Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare l'interazione dinamica tra una singola proteina legante il DNA e una molecola di DNA. Ciò si ottiene combinando in un microscopio personalizzato, due tecniche a singola molecola, doppie pinzette ottiche e microscopia a fluorescenza. Questa configurazione è inoltre dotata di illuminazione a campo chiaro per la visualizzazione e la stabilizzazione nanometrica del campione.

Come seconda fase, viene costruita una cella a flusso multicanale integrata in un sistema di microflusso per consentire a un massimo di quattro flussi laminari di reclutare e assemblare in modo efficiente tutti i componenti necessari per l'esperimento. Successivamente, il costrutto della singola molecola viene assemblato per eseguire gli esperimenti. Le prime due microsfere rivestite di titina a strisce vengono catturate con la doppia pinzetta ottica nel primo canale.

Le due perle intrappolate vengono quindi spostate nel secondo canale per consentire l'attacco del modello di DNA marcato con biotina su entrambe le estremità. La presenza di una singola molecola di DNA viene verificata nel terzo canale mediante l'analisi di estensione della forza del DNA A. Infine, il costrutto di perline di DNA chiamato DNA dumbbell viene spostato sul canale proteico dove è presente la proteina repressore del lattosio marcata in fluorescenza.

Si ottengono risultati che mostrano la diffusione e il legame specifico di singole molecole oculari di LAC su una singola molecola di DNA allungata e la quantificazione dei parametri cinetici del movimento oculare LAC. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti a singola molecola sono la possibilità di controllare la tensione applicata alla nuova molecola, la possibilità di tracciare con precisione i movimenti delle proteine leganti su un punto stabile nanometrico, nonché la capacità di operare lontano dalla superficie del sonno di copertura. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulle interazioni proteina DNA, in particolare sulla meccanica della regolazione dell'espressione genica, nonché sulla dinamica della diffusione proteica lungo il DNA nei meccanismi di ricerca del bersaglio.

Queste dimostrazioni di questo metodo sono molto utili per mostrare gli aspetti pratici della costruzione della cella di flusso, della manipolazione del campione e dell'assemblaggio del costrutto di perline di DNA a battito. Questo video dimostrerà innanzitutto come verificare la stabilità di puntamento dei due laser di intrappolamento utilizzando come riferimento micro perline incollate su una superficie di vetrino coprioggetti. I dettagli sulla progettazione e la costruzione della configurazione della pinzetta ottica sono disponibili nel testo del protocollo allegato.

Utilizzare un vetrino coprioggetti da 24 x 60 millimetri per stendere due microlitri di perle di silice sulla superficie di un vetrino coprioggetti da 24 x 32 millimetri. Utilizzando due pezzi di nastro biadesivo. Fissare il vetrino coprioggetto da 24 x 32 millimetri su un vetrino da microscopio per creare una cella di flusso.

Riempire la cella di flusso con 50 millimolari di tampone fosfato e sigillarla con un'immagine di grasso al silicone. Una perla di silice in microscopia a campo chiaro a circa 2000 volte l'ingrandimento. Il campo visivo dovrebbe essere di circa sette per cinque micrometri acquisiti a 7 68 per 5 76 pixel in modo che l'immagine del perlina abbia un diametro di circa 190 pixel per compensare le derive termiche con un software di feedback che calcola la posizione XY dal centro dell'immagine e Z dagli anelli di diffrazione e corregge le derive.

Spostando uno stadio pizo con precisione nanometrica o meglio, sovrapporre il centro della trappola sinistra con il centro della perlina e misurare il rumore di posizione e la sua deviazione standard dal fotodiodo del rivelatore a quadranti o QDP. Ripetere la misurazione per la trappola corretta. La deviazione standard del rumore di posizione dovrebbe essere entro pochi nanometri per consentire una localizzazione precisa delle proteine leganti il DNA per creare la cellula di flusso.

Una punta di diamante viene prima utilizzata per praticare fori di un diametro millimetrico in un microscopio 76 x 76 x un millimetro. Far scorrere per creare quattro ingressi e un'uscita. In questo modo saranno consentiti fino a quattro flussi buffer paralleli.

