Una semplice e rapida il protocollo per la misurazione lipidi neutri in cellule algali Uso fluorescenza

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare il contenuto lipidico neutro delle cellule algali utilizzando il colorante fluorescente rosso del Nilo. Ciò si ottiene sospendendo prima le cellule in una soluzione di etanolo per permeare la parete cellulare e la membrana cellulare. In una seconda fase viene aggiunto un colorante fluorescente rosso del Nilo, che entra nelle cellule e si accumula nelle regioni non polari della cellula, compresi i corpi lipidici neutri.

Successivamente, i campioni vengono esposti a una sorgente luminosa di eccitazione di 530 nanometri, causando la fluorescenza del rosso del Nilo assorbito nei corpi lipidici neutri a 604 nanometri. I risultati sono ottenuti su scala di massa conducendo i singoli test in un micro pozzetto multiplo e utilizzando uno spettrofotometro per produrre letture rapide della fluorescenza. Le letture mostrano una relazione lineare tra il contenuto lipidico neutro delle cellule lgali e l'intensità della misurazione della fluorescenza.

La conversione delle misure di fluorescenza in contenuto di olio può essere ottenuta con una curva di calibrazione preparata con celle di composizione nota dell'olio. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai protocolli esistenti, come il metodo gravimetrico Bly dire, è che consente una rapida determinazione del contenuto lipidico neutro utilizzando materiali disponibili per la maggior parte dei laboratori. Questo metodo fornisce un feedback immediato sulle prestazioni del bioprocesso durante la coltivazione delle alghe.

Inoltre, l'elevata produttività consentita dal lettore di piastre a 96 pozzetti è ideale per studi di screening ed esperimenti fattoriali. Sebbene questa tecnica sia stata ottimizzata per la clorella e il Desus, può essere facilmente modificata per l'analisi di altre specie di galline. Ok. Per iniziare, prelevare un volume di campione dalla coltura algale in crescita che fornirà almeno 200 milligrammi di biomassa secca.

È preferibile da 400 a 600 milligrammi. Centrifugare il campione a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 10.000 volte. G, scartare il surnatante e lavare il pellet con un volume uguale di tampone fosfato formulato allo stesso pH del terreno di coltura.

Ripetere questo processo per un totale di tre fasi di lavaggio. Risospendere il pellet in acqua deionizzata e trasferirlo in un piatto di pesatura pre-pesato. Lasciare asciugare il campione a 50 gradi Celsius per 48 ore.

Le colture algali essiccate possono essere conservate a temperatura ambiente per un uso futuro. Misurare circa 50 milligrammi di biomassa secca di alghe in un piatto di siero di latte. Trasferire la biomassa in un mortaio prelavato con esano, se necessario, lavare la vaschetta del siero di latte con una piccola quantità di esano utilizzando una pipetta passata per trasferire completamente la biomassa all'ordine del mortaio.

Quindi, macina la biomassa algale per cinque minuti usando un pestello. Inizia con una macinatura delicata e aumenta gradualmente l'intensità. Macinare la biomassa fino a ottenere una pasta fine e liscia.

Durante il periodo di cinque minuti, aggiungere alcuni millilitri di esano al mortaio e mescolare l'impasto risultante con il pestello fino a quando non si omogeneizza. Assicurarsi che tutti i detriti cellulari che aderiscono alle pareti della malta vengano liberati e sospesi nel liquido. Quindi, trasferire la miscela di massa cellulare di esano in una provetta da centrifuga compatibile.

Ripetere da tre a cinque volte fino a quando tutta la biomassa è stata trasferita nella provetta da centrifuga. Centrifugare il campione a quattro gradi Celsius per 20 minuti a 10.000 volte. G.Dopo la centrifugazione, pipettare con cura il surnatante in una piastra metallica pre-pesata, che può essere conservata nella cappa aspirante.

Eseguire una seconda estrazione di esano aggiungendo tre millilitri di esano al pellet e agitando energicamente. Per un minuto, ripetere la centrifugazione e il trasferimento del surnatante. Determinare la massa di olio estratta gravimetricamente dopo che l'esano è completamente evaporato.

Per la quantificazione fluorimetrica, preparare tutti i campioni di alghe alla stessa concentrazione di biomassa e con le stesse modalità degli standard utilizzati nella misurazione. A tale scopo, i campioni pre-essiccati vengono versati nella quantità appropriata di tampone fosfato. Se necessario, utilizzare un omogeneizzatore per facilitare la sospensione in propensione delle cellule lgal essiccate.

