Name: Una semplice e rapida il protocollo per la misurazione lipidi neutri in cellule algali Uso fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Impara a misurare i lipidi neutri nelle cellule algali con la colorazione al Nile Red. Questo metodo fluorimetrico rapido consente di monitorare efficacemente le prestazioni dei bioprocessi in tempo reale.

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Gli autori desiderano ringraziare le scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada per la fornitura di un sostegno finanziario per questo progetto.

1. Isolamento di lavaggio a biomassa algale per essere utilizzato come standard per la fluorescenza Letture <ol><li> Rimuovere un volume di campione dalla crescente coltura algale che fornirà almeno 200 mg di biomassa secca, 400-600 mg è preferibile. </li><li> Centrifugare campione a 4 ° C per 10 min a 10000 x g. Eliminare il supernatante e lavare il pellet con un volume uguale di tampone fosfato formulato per lo stesso pH come i mezzi di crescita. </li><li> Ripetere passo 1.2 per un totale di 3 fasi di lavaggio. </li><li> Risospendere il pellet in acqua deionizzata e trasferire ad un piatto pre-tarato pesare. Lasciare asciugare a 50 ° C per 48 ore. NOTA: Essiccazione sotto vuoto si riduce il tempo di asciugatura ed essiccazione della cultura a temperature superiori a 50 ° C può rendere difficile la risospensione. </li><li> Conservare secca colture algali a temperatura ambiente per un utilizzo futuro. </li></ol> 2. Quantificazione gravimetrico di lipidi neutri da esano estrazione (Adattato da Bligh e Dyer 4) <ol><li> Misura circa 50 mg di alghe secca biomassa in un piatto di pesatura. NOTA: Le masse che vanno 40-80 mg possono essere utilizzati senza perdita di riproducibilità. </li><li> Trasferire la biomassa di una malta pre-lavato con esano. Se necessario, lavare il piatto pesare con una piccola quantità (1 ml) di esano con una pipetta Pasteur per trasferire completamente i biomassa alla malta. NOTA: esano è una sostanza altamente volatile e tossico. Si deve essere gestita in cappa con abbigliamento protettivo adeguato. </li><li> Macinare la biomassa algale per 5 minuti utilizzando un pestello. Inizia con macinazione dolce e aumentare gradualmente l&#39;intensità. Macinare la biomassa in una pasta fine e liscia nel periodo di 5 min. Se eccesso esano viene utilizzato quando si trasferisce la biomassa alla malta, è meglio attendere la esano evapori prima della macinazione. </li><li> Aggiungere alcuni ml di esano al mortaio e mescolare l&#39;impasto risultante con il pestello finché non viene omogeneizzato. Assicurarsi che tutti i detriti cellulari aderito alle pareti della mortar sono bussò libero e sospeso nel liquido. </li><li> Trasferire la miscela esano-massa cellulare in una provetta da centrifuga. NOTA: Il tubo da centrifuga deve essere di vetro o un polimero adatto compatibile con esano come il Teflon. </li><li> Ripetere le fasi 2.4 e 2.5 finché tutta la biomassa è stata trasferita al tubo da centrifuga (3-5x). </li><li> Centrifugare il campione a 4 ° C per 20 min a 10.000 x g. </li><li> Pipetta con attenzione il surnatante in un metallo pre-tarato pesare piatto. Conservare nella cappa. </li><li> Eseguire un&#39;estrazione 2 nd esano aggiungendo 3 ml di esano al pellet e vortex vigorosamente per 1 min. </li><li> Ripetere i punti 2.7 e 2.8. Se necessario, eseguire gli esempi per 30 minuti nella centrifuga durante la seconda estrazione per garantire che tutti i detriti cellulari deposita completamente. Determinare la massa di petrolio estratto gravimetrica dopo esano è completamente evaporata. </li></ol> 3. Fluorimetrica Quantificazione dei lipidi neutri Utilizzo Nile Red (come Reported da de la Hoz Siegler et al. 11) NOTA: Soltanto 10 ml di una sospensione algale a 5 g / L è necessario per la lettura della fluorescenza. Generalmente, l&#39;isolamento di biomassa algale secco da 1,5 ml di brodo di coltura è più che sufficiente. Inoltre, l&#39;intensità luminosa della lampada allo spettrofotometro può degradare nel tempo. Si raccomanda di includere standard in ogni esperimento per garantire che le variazioni dello strumento non aggiungono errore inutili alle misurazioni. <ol><li> Preparare una soluzione Nilo rosso ad una concentrazione di 10 ug / ml disciolti in etanolo di grado reagente alcol. Conservare questa soluzione al buio a 4 ° C. </li><li> Preparare un 30% (v / v) di etanolo in acqua deionizzata e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare tutti i campioni algali alla stessa concentrazione di biomassa (si consiglia 5 g / L) e nello stesso modo dei campioni utilizzati nella misurazione. Per fare ciò, sia