Isolamento dei Piccoli RNA non codificanti dal siero umano

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare RNA di alta qualità da campioni di siero. Utilizzando la nostra versione ottimizzata del comune protocollo MRC con reagente RTLS. Ciò viene ottenuto diluendo innanzitutto il siero in un rapporto uno a cinque con acqua priva di nucleasi per ridurre la contaminazione proteica.

Il secondo passaggio consiste nell'introdurre due provette con gel separatore di fase per il primo passaggio di centrifugazione. Questo trattiene la maggior parte delle sostanze contaminanti, come il fenolo e le proteine, nella fase organica. Successivamente, il terzo e ultimo passaggio di ottimizzazione è una breve centrifugazione a 12.000 ×g, che elimina qualsiasi contaminante residuo dal pellet di RNA prima dei lavaggi con etanolo.

L'ultimo passaggio consiste nell'unire due preparati di RNA modificati provenienti dallo stesso paziente se è richiesto un resa totale di RNA più elevata. Utilizzando infine questo metodo modificato, che solubilizza il siero in acqua priva di nucleasi e impiega una provetta con blocco di fase per trattenere i principali contaminanti e introduce una centrifugazione rapida, dimostriamo che è possibile massimizzare il recupero di piccole RNA non codificanti da un'isolamento di RNA da siero.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il protocollo standard di isolamento dell'RNA triol, è che attraverso semplici modifiche possiamo massimizzare il rendimento di RNA dal siero. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà perché gli RNA piccoli sono presenti in basse quantità nel siero. Il metodo ottimizzato e la visualizzazione di questi passaggi miglioreranno il recupero di questi RNA e guideranno i principianti verso un isolamento di successo.

Per iniziare, scongelare il campione di siero precedentemente preparato ponendolo sul ghiaccio, quindi trasferire 400 microlitri di siero appena scongelato in una provetta microcentrifuga etichettata. Successivamente, diluire il siero con 100 microlitri di acqua priva di RNasi e aggiungere 50 microlitri di proteinasi K a una concentrazione di un milligrammo per millilitro. Incubare quindi il siero diluito a 37 gradi Celsius per 20 minuti per consentire una digestione proteica adeguata, necessaria per garantire una completa solubilizzazione in 1,5 millilitri di tri reagente RTLS e 100 microlitri di quattro promonolo.

Invertire brevemente l'omogenato ed eseguire un pipettaggio ripetitivo per cinque secondi. Trasferire quindi la miscela in una provetta da due millilitri con blocco della fase pesante, opportunamente etichettata. Centrifugare l'omogenato a 12.000 ×g per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Successivamente, versare con attenzione un millilitro della soluzione acquosa ottenuta in una nuova provetta DNA low bind. La fase organica e l'interfaccia devono rimanere intrappolate sotto il gel bianco della provetta con blocco della fase. Quindi aggiungere cinque microlitri di glicogeno e 500 microlitri di isopropanolo al 100% alla soluzione acquosa.

Mescolare la soluzione per inversione e incubarla durante la notte a meno 20 gradi Celsius. Dopo l'incubazione notturna, centrifugare il campione per 20 minuti a 12.000 ×g in una centrifuga a quattro gradi Celsius. Successivamente, eliminare il sopranatante limpido ed eseguire una centrifugazione rapida per due minuti a 16.000 ×g in una centrifuga a quattro gradi Celsius.

Utilizzando una pipetta, rimuovere con attenzione la soluzione limpida che circonda il pellet. Quindi lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 70% e centrifugare il campione a 10.000 ×g per 10 minuti. Per visualizzare il pellet, inclinare il tubo davanti a uno sfondo scuro e rimuovere con cautela la soluzione di lavaggio.

Ripetere il lavaggio. Passare al passaggio successivo. Sospendiamo il pellet in 10 microlitri di acqua priva di RNA.

Assicurarsi che il pellet sia completamente disciolto riscaldando il campione a 55 gradi Celsius per cinque minuti. Durante questo periodo, mescolare il campione mediante pipettaggio ripetuto per ottenere un pool con maggiore resa di RNA totale, due preparazioni di RNA dallo stesso paziente. Quantificare l'RNA risospeso utilizzando uno spettrofotometro UV rispetto a.

Spettrofotometro e valutare la qualità dell'RNA utilizzando un bioanalizzatore 2100. Successivamente, conservare i campioni di RNA raggruppati a meno 80 gradi Celsius per l'uso in applicazioni successive. I profili spettrofotometrici di RNA provenienti da siero umano dimostrano il rendimento migliorato di RNA dovuto all'aggiunta di diversi passaggi all'approccio tradizionale di chum Chomsky.

Un profilo UV tipico dell'RNA isolato dal siero umano si differenzia da quelli che utilizzano passaggi di ottimizzazione, inclusa l'aggiunta di glicogeno e una centrifugazione aggiuntiva, e dalla combinazione di questi strumenti, che determina una riduzione delle contaminazioni e un aumento del rendimento totale di RNA. La purezza del campione di RNA è ulteriormente aumentata mediante l'uso di un gel con blocco di fase, che trattiene fenolo e proteine. Inoltre, l'aumento del volume di siero ha un impatto significativo sul rendimento di RNA.

È stato eseguito un tracciato con bioanalizzatore per analizzare ulteriormente la qualità del campione. Un singolo picco a circa 21 nucleotidi rappresenta la frazione di microRNA. Il profiling con array e la QPCR sono stati eseguiti seguendo la procedura. Questo profilo di array di tre tumori della testa e del collo e di un campione normale S mostra l'espressione dei microRNA, analizzata mediante clustering gerarchico e presentata come mappa termica in cui è possibile osservare la sovraespressione e la sottoespressione dei microRNA.

Sono state generate curve di amplificazione QPCR per microRNA specifici. Questi dati sono stati quindi utilizzati per tracciare i valori CT grezzi per il siero normale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita su un qualsiasi numero di pazienti producendo RNA di alta qualità nel massimo attuale se eseguita correttamente seguendo la procedura. Altri metodi come la PCR quantitativa o il sequenziamento di nuova generazione possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come la scoperta e la validazione di biomarcatori.