Name: Purificazione della fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana proteina espressa in Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Scopri la purificazione della proteina CFTR espressa in Saccharomyces cerevisiae per studi biochimici. Questo metodo consente di isolare quantità milligrammo di CFTR funzionale per ricerche strutturali e screening di farmaci.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla US Cystic Fibrosis Foundation (CFF), attraverso la sua struttura consortile CFTR 3D. TR è stato finanziato da una borsa di studio nel Regno Unito CF Trust, e NC da una borsa di studio nel Regno Unito BBSRC. Noi riconosciamo i nostri colleghi della struttura consortile CFF CFTR 3D per il loro aiuto e consigli e per la progettazione dei polli sequenza CFTR e di depurazione tag codone ottimizzato.

1. Preparazione di buffer <ol><li> Per rendere lo stock 100x inibitori della proteasi (PI) cocktail sciogliere 96 mg AEBSF, 3,5 mg chimostatina, 10 mg E64, 16,5 mg leupeptina, 16,5 mg pepstatina, 348 mg PMSF, e 4 mg Bestatin in 20 ml di DMSO. Fai aliquote da 1 ml e conservare a -20 ° C. Per fare una scorta 100x di benzamidina sciogliere 720 mg in 20 ml di acqua ultrapura (DDH 2 O) e conservare in 1 ml aliquote a -20 ° C. Questa quantità è sufficiente per una purificazione. In tutti i buffer, le scorte PI e benzamidina sono usati alla diluizione 1:100. </li><li> Preparare &#39;MPIB&#39; (0,3 M Tris pH 8, 0.3 M saccarosio, 2 mM DTT) e &#39;CFTR&#39; (50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) di glicerolo, 1 mM DTT) tamponi e freddo a 4 ° C . Prima dell&#39;uso, aggiungere 1:100 del cocktail di inibitori di proteasi e 1:100 benzamidina base al volume di MPIB usato per risospendere il pellet cellulare (ad esempio, utilizzare 3,5 ml PI e 3,5 ml benzamidina in un volume totale di 350 ml MPIB). </li><li> Preparare solubilization buffer. Liso-fosfatidil glicerolo-14 (GPL) tampone di solubilizzazione (50 mM Tris pH 8, 10% (v / v) di glicerolo, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, inibitori della proteasi (PI) e 4% (w / v) GPL) e maltoside dodecil (DDM) tampone di solubilizzazione (50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) glicerolo, 1 M NaCl, 1 mM DTT, inibitori della proteasi, 4% (w / v) DDM). Buffer può essere sonicata in un bagno di sonicazione (35 W, 40 kHz) per assistere con dispersione del detersivo, ma evitare vortex la miscela, come questo crea bolle. Freddo a 4 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> CFTR buffer di purificazione per la purificazione GPL è Tris 50 mM, 10% (v / v) di glicerolo, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (p / v) GPL-14 e inibitori della proteasi. Preparare 350 ml di questo buffer, e 150 ml dello stesso tampone e 1 M imidazolo. Regolare il pH di entrambi i buffer a 8. </li><li> Il tampone per la purificazione in DDM costituito da 50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) glicerolo, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0.1% (w / v) DDM. Preparare 350 ml di questo buffer, e 150 ml dello stesso tampone e 1 M imidazoLe. Regolare il pH di entrambi i buffer a 8. </li><li> Per la cromatografia a permeazione di gel (GPC) tampone contenente GPL, preparare 50 mM Tris pH 8, 10% (v / v) di glicerolo, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,05% (w / v) GPL-14. Per GPC usando DDM preparare un tampone di 50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) glicerolo, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0.1% (w / v) DDM. Tutti i tamponi e DDH 2 O utilizzati sulla colonna GPC devono essere filtrati (0,2 micron filtro) e degasate prima dell&#39;uso. </li><li> Tampone campione SDS-PAGE (2x la concentrazione di lavoro): 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 5% (v / v) glicerolo, EDTA 5 mM, 0,02% (w / v) di blu di bromofenolo. Rendere 700 microlitri aliquote e conservare a -20 ° C. Prima dell&#39;uso, aggiungere 200 ml di 20% (w / v) di sodio dodecil solfato (SDS) e 100 ml di fresco 0,5 M DTT. Incubare