Per ogni campione, miscelare 80 microlitri di una soluzione preparata di etanolo al 30%, 10 microlitri di una soluzione preparata di rosso del Nilo e 10 microlitri di sospensione di alghe in un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Per tenere adeguatamente conto della variabilità della misura della fluorescenza, eseguire cinque repliche di ciascun campione. Quindi, eseguire una curva di calibrazione a due punti con gli standard preparati in precedenza.

Al fine di tenere conto delle variazioni quotidiane dello strumento e della preparazione per eseguire le misure di fluorescenza in uno spettrofotometro lettore di piastre a più pozzetti, impostare i parametri per agitare a 1.200 giri/min e orbitare a tre millimetri per 30 secondi, seguito da incubazione a 40 gradi Celsius per 10 minuti. Un'altra scossa a 1.200 giri/min e orbita di tre millimetri per 30 secondi, e per registrare la fluorescenza con eccitazione a 530 nanometri ed emissione a 604 nanometri. Quindi inizia la corsa come passaggio finale.

Converti le misurazioni della fluorescenza in contenuto di olio utilizzando i risultati degli standard interni per eseguire la microscopia a fluorescenza. Utilizzare il campione preparato con la colorazione rosso del Nilo per preparare un vetrino al microscopio del campione di processo secondo le procedure standard di laboratorio. Partendo dal microscopio in modalità di trasmissione, caricare il vetrino preparato nel microscopio e posizionare le celle all'ingrandimento desiderato.

Una volta messo a fuoco, passare il microscopio dalla modalità di illuminazione a trasmissione a quella a epifluorescenza. La sorgente luminosa dovrebbe ora provenire direttamente dalla lente dell'obiettivo, il che può essere confermato visivamente osservando lo spazio tra il vetrino e la lente dell'obiettivo. Inserire un filtro di eccitazione verde nella sorgente luminosa e un filtro di emissione rosso nel percorso della luce di osservazione.

La fluorescenza delle cellule colorate dovrebbe ora essere visibile direttamente attraverso l'oculare. Cambia la modalità di osservazione del microscopio dall'oculare alla fotocamera montata e utilizza il software di visualizzazione per acquisire un'immagine delle celle fluorescenti. Le impostazioni specifiche variano a seconda degli strumenti, delle apparecchiature e dei tipi di cella.

Alle cellule algali rappresentative colorate con colorante rosso del Nilo vengono mostrate immagini di un prothe coltivato in eccesso di azoto che porta a un accumulo di lipidi intracellulari molto basso, che vengono mostrati in contrasto con i campioni di un OID coltivato con limitazione di azoto. Sotto l'illuminazione a trasmissione, i corpi lipidici delle cellule possono essere visualizzati con un'attenta ispezione dove appaiono come strutture circolari lucide e costituiscono la maggior parte del volume cellulare. Le celle mostrate qui sono solo il 5% di olio in peso secco e non contengono livelli significativi di corpi lipidici quando vengono mostrate le condizioni di luce appropriate.

Le differenze in questi campioni sono amplificate. Le cellule magre dell'olio appaiono come anelli fluorescenti con corpi scuri, mentre le cellule ricche di olio mostrano un bagliore rosso arancio brillante dove hanno accumulato corpi lipidici. Il rosso del Nilo emetterà fluorescenza a diverse lunghezze d'onda a seconda della presenza di lipidi neutri, fosfolipidi situati sulla parete cellulare e proteine cellulari non polari, motivo per cui le cellule magre dell'olio appaiono come anelli fluorescenti con corpi scuri.

Questa non specificità è anche ciò che causa il livello di fondo di fluorescenza durante le misure spettrofotometriche dei lipidi neutri nelle condizioni ottimizzate del saggio, curve di calibrazione con valori R quadrati superiori a 0,980 sono facilmente raggiungibili. La relazione tra il contenuto di olio cellulare e la fluorescenza diventa non lineare se le cellule sono colorate in una soluzione, priva di un solvente vettore come l'etanolo. I dati qui presentati hanno un R quadrato di 0,395 e sono stati ottenuti eseguendo il protocollo in una soluzione di etanolo allo 0%.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 15-20 minuti se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale assicurarsi che tutti i campioni siano preparati alla stessa concentrazione di biomassa. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare il contenuto lipidico neutro delle cellule lgal utilizzando sia i tradizionali protocolli di estrazione dell'esano che la più semplice procedura di colorazione fluorescente rossa NAL.