la sospensione dei campioni pre-essiccati in quantità appropriatadi tampone fosfato (0,6 g / l di potassio fosfato dibasico, 1,4 g / L di potassio fosfato monobasico), o regolando la concentrazione di una coltura algale crescente a 5 g / L di tampone fosfato dopo la misurazione della torbidità. NOTA: misure effettuate su colture algali vivi spesso hanno grande errore associato con loro a seconda della precisione della curva di calibrazione torbidità. Risospendere campioni essiccati può richiedere l&#39;uso di un omogeneizzatore per disperdere completamente la biomassa. </li><li> Per ciascun campione, mescolare 80 ml di soluzione di etanolo al 30%, 10 ml di soluzione di rosso Nilo, e 10 ml di sospensione algale in un singolo pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. Per rendere adeguatamente conto della variabilità della misurazione di fluorescenza, eseguire 5 repliche di ciascun campione. </li><li> Eseguire una curva di calibrazione a due punti con le norme preparate in precedenza, al fine di tener conto giorno per giorno le variazioni dello strumento e preparazione. Preparare gli standard per la misurazione della fluorescenza con il sProcedura ame come i campioni. NOTA: Generalmente due punti è sufficiente per la ricalibrazione dello strumento, tre punti possono essere eseguiti per verificare la linearità. </li><li> Eseguire le misure di fluorescenza in un multi-lettore di piastra ben spettrofotometro. Sono stati trovati i seguenti condizioni per produrre i risultati più coerenti 11: <ol><li> Agitare a 1.200 rpm, orbita 3 mm per 30 sec. </li><li> Incubare a 40 ° C per 10 min. </li><li> Agitare a 1.200 rpm, orbita 3 mm per 30 sec. </li><li> Record fluorescenza, eccitazione a 530 nm, emissione a 604 nm. </li></ol></li><li> Convertire le misure di fluorescenza al contenuto di olio utilizzando i risultati degli standard interni. </li></ol> 4. Tecnica di microscopia a fluorescenza NOTA: Il protocollo di colorazione descritto nella sezione 3 è progettato per l&#39;analisi quantitativa, ma può anche essere utile per fornire rappresentazioni visive di tecniche basate macchie scopo didattico e illustrativo purposes. Per produrre immagini di fluorescenza del campione si richiede un microscopio ottico con fonti di trasmissione e aggiuntivi di illuminazione epifluorescenza tradizionali. Eccitazione e di emissione luce filtra nell&#39;intervallo 530 nm (verde) e 604 nm (rosso), rispettivamente, sono necessari per la macchia rossa Nilo così come una telecamera montata microscopio con software associato. Le immagini mostrate in questo studio (Figura 1) sono state acquisite utilizzando un microscopio a campo chiaro dotato di una fotocamera e monocromatica di RGB convertitore di unità. La procedura per la produzione di immagini di fluorescenza Nile Red utilizzo di questi strumenti è descritto di seguito: <ol><li> Preparare un campione di cultura con la macchia Nile Red secondo la sezione 3 del protocollo. NOTA: un campione nella gamma di concentrazione di 5 g / L produce diapositive di un&#39;adeguata densità cellulare, senza sovraffollamento. </li><li> Dopo aver completato il punto 3.6 del protocollo di colorazione, preparare un vetrino da microscopio del campione processato secondo le procedure standard di laboratorio. </li><li> Partendo con il microscopio in modalità di trasmissione, caricare la slitta preparata nel microscopio, e individuare le cellule a l&#39;ingrandimento desiderato (immagini mostrate in questo articolo sono state acquisite con l&#39;obiettivo 100X). </li><li> Una volta messo a fuoco, spegnere il microscopio dalla trasmissione alla modalità di illuminazione epifluorescenza. La sorgente di luce deve ora essere provenienti direttamente dalla lente obiettivo (questo può essere confermata visivamente osservando lo spazio tra la slitta e la lente obiettivo). </li><li> Inserire un filtro di eccitazione verde la fonte di luce e un filtro per le emissioni rosso nel percorso ottico di osservazione; La fluorescenza delle cellule colorate dovrebbe essere direttamente visibile attraverso l&#39;oculare. </li><li> Cambiare la modalità di osservazione al microscopio dall&#39;oculare alla telecamera montata e utilizzare software di visualizzazione per catturare un&#39;immagine delle cellule fluorescenti. A seconda della sensibilità della telecamera, il campione non si può visualizzare inizialmente nella finestra di anteprima (cioè lo schermo siessere nero); per ovviare a questo, regolare il tempo di esposizione e il guadagno della telecamera ad un livello in cui le cellule sono visibili. Impostazioni specifiche varieranno con strumenti, attrezzature e tipi di cellule. </li></ol>