per almeno 10 min con il campione a temperatura ambiente prima di caricare su gel. Non riscaldare; questo denaturare la GFP e può causare CFTR aggregare. </li><li> Per rendere le scorte lipidiche per la ricostituzione, sciogliere un 4:01 (w / w), miscela di E. coli lipidi und in cloroformio e metanolo colesterolo (2:1 v / v), e secca in una fiala di vetro sotto N 2 gas per 2 ore per formare un film lipidico. Aggiungere tampone GPC (senza NaCl) ad una concentrazione lipidica di 40 mg / ml e utilizzare vortex ripetuta e sonicazione (35 W, 40 kHz) per chiarire la soluzione. </li><li> Per il saggio ATPasi, preparare 100x scorte di inibitori ATPasi sciogliendo SCH28080 a 1 mM in DMSO, NaSCN a 1 M in DDH 2 O e oligomicina a 2,5 mM in 100% (v / v) di etanolo. Conservare in aliquote a -20 ° C. Rendere 100 ml di tampone ATPasi con 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NH 4 Cl, 5 mM MgSO 4 e 0,02% (w / v) NaN 3. Questo può essere conservato a temperatura ambiente e utilizzato per diversi saggi. Preparare uno stock di 5 mM ATP immediatamente prima dell&#39;uso e tenere in ghiaccio. (NB Usa Na 2 ATP per evitare un eccessivo segnale di fondo del fosfato nel saggio). Preparare la soluzione di SDS arresto (12% (w / v) di SDS in DDH 2 O). </li><li> Per la rilevazione Chifflet preparare tampone A (3% (w/ V) ascorbato, 0.5% (w / v) molibdato di ammonio, 0,5 M HCl) immediatamente prima dell&#39;uso e tampone B (2% (w / v) citrato di sodio, 2% (w / v) di sodio meta-arsenito, 2% (v / v) di acido acetico). </li></ol> 2. Isolamento di Microsomes lievito <ol><li> S. cerevisiae esprimendo CFTR pollo sono coltivate come descritto in O&#39;Ryan et al. (2012) 14. Conservare il materiale da una fermentazione L 20 in due aliquote a -80 ° C per 6 mesi. </li><li> Scongelare una aliquota di cellule rapidamente e risospendere in 3 ml MPIB refrigerate per grammo di cellule. </li><li> Distruggere le cellule in un mulino a sfere con perle di vetro di 425-600 micron di diametro. Utilizzare cinque periodi 1 min di rottura delle cellule separate da 1 min periodi di riposo. (I periodi di riposo sono essenziali per assicurare che le cellule non sono riscaldate durante l&#39;interruzione.) </li><li> Controllo rottura delle cellule mediante centrifugazione di un campione di 1 ml di lisato cellulare dal mulino a sfere. Centrifuga (12.000 xg, 4 ° C, 5 min) in un centr da bancoifuge. Diluire il surnatante a 1:50 con MPIB in una provetta e misurare la A 380. Se A 380&gt; 0,1, o ha smesso di aumentare, nonostante diversi cicli bead-battenti ripetuti, procedere al passo successivo. In caso contrario, ripetere 2,3-2,4. </li><li> Centrifugare il lisato cellulare totale (12.000 x g, 4 ° C, 20 min). Conservare il surnatante. Eliminare il pellet (contenente cellule intatte e mitocondri), ma se c&#39;è qualche dubbio circa l&#39;efficienza di rottura cella (si veda 2.4), quindi conservare il pellet anche. </li><li> Centrifugare il surnatante della fase precedente (200.000 xg, a 4 ° C, 1,5 hr). Eliminare il surnatante e sospendere nuovamente le membrane microsomiali pellet in tampone CFTR. Se i microsomi sono destinati purificazione utilizzando DDM, integrare il buffer CFTR con 1 M NaCl. </li><li> Ripetere la centrifugazione della frazione di membrana risospeso (100.000 x g, 4 ° C, 1 ora) e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in microsomiun volume minimo di tampone CFTR (volume finale 5-15 ml, proteina microsomiale totale 70-200 mg). Un saggio Bradford può essere utilizzato per determinare la concentrazione totale di proteine ​​microsomiali 25. Inoltre deve essere misurato lo spettro di emissione di fluorescenza delle membrane (eccitazione = 485 nm, emissione = 500-600 nm) e dovrebbe avere un picco di fluorescenza GFP distinta (massimo a 512 nm). CFTR può essere specificamente rilevato su un gel SDS-PAGE, scansionata in condizioni fluorescenza GFP (Figura 1). </li><li> Flash-congelare i microsomi risospeso immergendo in azoto liquido e conservare a -80 ° C, o passare alla Fase 3. </li></ol> 3. Solubilizzazione