Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare l'interazione dinamica tra una singola proteina legante il DNA e una molecola di DNA. Ciò si ottiene combinando, in un microscopio appositamente costruito, due tecniche a singola molecola: doppie trappole ottiche e microscopia a fluorescenza. Questa configurazione è inoltre dotata di illuminazione in campo chiaro per la visualizzazione e di stabilizzazione del campione a livello nanometrico.

Come secondo passaggio, viene realizzata una cella a flusso multicanale integrata in un sistema microfluidico, che permette fino a quattro flussi laminari di reclutare ed assemblare in modo efficiente tutti i componenti necessari per l'esperimento. Successivamente, viene assemblato il costrutto monoclonale al fine di eseguire gli esperimenti. Innanzitutto, due microsfere rivestite con titina a strisce vengono catturate mediante pinze ottiche duali nel primo canale.

I due microsfera intrappolati vengono quindi spostati nel secondo canale per consentire l'ancoraggio del modello di DNA marcato con biotina su entrambe le estremità. La presenza di una singola molecola di DNA viene verificata nel terzo canale mediante un'analisi forza-allungamento del DNA. Infine, il complesso microsfera-DNA-microsfera, chiamato manubrio di DNA, viene spostato nel canale delle proteine, dove è presente la proteina represse del lattosio marcata con un fluorocromo.

Vengono ottenuti risultati che mostrano la diffusione e il legame specifico di singole molecole di LAC eye su una singola molecola di DNA allungata e la quantificazione dei parametri cinetici del movimento di LAC eye. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti a livello di singola molecola sono la possibilità di controllare la tensione applicata alla molecola di DNA, la capacità di tracciare con precisione i movimenti delle proteine leganti in una posizione stabile a livello nanometrico, nonché la possibilità di operare lontano dalla superficie del coperchio del vetrino. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulle interazioni proteina-DNA, in particolare sui meccanismi della regolazione dell'espressione genica e sulla dinamica della diffusione delle proteine lungo il DNA nei meccanismi di ricerca del bersaglio.

Questa dimostrazione del metodo è molto utile per illustrare gli aspetti pratici della costruzione della cella a flusso, della manipolazione del campione e dell'assemblaggio del costrutto di perle con DNA. Questo video mostrerà innanzitutto come verificare la stabilità del puntamento dei due laser di trappolamento utilizzando microperle fissate sulla superficie di un coprioggetto come riferimento. Ulteriori dettagli sulla progettazione e costruzione dell'apparato di optical tweezer sono disponibili nel testo del protocollo allegato.

Utilizzare un coprioggetto di 24 per 60 millimetri per distribuire due microlitri di perline di silice sulla superficie di un coprioggetto di 24 per 32 millimetri. Utilizzando due pezzi di nastro adesivo doppio faccia, fissare il coprioggetto di 24 per 32 millimetri su un vetrino per creare una camera di flusso.

Riempire la cella di flusso con 50 millimoli di tampone fosfato e sigillarla con grasso siliconico. Un singolo microsfera di silice in microscopia a campo chiaro a un’ingrandimento di circa 2000 volte. Il campo visivo dovrebbe essere di circa sette per cinque micrometri, acquisito a 768 per 576 pixel, in modo che l’immagine della microsfera abbia un diametro di circa 190 pixel. Compensare le deriva termiche mediante un software di retroazione che calcola la posizione XY dal centro dell’immagine e la posizione Z dagli anelli di diffrazione, correggendo così le deriva.

Spostare uno stage piezoelettrico con un'accuratezza di nanometri o migliore per sovrapporre il centro della trappia sinistra al centro della microsfera e misurare il rumore di posizione e la sua deviazione standard dal fotodiodo a quadranti o QDP. Ripetere la misurazione per la trappia destra. La deviazione standard del rumore di posizione dovrebbe essere entro pochi nanometri per consentire una localizzazione precisa delle proteine di legame del DNA durante la preparazione della camera di flusso.

Viene utilizzato innanzitutto un punzone al diamante per forare dei fori del diametro di un millimetro su un vetrino microscopico di 76 per 76 per un millimetro, creando quattro ingressi e un'uscita. Questo permetterà fino a quattro flussi paralleli di tampone.

