Name: Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Scopri come combinare pinze ottiche doppie e microscopia a fluorescenza per studiare le interazioni proteina-DNA a livello di singola molecola. Questo metodo consente di controllare la tensione sul DNA e tracciare i movimenti delle proteine con precisione nanometrica.

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Ringraziamo Gijs wuite, Erwin JG Peterman, e Peter Gross aiuto per la microfluidica e Alessia Tempestini di aiuto per la preparazione del campione. Questa ricerca è stata finanziata dal Settimo programma quadro dell&#39;Unione europea (7 ° PQ / 2007-2013), contratto di sovvenzione n ° 284.464 e dal Ministero italiano dell&#39;Istruzione, dell&#39;Università e della Ricerca FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro in Ricerca 2013 RBFR13V4M2, e nel quadro di il Flagship Progetto NANOMAX.

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<li>Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+optical+trapping+and+single-molecule+fluorescence+spectroscopy%3A+enhanced+photobleaching+of+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores.</a> J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).</li>
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<li>Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA with optical tweezers.</a> Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).</li>
<li>Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+precise+algorithm+based+on+maximum+radial+symmetry+for+single+molecule+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization.</a> Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Negli ultimi dieci anni, le tecniche di manipolazione e di imaging singole molecole hanno visto grandi progressi in termini di risoluzione spaziale e temporale. La combinazione di tecniche di manipolazione e di imaging è alla base di strumenti potenti che ora permettono il controllo delle condizioni meccaniche di un singolo polimero biologico, come DNA, RNA o filamenti del citoscheletro, e la localizzazione simultanea di singole proteine ​​interagenti con lo stesso polimero . Controllare le condizioni meccaniche del pol...

Tecniche di singola molecola (SM) hanno notevolmente sviluppato nel corso degli ultimi trenta anni per rispondere alla necessità di superare alcune delle limitazioni delle tradizionali, alla rinfusa misure soluzione 1-3. La manipolazione di molecole biologiche singoli ha creato la possibilità di misurare le proprietà meccaniche dei biopolimeri 4 e controllare i parametri meccanici di proteina-proteina 5 e le interazioni proteina-DNA 6,7. Fluorescenza SM, dall&#39;altro, rappresenta uno strumento estremamente versatile per studiare l&#39;attività della proteina in vitro e in vivo, che conduce alla possibilità di localizzazione e inseguimento singole molecole con precisione nanometrica. Attraverso il montaggio del punto-spread-funzione strumento all&#39;immagine SM, infatti, si può realizzare localizzazione con precisione in funzione principalmente segnale-rumore (SNR) e raggiungere un limite di circa un nanometro 8,9. Queste metodologie trovano potenteapplicazioni nello studio della dinamica delle proteine ​​motrici, nonché dei processi di diffusione sottostanti ricerche bersaglio di proteine ​​che legano il DNA. La capacità di determinare costanti di diffusione in funzione della sequenza di DNA, tempo di permanenza sul bersaglio e con precisione la misurazione della lunghezza del DNA esplorato durante gli eventi di diffusione monodimensionali, rappresentano un potente strumento per lo studio di interazioni proteina-DNA dinamiche di interazione e per la verifica dei meccanismi di specifica destinazione della ricerca. Recentemente, la combinazione di queste due tecniche ha prodotto una nuova generazione di apparati sperimentali 10-14 consentano la manipolazione simultanea di un substrato biologico (per esempio un filamento di actina o una molecola di DNA) e rilevamento / localizzazione di un partner interagenti enzima (per esempio miosina o una proteina di legame al DNA). I vantaggi di queste tecniche poggiano principalmente sulla possibilità di esercitare un controllo meccanico sul polimero intrappolato, così enabling lo studio delle dinamiche di interazione rispetto a forze o coppie. Inoltre, il metodo consente di misurare le reazioni biochimiche lontano dalla superficie, evitando una delle principali limitazioni dei metodi classici SM, cioè, la necessità di immobilizzazione delle molecole in esame su una superficie (vetrino o microsfere). La combinazione di due molecole singole tecniche è necessario superare diverse difficoltà tecniche, derivanti principalmente dai requisiti di stabilità meccanica e adeguata SNR (specialmente quando richiede la localizzazione con precisione nm) 15. In particolare, in caso di allacciamento di rilevamento della fluorescenza SM con pinzette ottiche, la riduzione del rumore e photobleaching da intrappolamento laser a infrarossi 16 e il controllo di buffer biochimici per l&#39;assemblaggio dei complessi biologici e le prestazioni delle misure sperimentali 11 sono di fondamentale importanza. Qui, descriviamo i metodi per l&#39;esecuzione di successomisurazioni in una configurazione a doppio localizzazione cattura / SM fluorescenza. La metodologia è illustrata con l&#39;esempio della proteina repressore lattosio (LacI) fluorescente (con Atto532) e rilevato come si lega ad una molecola di DNA (intrappolato tra due pinzette ottiche) contenente specifiche sequenze di legame Laci (ad esempio, operatori). Abbiamo dimostrato l&#39;efficacia del metodo di rilevazione di legame al DNA di LacI e diffusione lungo il suo profilo nel processo di ricerca di destinazione. Il metodo è applicabile a qualsiasi combinazione di sequenze di DNA e proteine ​​di legame al DNA, come pure ad altri sistemi (microtubuli o filamenti di actina e le proteine ​​motrici che interagiscono con essi).