<ol><li>Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+from+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Biodiesel from microalgae.</a> Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).</li>
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<li>Elsey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+microalgal+neutral+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids.</a> J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).</li>
<li>Feng, G. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+FT-IR+and+Nile+Red+methods+for+microalgal+lipid+characterization+and+biomass+composition+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination.</a> Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).</li>
<li>Guzmán, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimate+by+means+of+flow+cytometry+of+variation+in+composition+of+fatty+acids+from+Tetraselmis+suecica+in+response+to+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Aquacult.+Int%22%5BJournal%5D)">Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions.</a> Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).</li>
<li>Huang, G. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+method+for+lipid+production+in+alga+based+on+Nile+red+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomass+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence.</a> Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+the+determination+of+lipid+from+the+green+alga+Botryococcus+braunii%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii.</a> Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).</li>
<li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-lipid+content+strains+of+the+marine+microalga+Tetraselmis+suecica+for+biodiesel+production+by+flow+cytometry+and+single-cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting.</a> J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).</li>
<li>Vigeolas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+partial+characterization+of+mutants+with+elevated+lipid+content+in+Chlorella+sorokiniana+and+Scenedesmus+obliquus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus.</a> J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).</li>
<li>Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertozzini%2C+E+%22J.+Microbiol.+Meth%22">J. Microbiol. Meth</a>. 87, 17-23 (2011).</li>
<li>Kou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+lipid+content+in+the+model+organism+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii.</a> J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Le alghe utilizzate nella curva standard deve essere la stessa specie coltivate nelle stesse condizioni sperimentali come quelle oggetto di valutazione. Cambiamenti significativi nella composizione media, tecnica di coltivazione, e il protocollo di colorazione possono influenzare l&#39;intensità della lettura della fluorescenza. Estrazione con esano (descritte ai punti 1 e 2) è stata utilizzata per determinare il contenuto di lipidi neutri di campioni utilizzati nella curva standard. Per misure di intensità di fluoresce...