Ciascuno contenente uno dei diversi componenti necessari per l'esperimento: perle, DNA, proteina marcata con fluorocromo e tampone per l'acquisizione delle immagini. Pulire il vetrino del microscopio con etanolo e posizionare al centro il portello con la guarnizione ad O inserita e l'anello adesivo sul vetrino intorno ai fori di accesso. È essenziale indossare guanti durante questo passaggio per evitare impronte digitali, che potrebbero interferire con il processo di incollaggio.

Con l'aiuto di una seconda pinza, fissare i connettori nano alla lametta e posizionarla in un forno preriscaldato a 180 gradi Celsius per un'ora, in modo da consentire un attacco completo. Nel frattempo, disegnare su un foglio il profilo del canale di flusso. Il canale dovrebbe essere largo circa tre millimetri e corrispondere alle posizioni delle aperture sulla lametta del microscopio.

Posizionare il disegno sopra due pezzi di perfil e, con un bisturi, eseguire tagli precisi e continui lungo il contorno disegnato. Rimuovere eventuali protuberanze formate, scartare lo strato inferiore di parfum, utilizzato esclusivamente per garantire un supporto pulito. Successivamente, posizionare al contrario il vetrino portaoggetti contenente i nano porti attaccati all'interno del supporto metallico.

Allineare con attenzione il contorno della camera di paraformaldeide con i fori, assicurandosi che il paraform non fuoriesca dai canali di ingresso e uscita della camera. Coprire con una piastrina di microscopio pulita e rimuovere con cura il paraform in eccesso intorno alla camera. Posizionare due blocchi riscaldanti, precedentemente riscaldati a 120 gradi Celsius, sulla parte superiore della cella a flusso per applicare una pressione omogenea. Lasciare sciogliere il film di paraform per circa 25 minuti.

Il passo successivo consiste nel preparare il serbatoio della pressione e i contenitori del buffer. Il serbatoio della pressione è realizzato in plexiglass e permette di alloggiare fino a sei contenitori di buffer. Collegare innanzitutto le valvole di intercettazione all'uscita dei contenitori di buffer per attivare il flusso di buffer con la leva della valvola in posizione verticale oppure disattivarlo ruotando la leva in senso orario.

Durante gli esperimenti, montare la cella a flusso sulla piastra del microscopio. Quindi collegare le valvole di intercettazione tramite tubi in polieterchetone (PEEK) e raccordi senza flangia agli ingressi della camera a flusso. Il tubo PEEK ha un diametro interno di circa 150 micrometri; vengono utilizzati circa tre centimetri di tubo in fluoruro di etilene propilene con un diametro interno di circa 500 micrometri come collegamento tra il tubo PEEK e i raccordi nano port della cella a flusso.

Questo è essenziale per ridurre il flusso del buffer all'ingresso della camera ed evitare la rottura della cella di flusso o il distacco del nano raccordo dal vetro. L'uso esclusivo di tubi con grande diametro interno, d'altro canto, richiederebbe grandi volumi di campioni biologici. Collegare l'uscita della camera di flusso a un tubo Falcon aperto alla pressione atmosferica.

Questo tubo serve per smaltire il tampone che fuoriesce dalla camera di flusso. Per iniziare questa procedura, aggiungere un millilitro di tampone A in ciascun contenitore del tampone ed applicare una pressione di 200 millibar per lavare i tubi di collegamento e la cella di flusso. Un sistema di controllo della pressione è in grado di farlo.

Infine, regolare la pressione dell'aria all'interno del serbatoio a pressione. Verificare la presenza di bolle d'aria, che potrebbero alterare la regolarità del flusso. Un leggero colpetto sul tubo di uscita aiuterà a rimuovere eventuali bolle residue; ridurre quindi la pressione a 20 millibar e verificare che tutti i canali e i tubi siano privi di bolle d'aria e che il tampone fluisca con velocità simili in tutti i canali.

Preparare i campioni fino a un volume finale di 300 microlitri. Questo esperimento utilizza microsfere di polistirene rivestite con streptavidina, DNA lineare biotinilato alle due estremità contenente sequenze bersaglio specifiche per il legame con il repressore del lattosio e proteina fluorescente del repressore del lattosio. Aggiungere ogni campione a uno dei contenitori della siringa nel seguente ordine: microsfere nel primo canale, DNA nel secondo, buffer di imaging nel terzo e proteina marcata nel quarto canale.