Ciascuno contiene uno dei diversi componenti necessari per le perle dell'esperimento, la proteina marcata con fluorescenza di DNA e il tampone di imaging. Pulire il vetrino del microscopio con etanolo e centrare la porta con l'O-ring inserito e l'anello adesivo nel vetrino che circonda i fori di accesso. È essenziale indossare i guanti durante questa fase per evitare impronte digitali, che disturberebbero il processo di incollaggio.

Con l'aiuto di un secondo vetrino, fissare le nano porte al vetrino e metterlo in un forno preriscaldato a 180 gradi Celsius per un'ora per consentire il fissaggio completo. Nel frattempo, disegna il modello di contorno della cella di flusso su un foglio di carta. Il canale deve essere largo circa tre millimetri e corrispondere a tutte le posizioni sul vetrino del microscopio.

Posiziona il disegno sopra due pezzi di perfil e con un bisturi, fai dei tagli netti e continui lungo il contorno disegnato. Rimuovere eventuali protuberanze formate, scartare lo strato inferiore di profumo, che serve solo a garantire un supporto pulito. Quindi posizionare il vetrino del microscopio contenente le nano porte attaccate capovolte nel supporto metallico.

Allineare con cura il contorno della camera paraforma con i fori, assicurandosi che il param non estruda gli ingressi e l'uscita del coperchio della camera con un vetrino coprimicroscopio pulito e rimuovere con cura i parametri in eccesso che circondano la camera. Posizionare due blocchi di calore precedentemente riscaldati a 120 gradi Celsius sopra la cella di flusso per applicare una pressione omogenea su di essa. Lasciare sciogliere la pellicola para per circa 25 minuti.

Il passo successivo consiste nel preparare il serbatoio a pressione e i contenitori tampone. Il serbatoio a pressione è realizzato in plexiglass e consente di alloggiare fino a sei contenitori tampone. Innanzitutto, collegare le valvole di intercettazione all'uscita dei contenitori tampone per attivare il flusso tampone con la leva della valvola in posizione verticale o spegnerla in posizione ruotata in senso orario.

Durante gli esperimenti, montare la cella di flusso sul tavolino del microscopio. Quindi collegare le valvole di intercettazione attraverso il polietere, l'etere chetone o il tubo di picco e le rotazioni senza flangia agli ingressi della camera di flusso. Il tubo di picco ha un diametro interno di circa 150 micrometri chilometri, circa tre centimetri di tubo di etilene propilene fluorurato con un diametro interno di circa 500 micrometri vengono utilizzati come collegamento tra il tubo di picco e i gruppi di nano porte della cella di flusso.

Questo è essenziale per ridurre il flusso tampone all'ingresso della camera per evitare la rottura della cella di flusso o il distacco della nano porta dal vetro. L'uso di tubi di grande diametro interno, d'altra parte, richiederebbe grandi volumi di campioni biologici. Collegare l'uscita della camera di flusso a un tubo Falcon aperto a pressione atmosferica.

Questo tubo funge da smaltimento per il tampone che fuoriesce dalla camera di flusso. Per iniziare questa procedura, aggiungere un millilitro di tampone A a ciascuno dei contenitori tampone e applicare 200 millibar di pressione per lavare i tubi di collegamento e la cella di flusso. È possibile un sistema di controllo della pressione.

Infine, regolando la pressione dell'aria all'interno del serbatoio di pressione. Verificare la presenza di bolle d'aria, che potrebbero disturbare la scorrevolezza del flusso. Un leggero movimento sul tubo di uscita aiuterà a rimuovere eventuali bolle rimanenti, ridurre la pressione a 20 millibar e verificare che tutti i canali e i tubi siano liberi da bolle d'aria e che il tampone scorra con velocità simili in tutti i canali.

Preparare i campioni fino a un volume finale di 300 microlitri. Questo esperimento utilizza perle di polistirene rivestite di strept, DNA lineare biotinilato su entrambe le estremità che contengono sequenze bersaglio specifiche per il legame del repressore del lattosio e proteina repressore del lattosio marcata in fluorescenza. Aggiungere ogni campione in uno dei contenitori della siringa nel seguente ordine: le perle nel primo canale, il DNA nel secondo, il tampone di imaging nel terzo e la proteina marcata nel quarto canale.