Grazie alla loro capacità di immagazzinare corpi lipidici in determinate condizioni di stress, alghe hanno ricevuto molta attenzione negli ultimi anni come potenziale fonte di combustibile rinnovabile 1,2. Lipidi neutri possono rappresentare oltre il 60% del peso secco cella sotto opportune condizioni di crescita 3. Ma l&#39;industria non ha un protocollo standardizzato semplice, pulito, veloce e affidabile per quantificare il contenuto lipidico delle cellule algali al fine di monitorare adeguatamente le prestazioni bioprocess, analizzare le culture, e lo schermo per nuovi ceppi. Il metodo gravimetrico Bligh-Dyer ha sviluppato circa 50 anni fa, rimane tra le tecniche più comuni utilizzate oggi 4,5. Mentre questo procedimento è semplice, affidabile, e facile da realizzare, che richiede tempo, richiede grandi volumi di campione, e fa uso di solventi tossici. Non è pratico per analizzare molti campioni da una corsa di fermentazione o di screening per nuovi ceppi ricchi di petrolio. Altri metodi hanno bEEN sviluppato, ma di solito richiedono attrezzature avanzate e non sono stati standardizzati 6. Un&#39;alternativa che ha raccolto un grande interesse è la macchia Nile Red. Nilo Red, un colorante che reagisce preferenzialmente in ambienti non polari, è stato usato per identificare o quantificare corpi lipidici in vari organismi tra nematodi 7, lievito 8, 9, batteri e alghe 10-19. Tecniche iniziali coinvolgono Nile Red erano per lo più qualitativa o semi-quantitativa, che unisce la macchia con una sola cuvetta spettrofotometria o citometria a flusso. Inoltre, alcune classi di alghe come alghe verdi hanno pozzi cellulari spesse che sono per lo più impermeabile al colorante, che limita la gamma della tecnica 10. Recenti miglioramenti al metodo di colorazione rosso Nilo sono stati segnalati che bypassare le carenze iniziali del protocollo 10,11. Colorazione delle cellule in presenza di un carrier solvente come DMSO 10 o etanolo 10,11 linearizza il rapporto tra contenuto di olio e l&#39;assorbanza, consentendo misurazioni quantitative affidabili. Il solvente aiuta permeabilize membrana cellulare in modo che le molecole Nilo rossi possono passare attraverso. Inoltre, incorporando uno spettrofotometro con capacità di lettura micro-piastra consente protocolli di throughput elevate adatte per l&#39;analisi quantitativa. In questo articolo abbiamo dettaglio un metodo semplice per misurare il contenuto di olio di cellule algali mediante colorazione culture con Nile Red in presenza di etanolo, un solvente delicato. Per più esattamente conto di rumore di fondo nelle misure, una curva standard correlazione intensità di fluorescenza al contenuto di olio è stato sviluppato utilizzando cellule algali di nota composizione di olio. Il metodo è adattato da protocolli precedentemente pubblicati 10,11. Utilizzando uno spettrofotometro a 96 pozzetti, si è in grado di analizzare la stessa quantità di campioni in un tha un&#39;orat avrebbe preso giorni di tempo per monitorare con metodi gravimetrici. Inoltre, calibrando utilizzando campioni rappresentativi della specie algale desiderato questo metodo produce misurazioni relativamente precise che sono direttamente interpretabili. Esistono molti protocolli che descrivono i metodi di colorazione alghe con Nile Red ottimizzato per i ceppi e le diverse applicazioni; il protocollo qui presentato è stato originariamente sviluppato da de la Hoz Siegler et al. 11 per protothecoides Auxenochlorella, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, e Scenedesmus obliquo, anche se è probabile adatto a molte più specie e classi. E &#39;stato progettato con l&#39;applicazione specifica di monitoraggio delle prestazioni bioprocessi e funziona altrettanto bene per i campioni precedentemente essiccati e campioni bagnato da una cultura in crescita.

<table><tbody><tr><td>Peso</td><td></td><td></td><td></td>secco</tr><tr><td>Pipette monouso da 25 ml</td><td>Fisher</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta a bulbo</td><td>Fisher</td><td>13-681-51</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga in teflon Nalgene da 40 ml</td><td>Fisher</td><td>05-562-16A</td><td>Teflon necessario per piatti di pesatura in esano</td></tr><tr><td>(polipropilene)</td><td>Microcentrifuga Fisher</td><td>2-202B</td><td></td></tr><tr><td>da 1,5 ml provette</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Sorvall</td><td>RC6plus</td><td></td></tr><tr><td>Forno di essiccazione (Fisher 625D)</td><td>Fisher</td><td>13-254-2</td><td></td></tr><tr><td>Fiale di conservazione</td><td>Fisher</td><td>0337-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga da banco (Eppendorf 5415D)</td><td>Fisher</td><td>05-40-100</td><td></td></tr><tr><td>Quantificazione gravimetrica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mortaio in porcellana (Coorstek)</td><td>Fisher</td><td>12-961A</td><td></td></tr><tr><td>Pestello in porcellana (Coorstek)</td><td>Fisher</td><td>12-961-5A</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifugazione da 40 ml (FEP)</td><td>Fisher</td><td>05-562-16A</td><td>Potrebbe anche usare tubi di vetro</td></tr><tr><td>Pipette in vetro Pasteur</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Piatti di pesatura in alluminio</td><td>Fisher</td><td>08-732-101</td><td></td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher</td><td>H292-4</td><td></td></tr><tr><td>Quantificazione fluorimetrica del contenuto</td><td></td><td></td><td></td>di olio</tr><tr><td>Lettore di piastre multipozzetto a fluorescenza</td><td>Thermo Lab Systems</td><td>Fluoroskan Ascent</td><td></td></tr><tr><td>Software per lettore di fluorescenza</td><td>Thermo Lab Systems</td><td>Ascent Software 2.6</td><td></td></tr><tr><td>COSTAR Piastra a 96 pozzetti con fondo tondo</td><td>Fisher</td><td>06-443-2</td><td></td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>Sigma</td><td>N3013-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (grado di reagente alcolico)</td><td>Fisher</td><td>AC65109-0020</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Cellule</td><td></td><td></td><td></td>fluorescenti</tr><tr><td>Microscopio Leica DMRXA2 (o equivalente)</td><td></td> Leica <td>DMRXA2</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini copri monitor</td><td>Fisher</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>Qimaging</td><td>Retiga Ex</td><td></td></tr><tr><td>Software di imaging</td><td>Qimaging</td><td>QCapture v.1.1.8</td><td></td></tr></tbody></table>