Aprire il flusso a 20 millibar e aprire le valvole di intercettazione per permettere ai campioni di entrare nel canale di flusso. Questo fenomeno è facilmente rilevabile nel canale delle perle. Durante l'acquisizione di immagini del primo canale in illuminazione in campo chiaro, attivare le due pinze ottiche e catturare una perla di polistirene in ciascuna trappola.

Spostarsi rapidamente al secondo canale per evitare che le altre perle cadano nelle trappole. Si noti che l'arrivo nel canale del DNA è facilmente osservabile dalla fine del flusso delle perle. Utilizzando un deflettore ottico AO o una mossa OD, muovere avanti e indietro una perla intrappolata nella vicinanza dell'altra perla, consentendo l'attacco del DNA esteso dal flusso tra le due perle intrappolate otticamente.

Quando si forma un dumbbell di DNA, la perla statica inizia a seguire il movimento della perla che viene attivamente spostata avanti e indietro dal trappolo. Spostarsi rapidamente sul canale del tampone e spegnere il flusso del tampone. Eseguire un'analisi della curva forza-allungamento per verificare la presenza di una singola molecola di DNA.

Questo viene effettuato separando le due perle mentre si misura la tensione del DNA. Una volta ottenuto un singolo dumbbell di DNA, riattivare il flusso e spostare il dumbbell nel canale proteico. Passare alla microscopia a fluorescenza in campo largo per monitorare l'interazione della proteina represse del lattosio marcata con il DNA, spegnere il flusso e iniziare l'acquisizione.

Questo metodo consente la rilevazione di singole molecole di represse del lattosio o di lac eye che interagiscono con una molecola di DNA allungata. In questo diagramma CH rappresentativo, una singola molecola di lac eye diffonde lungo sequenze di DNA non specifiche, mentre un'altra molecola di lac eye è legata specificamente a un operatore situato al centro della molecola di DNA. Questo grafico mostra la posizione delle due molecole di lac eye lungo la direzione che collega i centri delle due trappole.

In funzione del tempo, le posizioni delle molecole sono state determinate mediante l'algoritmo del centro di simmetria radiale; qui è riportato un grafico dello spostamento quadratico medio, o MSD, in funzione del tempo per una singola molecola proteica lac che diffonde lungo una molecola di DNA allungata. Il coefficiente di diffusione della proteina può essere facilmente ottenuto tramite regressione lineare dei dati. La combinazione di tecniche di manipolazione e di imaging rappresenta un metodo potente, che consente il controllo meccanico su un singolo polimero biologico come D-N-A-R-N-A o un filamento del citoscheletro, e al contempo la localizzazione di singole molecole proteiche che interagiscono con il polimero stesso.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che la combinazione di tecniche di manipolazione e di imaging a livello di singola molecola richiede una progettazione accurata dell'allestimento sperimentale per garantire una stabilità a livello nanometrico del polimero sospeso. Dall'altro lato, è necessaria una progettazione adeguata della sonda biologica per assicurare un'adeguata separazione spaziale tra il laser di trappia G e la sonda fluorescente. Si rimanda al testo del protocollo allegato per i dettagli.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assemblare la molecola di DNA tra i due rapidi impulsi ottici dell'assemblaggio di questo costrutto. Si ottiene un risultato migliore utilizzando la cella a flusso multicanale per la quale abbiamo fornito una descrizione dettagliata. Abbiamo inoltre indicato come ottimizzare il flusso del buffer e rimuovere le bolle d'aria, che altrimenti potrebbero compromettere i tuoi esperimenti.

Nel protocollo combinato di testo, è possibile trovare i protocolli per marcare il DNA con bioTE, necessario per l'assemblaggio con le perline rivestite di streptavidina, nonché i protocolli per marcare la proteina. Infine, abbiamo illustrato le operazioni passo dopo passo per quantificare il legame e la diffusione di una singola proteina repressiva della lattosio su una molecola di DNA distesa.