Attivare il flusso a 20 millibar e aprire le valvole di intercettazione per consentire ai campioni di arrivare all'interno del canale di flusso. Questo è facilmente rilevabile nel canale del cordone. Durante l'imaging del primo canale in condizioni di illuminazione in campo chiaro, accendere le due pinzette ottiche e catturare una perlina di polistirene in ogni trappola.

Spostati rapidamente sul secondo canale per evitare che le altre perline cadano nelle trappole. Si noti che l'arrivo nel canale del DNA è facilmente percepibile alla fine del flusso della perlina. Utilizzando un deflettore ottico AO o un movimento OD, una perlina trappola avanti e indietro in prossimità dell'altra perlina per consentire l'attacco del DNA esteso al flusso tra le due perle otticamente intrappolate.

Quando si forma un manubrio a DNA, la perlina statica inizia a seguire il movimento della perlina che viene attivamente spostata avanti e indietro dalla trappola. Spostarsi rapidamente sul canale del buffer e disattivare il flusso del buffer. Eseguire un'analisi della curva di forza ed estensione per verificare la presenza di una singola molecola di DNA.

Ciò si ottiene separando le due perle mentre si misura la tensione del DNA. Una volta ottenuto un singolo manubrio a DNA, riattiva il flusso e sposta il manubrio sul canale proteico. Passa alla microscopia a fluorescenza ad ampio campo per monitorare l'interazione della proteina repressore del lattosio marcata con il DNA, disattivare il flusso e avviare l'acquisizione.

Questo metodo consente di rilevare singole molecole di repressore del lattosio o di lac eye che interagiscono con una molecola di DNA allungata. In questo agramma CH rappresentativo, una singola molecola dell'occhio lac si diffonde lungo sequenze di DNA non specifiche, mentre un'altra molecola dell'occhio lac è specificamente legata a un operatore situato al centro della molecola di DNA. Questo grafico mostra la posizione delle due molecole dell'occhio lac lungo la direzione che collega i centri delle due trappole.

In funzione del tempo, le posizioni delle molecole sono state determinate dall'algoritmo del centro di simmetria radiale mostrato qui è un grafico dello spostamento quadratico medio o MSD rispetto al tempo per una singola molecola dell'occhio lac che si diffonde lungo una molecola di DNA allungata. Il coefficiente di diffusione della proteina può essere facilmente ottenuto dalla regressione lineare dei dati. La combinazione di tecniche di manipolazione e imaging è un metodo potente, che consente il controllo meccanico su un singolo polimero biologico come D-N-A-R-N-A o un filamento citoscheletrico, e la localizzazione simultanea di singole molecole proteiche che interagiscono con il polimero stesso.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la combinazione di tecniche di manipolazione di singole molecole e di imaging richiede un'attenta progettazione della configurazione sperimentale per garantire la stabilità a livello nanometrico del polimero sospeso. D'altra parte, è necessaria una corretta progettazione della sonda biologica per garantire una separazione speciale tra il laser G di intrappolamento e la sonda fluorescente. Per ulteriori informazioni, consultare il testo del protocollo allegato.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assemblare la molecola di DNA tra i due battiti rapidi ottici l'assemblaggio di questo costrutto. Si ottiene meglio con la cella a flusso multicanale di cui abbiamo fornito la descrizione dettagliata. Abbiamo anche indicato come ottimizzare il flusso tampone e rimuovere le bolle d'aria, che altrimenti potrebbero compromettere i vostri esperimenti.

Nel protocollo di testo combinato, puoi trovare i protocolli per etichettare il DNA con bioTE, che è necessario per l'assemblaggio con i battiti rivestiti di streptavidina, nonché i protocolli per marcare la proteina. Infine, abbiamo illustrato le operazioni passo-passo per quantificare il legame e la diffusione di una singola proteina repressiva del lattosio su una molecola di DNA allungata.