una semplice e rapida il protocollo per la misurazione lipidi neutri in cellule algali uso fluorescenza

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Le alghe sono considerati ottimi candidati per fonti di energia rinnovabili a causa della loro capacità di stoccaggio dei lipidi naturali. Un efficiente monitoraggio dei processi di fermentazione algali e screening per nuovi ceppi ricchi di petrolio richiede un protocollo veloce e affidabile per la determinazione del contenuto lipidico intracellulare. Pratiche attuali si basano in gran parte su metodi gravimetrici per determinare il contenuto di olio, tecniche sviluppati decenni fa che richiedono molto tempo e richiedono grandi volumi di campione. In questo lavoro, Nilo rosso, un colorante fluorescente che è stato utilizzato per identificare la presenza di corpi lipidici in numerosi tipi di organismi, è incorporato in un protocollo semplice, veloce, affidabile per misurare il contenuto di lipidi neutri di protothecoides Auxenochlorella, una verde alga. Il metodo utilizza etanolo, un solvente relativamente mite, per permeabilize membrana cellulare prima della colorazione e un 96 ben micropiastra per aumentare la capacità campione durante fluorescenza misure di intensità. E &#39;stato il designed con l&#39;applicazione specifica di monitoraggio delle prestazioni bioprocess. Campioni precedentemente essiccati o campioni dal vivo da una coltura in crescita possono essere utilizzati nel saggio.

Cellule algali Rappresentante colorate con Nile Red colorante sono rappresentati in Figura 1. Parti A e B della figura 1 mostra immagini di A. protothecoides coltivate in eccesso di azoto, portando a molto basso accumulo di lipidi intracellulari. In parti C e D, i campioni di A. protothecoides coltivate sotto limitazione di azoto vengono visualizzati. Sotto illuminazione trasmissione, i corpi lipidici ...

Un semplice protocollo per determinare il contenuto di lipidi neutri di cellule algali utilizzando una procedura di colorazione rosso Nilo è descritto. Questa tecnica consente di risparmiare tempo offre un&#39;alternativa ai protocolli di quantificazione lipidi basato gravimetrici tradizionali. E &#39;stato progettato per la specifica applicazione di monitoraggio delle prestazioni bioprocess.

Una semplice e rapida il protocollo per la misurazione lipidi neutri in cellule algali Uso fluorescenza

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare il contenuto di lipidi neutri nelle cellule algali utilizzando il colorante fluorescente rosso nile. Questo viene ottenuto sospedendo innanzitutto le cellule in una soluzione di etanolo per rendere permeabili la parete cellulare e la membrana cellulare. In un secondo passaggio viene aggiunto il colorante fluorescente rosso nile, che penetra nelle cellule e si accumula nelle regioni apolari della cellula, compresi i corpi lipidici neutri.Successivamente, i campioni vengono esposti a una sorgente luminosa di eccitazione da 530 nanometri, inducendo il rosso Nilo assorbito nei corpi lipidici neutri a emettere fluorescenza a 604 nanometri. I risultati vengono ottenuti su larga scala eseguendo i singoli test in una piastra multi pozzetti e utilizzando uno spettrofotometro per produrre letture rapide della fluorescenza. Le letture mostrano una relazione lineare tra il contenuto di lipidi neutri nelle cellule algali e l'intensità della misurazione della fluorescenza.La conversione delle misurazioni della fluorescenza in contenuto di olio può essere ottenuta mediante una curva di calibrazione preparata con cellule di composizione lipi

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Introduciamo un digiuno a base di test a fluorescenza che controlla il tasso di estinzione di fluorescenza come una misura di attività del canale gramicidina. I canali gramicidina sono utilizzati come trasduttori di forza molecolare per monitorare i cambiamenti nelle proprietà del doppio strato lipidico, come rilevato da proteine ​​doppio strato spanning.

