare il segnale BRET. Per prima cosa sciogliere il substrato di luciferasi su cellule vive a 34 milligrammi per millilitro in DMSO mediante vortex.
Diluire il substrato di luciferasi a cellule vive ricostituite da uno a 1000 in mezzo di diluizione del substrato preriscaldare 37 gradi Celsius. Lasciare mescolare 50 microlitri di terreno di diluizione del substrato per vortice di pozzetti. Può formarsi un precipitato, ma non interferisce con il saggio.
Aspirare il terreno di coltura dalla piastra a 96 pozzetti, erogare 50 microlitri di substrato di luciferasi di cellule vive diluite in ciascun pozzetto dopo aver coltivato le cellule per almeno due ore. Rimuovere il coperchio dalla piastra a 96 pozzetti e incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente all'interno del luminometro. Misurare l'emissione da LUCIFERASE e YFP un pozzetto alla volta secondo i dettagli nel protocollo di testo, integrare i segnali di emissione in 10 secondi.
I membri della famiglia dei repressori trascrizionali Fox P svolgono un ruolo nello sviluppo del cervello. Le mutazioni sono state implicate nei disturbi del linguaggio e dello spettro autistico. FOX P two è noto per formare omodimeri per convalidare il test di Brett per la rilevazione di Fox.
Le cellule P due degli Omodimeri sono state trasfettate con costrutti per l'espressione della luciferasi come donatore o YFP come accettore fuso con Fox P due o con un segnale di localizzazione nucleare. Le proteine LUCIFERASI e YFP a bersaglio nucleare fungono da controlli negativi come controllo positivo per la rilevazione di un Brett. Le cellule segnale sono state anche trasfettate con un costrutto per l'espressione di una proteina di fusione YFP della luciferasi.
L'aumento del segnale BRET mostra che il test Bret è efficace nel rilevare Fox P: qui sono mostrate due immagini al microscopio a fluorescenza di omodimeri di cellule trasfettate con YFP fuse a un segnale di localizzazione nucleare, o con YFP fuso a FOX P. La specificità dell'interazione è stata dimostrata introducendo una mutazione in FOX P 2, che è nota per interrompere la dimerizzazione. Quando la luciferasi Fox P, due delta, E 400 e YFP Fox B due proteine di fusione sono state co-espresse.
È stata osservata una riduzione del segnale respiratorio rispetto a quando Fox B two e YFP Fox B two erano co-espressi. Questa riduzione del segnale non era dovuta a un'alterazione della localizzazione subcellulare della proteina mutante per valutare l'efficacia del test di Bret nel rilevare le interazioni tipiche, è stata testata l'interazione di Fox P 2 con Fox P 1, è stato osservato un segnale di Brett in entrambe le possibili configurazioni del saggio. Inoltre, l'idoneità del test di Brett o la rilevazione dell'interazione di Fox P 2 con proteine P non FOX è stata testata esaminando l'interazione con CT BP one, un co-repressore trascrizionale e noto partner di interazione Fox P 2.
L'interazione Fox P due CT BP 1 è stata rilevata dal test di Brett quando Fox P 2 era la proteina di fusione donatrice e CT P 1 era l'accettore, ma non nella configurazione inversa. L'interazione tra FOX P 2 e CT P 1 è stata osservata anche se solo una piccola percentuale di CT BP 1 è stata localizzata al nucleo, evidenziando la sensibilità di questo test. Infine, il saggio Bret è stato impiegato per esaminare gli effetti delle mutazioni patogene in Fox P 2 sulle interazioni proteina-proteina.
Due mutazioni puntiformi in Fox P 2 sono state riportate per causare una rara malattia autosomica dominante che colpisce la parola e il linguaggio. La capacità delle proteine mutanti di dimerizzare con la volpe wild type P 2 è stata valutata utilizzando il test BRET. La mutazione R 3 28 X, ma non la mutazione R 5 53 H, interrompe la dimerizzazione dei risultati utilizzando Fox B 2 wild type come donatore e Fox B 2 mutante.
Come mostrato l'accettore, gli stessi risultati sono stati osservati per la configurazione inversa. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare il test del pane per monitorare le interazioni proteina-proteina. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare le interazioni proteina-proteina nelle cellule vive.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori tecniche per saggiare l'attività della proteina di interesse al fine di valutare le conseguenze funzionali di un'interazione proteina-proteina osservata.
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Panoramica
Questo studio si concentra sull'osservazione dell'interazione tra due proteine in cellule vive in coltura mediante il trasferimento di energia per risonanza a bioluminescenza (BRET). La tecnica consente il monitoraggio in tempo reale delle interazioni proteiche e la valutazione degli effetti di mutazioni patogenetiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia Cellulare
- Interazioni Proteiche
- Microscopia in Vita
Sfondo
- Le interazioni proteiche sono fondamentali per i processi cellulari.
- I metodi tradizionali per lo studio di queste interazioni presentano delle limitazioni.
- La BRET fornisce un approccio innovativo per osservare le interazioni in tempo reale.
- Questa tecnica può inoltre aiutare a valutare l'impatto delle mutazioni sulla funzione delle proteine.
Scopo dello studio
- Osservare l'interazione tra due proteine specifiche.
- Utilizzare la BRET per il monitoraggio in tempo reale in cellule vive.