<table><tbody><tr><td>Isolatori elastomerici</td><td>Newport</td><td>Newdamp</td><td>Scegli l'elastomero Newdamp appropriato a seconda del peso del microscopio e delle frequenze di risonanza</td></tr><tr><td>Isolatore ottico</td><td>Ottica per la ricerca</td><td>IO-3-YAG-VHP</td><td></td></tr><tr><td>Laser Nd:YAG, lunghezza d'onda 1.064 nm</td><td>Spectra-Physics</td><td>Millennia IR</td><td></td></tr><tr><td>Deflettori acusto-ottici (AODs)</td><td>A& A optoelettronico</td><td>DTS-XY 250</td><td></td></tr><tr><td>Sintetizzatori digitali diretti Analog</td><td>Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rivelatori a quadranti fotodiodi</td><td>OSI Optoelettronica</td><td>SPOT-15-YAG</td><td></td></tr><tr><td>Scheda DIO e FPGA</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-7830R</td><td></td></tr><tr><td>Lampada alogena</td><td>Schott</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>Condensatore</td><td>Olympus</td><td>U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA immersione</td><td></td>in acqua</tr><tr><td>532 nm laser</td><td>Zaffiro</td><td></td><td>coerente</td></tr><tr><td>CCD 200X e 2000X</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>XC-ST70 CE</td><td></td></tr><tr><td>CCD moltiplicato per elettroni</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>Stadio piezoelettrico con precisione nm</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-527.2CL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di emissione</td><td>Chroma Technologies</td><td>600/100m</td><td></td></tr><tr><td>Perle di silice (1,54 mm)</td><td>Bangs Laboratories</td><td>SS04N/5303</td><td></td></tr><tr><td>Albumina da siero bovino (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>Pentyl acetate&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46022</td><td>Liquido e vapore infiammabile (n. 1272/2008)</td></tr><tr><td>Nitrocellulosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8267-5EA</td><td>Solido infiammabile&nbsp; (n. 1272/2008)</td></tr><tr><td>Blocco termico</td><td>MPM Instruments Srl</td><td>M502-HBD</td><td>con 2 blocchi rimovibili; preriscaldato a 120 gradi C</td></tr><tr><td>NanoPort assemblaggi</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>N-333</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polietereterchetone&nbsp;</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>1535</td><td></td></tr><tr><td>Supporto metallico fatto in casa per il montaggio del serbatoio di pressione della camera di flusso in Plexiglass</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luer siringhe lock-tip 2,5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS 02LZ1</td><td></td></tr><tr><td>Valvole di intercettazione&nbsp;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>Raccordi senza flangia&nbsp;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>LT-111</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in etilene propilene fluorurato&nbsp;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>1549</td><td></td></tr><tr><td>Due elettrovalvole a controllo computerizzato</td><td>Clippard, Cincinnati, USA</td><td>ET-2-H-M5</td><td></td></tr><tr><td>Trasduttore di pressione</td><td>Druck LTD</td><td>PTX 1400</td><td></td></tr><tr><td>biotin-14-dCTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>19518-018</td><td></td></tr><tr><td>Deossinucleotidiltransferasi terminale (TdT)</td><td>Thermoscientific</td><td>EP0161</td><td></td></tr><tr><td>ATTO532 maleimmide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68499</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformammide (DMF)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>Liquido combustibile, dannoso per assorbimento cutaneo. Irritante, teratogeno. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280; P305; P351; P338; P311</td></tr><tr><td>Tris-(2-carbossietil)fosfina cloridrato (TCEP)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutatione ridotto (GSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td>Tossicità acuta, orale (categoria 5), H303</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL membrana, 10&nbsp; Concentratori di spin cutoff kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Perle di polistirene rivestite di streptavidina 1,87 & micro; m</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>SVP-15-5</td><td></td></tr></tbody></table>

combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-dna

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

L'articolo descrive la combinazione di pinzette ottiche e rilevamento della fluorescenza di una singola molecola per lo studio dell'interazione proteina-DNA. Il metodo offre l'opportunità di studiare le interazioni che avvengono in soluzione (evitando così problemi dovuti a superfici vicine come in altri metodi a singola molecola), controllando l'estensione del DNA e tracciando le dinamiche di interazione in funzione sia dei parametri meccanici che della sequenza del DNA. Vengono illustrati i metodi per stabilire con successo l'intrappolamento ottico e la localizzazione nanometrica di singole molecole. Illustriamo le condizioni sperimentali che consentono lo studio dell'interazione del repressore del lattosio (lacI), marcato con Atto532, con una molecola di DNA contenente specifiche sequenze bersaglio (operatori) per il legame di LacI. Il metodo consente l'osservazione di specifiche interazioni presso gli operatori, nonché la diffusione unidimensionale della proteina durante il processo di ricerca del bersaglio. Il metodo è ampiamente applicabile allo studio delle interazioni proteina-DNA ma anche ai motori molecolari, dove è auspicabile il controllo della tensione applicata al polimero della traccia partner (ad esempio actina o microtubuli).

In un esperimento riuscito, uno (o più) proteine ​​marcate sottoposti vincolante / non vincolante diffusione e / o monodimensionale lungo la molecola di DNA (Figura 3A). La localizzazione delle proteine ​​lungo la molecola di DNA consente la quantificazione dei parametri cinetici in funzione della sequenza di DNA. Quando vengono applicate le condizioni di buffer causano diffusione 1D, è possibile seguire traiettorie proteici, e determinare, per esempio, il coefficiente di diffusione D 1D. </p...

Qui si descrive la strumentazione e metodi per la rilevazione di molecole proteiche singolo fluorescenza marcata che interagiscono con una singola molecola di DNA sospeso tra due microsfere otticamente intrappolati.

Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare l'interazione dinamica tra una singola proteina legante il DNA e una molecola di DNA. Ciò si ottiene combinando, in un microscopio appositamente costruito, due tecniche a singola molecola: doppie trappole ottiche e microscopia a fluorescenza. Questa configurazione è inoltre dotata di illuminazione in campo chiaro per la visualizzazione e di stabilizzazione del campione a livello nanometrico.Come secondo passaggio, viene realizzata una cella a flusso multicanale integrata in un sistema microfluidico, che permette fino a quattro flussi laminari di reclutare ed assemblare in modo efficiente tutti i componenti necessari per l'esperimento. Successivamente, viene assemblato il costrutto monoclonale al fine di eseguire gli esperimenti. Innanzitutto, due microsfere rivestite con titina a strisce vengono catturate mediante pinze ottiche duali nel primo canale.I due microsfera intrappolati vengono quindi spostati nel secondo canale per consentire l'ancoraggio del modello di DNA marcato con biotina su entrambe le estremità. La presenza di una singola molecola di DNA viene verificata nel terzo canale mediante un'analisi forza-allungamento de

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Un tapping mode microscopio a forza atomica (AFM), metodo per la visualizzazione di DNA plasmidico, proteine ​​citoplasmatiche, e DNA-proteina complessi è descritta. Il metodo include approcci alternativi per la preparazione di campioni per l'imaging AFM seguenti manipolazione biochimica. Specifiche regioni di DNA che contiene le proteine ​​che interagiscono sono osservati in quasi fisiologico condizioni di buffer.

Visualizzazione del DNA ricombinante e Complessi proteina usando la microscopia a forza atomica

Questo video descrive un metodo per visualizzare l'assemblaggio di condensati di proteine di fusione su molecole di DNA in loci specifici utilizzando l'imaging a singola molecola. Questi condensati si formano a causa delle interazioni LCD-LCD e LCD-DBD, che consentono il reclutamento della RNA polimerasi II e una migliore trascrizione genica.