Gramicidina a base di fluorescenza di analisi, per determinare piccole molecole Potenziale Modifica delle proprietà del doppio strato lipidico

Questo video dimostra un protocollo per rilevare e quantificare i lipidi neutri nelle cellule algali colorandole con colorante rosso Nilo.

Colorazione del rosso del Nilo: una tecnica per rilevare e quantificare i lipidi neutri intracellulari nelle alghe

Procedimento per la determinazione del contenuto di acidi grassi e la composizione in microalghe basato su rottura meccanica delle cellule, estrazione dei lipidi solvente, transesterificazione, e quantificazione e identificazione di acidi grassi mediante gascromatografia è descritto. Uno standard interno tripentadecanoin viene utilizzato per compensare le eventuali perdite durante l'estrazione e transesterificazione incompleta.

Analisi di acido grasso contenuto e la composizione in microalghe

L'uso di fluorofori per l'imaging in vivo può essere notevolmente limitato dall'opsonizzazione, dalla rapida eliminazione, dalla bassa sensibilità di rilevamento e dagli effetti citotossici sull'ospite. L'incapsulamento dei fluorofori nei liposomi mediante idratazione ed estrusione del film porta al quenching e alla protezione della fluorescenza, consentendo l'imaging in vivo con un'elevata sensibilità di rilevamento.

Fluorescenza tempra di un vicino infrarosso Fluoroforo incapsulata all'interno di liposomi come strumento per In Vivo Optical Imaging

Descriviamo un test basato sulla fluorescenza per misurare lo scrambling dei fosfolipidi in grandi liposomi unilamellari ricostituiti con opsina.

Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere l'indice di gocciolina del lipido (indice di LD) per studiare la dinamica dei triacilgliceroli in cellule coltivate in esperimenti di alto-rendimento. Il dosaggio di indice di LD è un metodo facile e affidabile che utilizza BODIPY 493/503. Questo test non necessita di estrazione lipidica dispendious o analisi di microscopia.

Determinazione indice del lipido di recupero liquido di fluorescenza nel agente patogeno fungoso Ustilago Maydis

Qui, presentiamo un protocollo per costruire su scala di laboratorio bolla colonna fotobioreattori e li usa per cultura microalghe. Esso fornisce inoltre un metodo per la determinazione del tasso di crescita della cultura e del contenuto di lipidi neutri.

Coltivazione di microalghe verdi in bolla colonna fotobioreattori e un saggio di lipidi neutri

Questo protocollo descrive la fabbricazione di liposomi e come questi possono essere immobilizzati su una superficie e immagine individualmente in modo parallelo massiccio utilizzando la microscopia a fluorescenza. Ciò consente la quantificazione delle dimensioni e dell'inomogeneità compositiva tra singoli liposomi della popolazione.

Un saggio di liposoma singolo basato sulla microscopia quantitativa per rilevare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi

Qui, descriviamo protocolli che utilizzano sensori lipidici fluorescenti e liposomi per determinare se una proteina estrae e trasporta fosfatidilserina o fosfatidilinositolo 4-fosfato in vitro.

Misurazioni basate sulla fluorescenza dello scambio di fosfatidilserina / fosfatidilinositolo 4-fosfato tra le membrane

Questo protocollo presenta un metodo di imaging a fluorescenza che utilizza una classe di fluorofori lipidici sensibili al pH per monitorare il traffico della membrana lipidica durante l'esocitosi cellulare e il ciclo di endocitosi.

Misurazione del turnover lipidico di membrana con l'analogo lipidico fluorescente ND6 sensibile al pH

Il presente protocollo descrive l'imaging autofluorescenza passo-passo e la valutazione dei cambiamenti ficobiliproteici nelle alghe rosse sulla base dell'analisi spettrale. Questo è un metodo privo di etichette e non distruttivo per valutare l'adattamento cellulare ad habitat estremi, quando è disponibile solo materiale scarso e le cellule crescono lentamente, o per niente, in condizioni di laboratorio.

Autofluorescenza per valutare la fisiologia delle alghe rosse

Impara a misurare i lipidi neutri nelle cellule algali con la colorazione al Nile Red. Questo metodo fluorimetrico rapido consente di monitorare efficacemente le prestazioni dei bioprocessi in tempo reale.

Una semplice e rapida il protocollo per la misurazione lipidi neutri in cellule algali Uso fluorescenza

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