- Valutare gli effetti di mutazioni potenzialmente patogene su queste interazioni.
Metodi Utilizzati
- Subclonaggio di cDNA per le proteine in plasmidi.
- Trasfezione di plasmidi in cellule mammifere coltivate.
- Espressione di proteine fuse YFP e luciferasi.
- Aggiunta del substrato della luciferasi per avviare l'emissione di luce.
Risultati principali
- Espressione riuscita di proteine fuse YFP e luciferasi in cellule vive.
- Osservazione del trasferimento di energia indicativo di interazioni proteina-proteina.
- Dimostrazione dei vantaggi del BRET rispetto ai metodi tradizionali.
- Informazioni sugli effetti delle mutazioni sulle interazioni proteiche.
Conclusioni
- Il BRET è un metodo efficace per lo studio delle interazioni proteiche in cellule vive.
- Questa tecnica può fornire informazioni preziose sulla dinamica delle interazioni proteiche.
- Presenta potenziali applicazioni nella comprensione dell'impatto delle mutazioni sui processi cellulari.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il trasferimento di energia per risonanza di bioluminescenza (BRET) consente il monitoraggio in tempo reale e quantitativo delle interazioni proteina-proteina in cellule vive, fornendo una lettura sensibile e fisiologicamente rilevante per la validazione degli obiettivi. Questo approccio supporta la fase iniziale della scoperta confermando interazioni deboli, transitorie o dipendenti dall'ambiente che potrebbero sfuggire ai saggi endpoint, migliorando così la previsione delle ipotesi terapeutiche. Rilevando le alterazioni delle interazioni causate da mutazioni patogenetiche, il BRET contribuisce alla riduzione del rischio meccanicistico e orienta le decisioni di avanzamento o abbandono nella selezione preclinica degli obiettivi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Conferma interazioni proteina-proteina putative identificate mediante lievito a due ibridi o spettrometria di massa in un contesto cellulare vivente.
- Valore scientifico: Rileva interazioni deboli o transitorie che sono sensibili all'ambiente biochimico nativo, aumentando la fiducia sul bersaglio.
- Valore operativo: Richiede un tempo minimo di manipolazione manuale e pochi reagenti, consentendo l'analisi ad alto rendimento di reti di interazione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera rapporti BRET quantitativi che riflettono l'intensità e la vicinanza dell'interazione, supportando la standardizzazione del saggio.
- Valore operativo: Compatibile con formati a piastre a 96 pozzetti e letture al luminometro, facilitando la scalabilità per lo screening di composti o mutanti.
- Valore operativo: Consente la valutazione cinetica della dinamica delle interazioni nel tempo, permettendo formati di screening risolti temporalmente.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Valuta l'impatto delle mutazioni derivate dal paziente sulle interazioni proteiche, collegando i risultati genetici a conseguenze funzionali.
- Valore scientifico: Mappa i domini di interazione e valuta gli effetti delle modifiche post-traduzionali, supportando l'analisi struttura-funzione.
- Valore operativo: Utilizza lo stesso sistema in cellule vive in tutte le fasi, dalla scoperta a quella preclinica, garantendo continuità traslazionale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il BRET si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla valutazione dell'interazione con il bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, in cui i dati sull'interazione guidano la priorizzazione e gli approfondimenti meccanicistici.
- Biologia della scoperta: Verifica ipotesi terapeutiche confermando se le proteine di interesse interagiscono in cellule vive, riducendo i falsi positivi derivanti da sistemi artificiali.
- Screening: Produce letture quantitative e riproducibili che permettono il confronto tra proteine wild-type e mutanti o tra gli effetti di composti sulla forza dell'interazione.
- Analisi: Emette segnali distinti da donatore e accettore che possono essere rapportati tra loro per normalizzare la variabilità di espressione, migliorando l'affidabilità dei dati.
- Ricerca traslazionale: Valuta se le mutazioni associate a malattie alterano interazioni chiave, fornendo una validazione funzionale per i bersagli genetici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening di interazioni su più bersagli, riducendo lo sforzo di sviluppo ripetuto dei saggi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva rilevando interazioni in un ambiente cellulare vivente fisiologicamente rilevante.
- Valore operativo: Standardizza la misurazione delle interazioni mediante l'aggiunta costante di substrato e l'integrazione con il luminometro, riducendo la variabilità tra pozzetti.
- Valore strategico: Supporta decisioni precoci di prosecuzione o interruzione confermando o confutando ipotesi di interazione prima di investimenti significativi.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi dei bersagli in base alla robustezza dell'interazione e alla sensibilità alle mutazioni.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze di clonaggio molecolare per generare costrutti di fusione con luciferasi e YFP.
- Dipende dall'accesso a un luminometro per la misurazione sequenziale dell'emissione del donatore e dell'accettore.
- Necessita dell'ottimizzazione dei rapporti di espressione per evitare la saturazione del donatore o dell'accettore, che potrebbe alterare i segnali BRET.
- Richiede controlli per il trasferimento di energia non specifico, inclusi coppie di fusione non interagenti e mutanti della localizzazione subcellulare.
- Limitato dalla necessità di una vicinanza ravvicinata (<10 nm) tra donatore e accettore, condizione che potrebbe non rilevare tutte le interazioni biologicamente rilevanti.