Imaging di una singola molecola per visualizzare l'assemblaggio di condensati di proteine di fusione su tende di DNA

Fotoattivati ​​microscopia localizzazione (PALM) in combinazione con inseguimento singola molecola permette l'osservazione diretta e la quantificazione delle interazioni proteina-DNA in cellule di Escherichia coli vive.

Visualizzare le interazioni proteina-DNA in cellule vive batteriche Uso fotoattivati ​​singola molecola di monitoraggio

Qui, presentiamo un protocollo per studiare le interazioni della DNA-proteina mediante microscopia a fluorescenza riflessione interna totale (TIRFM) usando un substrato di DNA λ site-specifically modificate e un Quantum-dot etichettato proteine.

Visualizzare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate a livello di singola molecola

Utilizzando il DNA marcato con punti quantici e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale, possiamo studiare il meccanismo di reazione delle endonucleasi di restrizione utilizzando proteine non marcate. Questa tecnica a singola molecola consente l'osservazione massicciamente multiplexata delle singole interazioni proteina-DNA e i dati possono essere raggruppati per generare distribuzioni del tempo di permanenza ben popolate.

Analisi del tempo di permanenza di una singola molecola della scissione del DNA mediata da endonucleasi di restrizione

Qui, descriviamo l'uso del metodo di imaging a singola molecola, DNA Curtains, per studiare il meccanismo biofisico dell'assemblaggio dei condensati EWS-FLI1 sul DNA.

Imaging a singola molecola dell'assemblaggio di condensati EWS-FLI1 sul DNA

DNA curtain, una tecnica di imaging ad alto rendimento di una singola molecola, fornisce una piattaforma per la visualizzazione in tempo reale di diverse interazioni proteina-DNA. Il presente protocollo utilizza la tecnica della cortina del DNA per studiare il ruolo biologico e il meccanismo molecolare di Abo1, una ATPasi AAA+ contenente bromodominio pombe di Schizosaccharomyces .

Decifrare il meccanismo molecolare dell'assemblaggio degli istoni mediante la tecnica della tenda del DNA

La biochimica visiva a singola molecola studiata attraverso camere microfluidiche è notevolmente facilitata utilizzando barili di vetro, siringhe a tenuta di gas, connessioni stabili di tubi alle celle di flusso ed eliminazione delle bolle posizionando valvole di commutazione tra le siringhe e i tubi. Il protocollo descrive due trappole ottiche che consentono la visualizzazione delle transazioni del DNA e delle interazioni intermolecolari.

Uso di pinzette ottiche doppie e microfluidica per studi a singola molecola

È stato dimostrato che molte proteine intrinsecamente disordinate partecipano alla formazione di condensati biomolecolari altamente dinamici, un comportamento importante per numerosi processi cellulari. Qui, presentiamo un metodo basato sull'imaging a singola molecola per quantificare le dinamiche con cui le proteine interagiscono tra loro nei condensati biomolecolari nelle cellule vive.

Misura a singola molecola delle dinamiche di interazione proteica all'interno di condensati biomolecolari

Riportiamo un saggio ibrido di ensemble e di una singola molecola per visualizzare e quantificare direttamente il movimento dell'elicasi Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) marcata in fluorescenza, completamente ricostituita, su molecole di DNA lineari tenute in posizione in una trappola ottica.

Saggio ibrido di ensemble e singola molecola per l'imaging del movimento di CMG completamente ricostituito

Questo protocollo delinea la procedura per eseguire la microscopia di localizzazione a singola molecola profonda e intera cellula (SMLM) utilizzando un microscopio confocale a disco rotante con riassegnazione ottica dei fotoni, consentendo così l'imaging DNA-PAINT senza la necessità di ottica personalizzata o illuminazione complessa.

Imaging a superrisoluzione di cellule intere tramite DNA-PAINT su un disco confocale rotante con riassegnazione ottica dei fotoni

Scopri come combinare pinze ottiche doppie e microscopia a fluorescenza per studiare le interazioni proteina-DNA a livello di singola molecola. Questo metodo consente di controllare la tensione sul DNA e tracciare i movimenti delle proteine con precisione nanometrica.

Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

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