Isolamento dei Piccoli RNA non codificanti dal siero umano

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare l'RNA di alta qualità dai campioni di siero. Utilizzando la nostra versione ottimizzata del comune protocollo RTLS dei reagenti MRC, try. Ciò si ottiene diluendo prima il siero in un rapporto da uno a cinque con acqua priva di nucleasi per ridurre la contaminazione proteica.

Il secondo passo consiste nell'introdurre provette ad aggancio di fase da due millilitri per la prima fase di centrifugazione. Questo intrappola la maggior parte dei contaminanti, come il fenolo e le proteine, nella fase organica. Successivamente, la terza e ultima fase di ottimizzazione è la centrifugazione flash a 12.000 formaggi, che rimuove qualsiasi contaminazione residua dal pellet di RNA prima dei lavaggi con etanolo.

Il passaggio finale consiste nel raggruppare due preparati di RNA modificati dallo stesso paziente se è richiesta una resa di RNA totale più elevata. In definitiva, utilizzando questo metodo modificato, che solubilizza il siero in acqua priva di nucleasi, utilizza un tubo ad aggancio di fase per intrappolare i principali contaminanti e introduce una rotazione flash. Dimostriamo che è possibile massimizzare il recupero di piccoli RNA non di rivestimento da un isolamento di RNA dal siero.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il protocollo standard di isolamento dell'RNA triolo, è che attraverso semplici modifiche, possiamo massimizzare la resa dell'RNA dal siero. In generale, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché i piccoli RNA si trovano in basse quantità nel siero. Il metodo ottimizzato e la visualizzazione di questi passaggi miglioreranno il recupero di questi RNA e guideranno i principianti verso un picco di isolamento di successo.

Per iniziare, scongelare il campione di siero congelato precedentemente preparato con ghiaccio, quindi trasferire 400 microlitri di siero appena scongelato in una provetta da microcentrifuga etichettata. Successivamente, diluire il siero con 100 microlitri di acqua priva di R nasi e aggiungere 50 microlitri di proteinasi K a una concentrazione di un milligrammo per millilitro. Quindi incubare il siero diluito a 37 gradi Celsius per 20 minuti per consentire un'adeguata digestione delle proteine per garantire la completa solubilizzazione a 1,5 millilitri di tri reagente RTLS e 100 microlitri di quattro promo anolo.

Capovolgere brevemente l'omogeneizzato ed eseguire il pipettaggio ripetitivo per cinque secondi. Quindi trasferire la miscela in una provetta di blocco di fase pesante da due millilitri etichettata. Far girare l'omogeneizzato a 12.000 GS per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Successivamente, decantare accuratamente un millilitro della soluzione acquosa risultante in una provetta fresca a basso legame del DNA. L'organico e l'interfaccia devono essere intrappolati sotto il gel bianco del tubo ad aggancio di fase. Quindi aggiungere cinque microlitri di glicogeno e 500 microlitri di isopropanolo al 100% alla soluzione acquosa.

Mescolare la soluzione per inversione e incubarla per una notte a meno 20 gradi Celsius. Dopo l'incubazione notturna, centrifugare il campione per 20 minuti a 12.000 GS in una centrifuga a quattro gradi Celsius. Quindi, scartare il surnatante chiaro ed eseguire una centrifuga flash per due minuti a 16.000 GS in una centrifuga a quattro gradi Celsius.

Utilizzando una pipetta, rimuovere con cautela la soluzione limpida che circonda il pellet. Quindi lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 70% e centrifugare il campione a 10.000 GS per 10 minuti. Per visualizzare il pellet, inclinare il tubo davanti a uno sfondo scuro e svuotare la soluzione di lavaggio.

Ripetere il lavaggio. Fatti avanti. Sospendiamo il pellet in 10 microlitri di acqua priva di RNA.

Assicurarsi che il pellet sia completamente sciolto riscaldando il campione a 55 gradi Celsius per cinque minuti. Durante questo periodo, mescolare il campione con pipettaggio ripetuto per ottenere un pool di resa di RNA totale più elevato, due preparazioni di RNA dello stesso paziente. Quantificare l'RNA risospeso utilizzando uno

spettrofotometro UV e valutare la qualità dell'RNA utilizzando un bioanalizzatore 2100. Quindi conservare i campioni di RNA aggregati a meno 80 gradi Celsius per l'uso in applicazioni a valle. I profili fotometrici spettrali dell'RNA del siero umano dimostrano la migliore resa dell'RNA grazie all'aggiunta di diversi passaggi al tradizionale approccio chum di Chomsky.

Un tipico profilo UV dell'RNA isolato dal siero umano contrasta con quelli che utilizzano fasi di ottimizzazione, tra cui l'aggiunta di glicogeno e spin extra, e ciascuno di questi strumenti combinati con conseguente riduzione dei contaminanti e aumento della resa dell'RNA totale. La purezza del campione di RNA è stata ulteriormente aumentata con l'uso di un gel ad aggancio di fase, che intrappola fenolo e proteine. Inoltre, l'aumento del volume del siero ha un notevole impatto sulla resa dell'RNA.

È stata eseguita una traccia del bioanalizzatore per analizzare ulteriormente la qualità del campione. Un singolo picco a circa 21 nucleotidi rappresenta il profilo dell'array di frazioni di micro RNA e la QPCR è stata eseguita dopo la procedura. Questo profilo di array di tre tumori della testa e del collo e un S normale mostra l'espressione dei microRNA, analizzato utilizzando il clustering gerarchico e presentato come una mappa di calore in cui è possibile osservare la sovraregolazione e la sottoregolazione dei microRNA.

Di seguito sono state generate curve di amplificazione QPCR per specifici microRNA. Questi dati sono stati quindi utilizzati per tracciare i valori grezzi di TC per il siero normale Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita su qualsiasi numero di pazienti producendo RNA di alta qualità nel massimo odierno se viene eseguita correttamente dopo la procedura. Altri metodi, come la PCR quantitativa o il sequenziamento di nuova generazione, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come la scoperta e la convalida dei biomarcatori.