di Microsomes <ol><li> Se congelato, scongelare microsomi immediatamente prima dell&#39;uso in un bagnomaria regolato a 10 ° C. </li><li> Per la solubilizzazione delle membrane, diluire i microsomi con un volume uguale di tampone di solubilizzazione pertinente (Passo 1.3) per ottenere una concentrazione finale di detersivo2% (w / v) e una proteina microsomiale concentrazione 5 mg / ml. Incubare questa miscela per 1 ora a 4 ° C con agitazione (tubo rotatore). Conservare 200 ml per l&#39;analisi. </li><li> Centrifugare la miscela (100.000 xg, a 4 ° C, 45 min). Rimuovere il surnatante contenente le proteine ​​di membrana solubilizzate, passare attraverso un filtro a siringa da 0,45 micron e memorizzare sul ghiaccio. Misurare la fluorescenza del sovranatante (come al punto 2.8). </li><li> Risospendere frazione insolubile in 1% (w / v) di SDS per un volume corrispondente alla frazione solubile. Misurare la fluorescenza in questa frazione e mantenere una aliquota di 50 microlitri per l&#39;analisi SDS-PAGE. </li></ol> 4. Nickel-affinità Purificazione di CFTR <ol><li> Colonne collegamento due 5 ml di nichel sefarosio in serie. Lavare con 2 volumi di colonna (CV) 20% (v / v) etanolo, seguito da 2 CV DDH 2 O, poi lavare la colonna con 2 CV di tampone di solubilizzazione (Passo 1.4-1.5), contenente 1 M imidazolo. Ripetere con 2 CV di solubilization tampone privo di imidazolo. </li><li> Aggiungere imidazolo ad una concentrazione finale di 5 mM al materiale solubilizzato (Passo 2.8) e caricate manualmente il materiale sulla colonna o in un ciclo campione se si utilizza un dispositivo automatizzato di cromatografia liquida. </li><li> Caricare il materiale solubilizzato sulla colonna ad una velocità di flusso di 0,5 ml / min, e lavare con 2 CV di tampone imidazolo-lacunoso a parità di portata per rimuovere materiale non legato. Raccogliere le frazioni in 50 ml provette Falcon. </li><li> Per il primo lavaggio, utilizzare 3 CV di tampone di purificazione con imidazolo 40 mM ad un flusso di 1 ml / min. Raccogliere 2 ml frazioni. </li><li> Per il secondo lavaggio, utilizzare 3 CV di tampone di purificazione con imidazolo 100 mM. Raccogliere 2 ml frazioni. </li><li> Eluire CFTR dalla colonna HisTrap con 3 CV di tampone depurazione mediante imidazolo 400 mm. Raccogliere 2 ml frazioni. </li><li> Controllo fluorescenza in frazioni eluite (Passo 2.8). </li><li> Conservare le aliquote di frazioni di punta per l&#39;analisi SDS-PAGE. Freeze flash restante picco fcampioni raction e conservare a -80 ° C, o continuano a purificazione prossimo passo. </li></ol> 5. Permeazione di gel Chromatography (GPC) Purificazione di CFTR <ol><li> Equilibrare la colonna (Superose 6 10/300 GL) con 1,2 CV DDH 2 O seguita da 1,2 tampone CV GPC. </li><li> Durante Fase 5.1, concentrare le Ni-affinità frazioni purificate con la massima fluorescenza GFP usando un filtro centrifugo 100.000 MWCO a 4 ° C. Se purificante in DDM, evitare di concentrare l&#39;esempio di sopra di una concentrazione proteica di 0,3 mg / ml di proteine ​​come questo causerà la perdita significativa del campione. Rimuovere il ritentato dal concentratore e centrifugare a 100.000 x g per 30 min a 4 ° C per sedimentare le particelle più grandi. </li><li> Iniettare il campione attraverso la colonna ed eluire con una pendenza isocratica di 1,2 CV buffer di GPC. Raccogliere 0,5 ml frazioni. </li><li> Misurare la fluorescenza GFP come nella sezione 2.8 di identificare quelle frazioni contenenti CFTR. Conservare un piccolo volume (ad es &lt;/ Em&gt; 50 microlitri) di ciascuno per analisi mediante SDS-PAGE. </li><li> Congelare le frazioni in azoto liquido e conservare a -80 ° C. </li></ol> 6. Ricostituzione di CFTR <ol><li> Aggiungere lipidi (passo 1,8) al CFTR purificata ad lipide-to-proteina rapporto 100:1 (w / w) e incubare a 4 ° C per 1 ora. Analogamente impostare un controllo solo lipidi, sostituendo la proteina purificata con lo stesso volume di tampone GPC. </li><li> Rimuovere il detersivo dalla miscela di proteine ​​/ lipidi con perline adsorbenti idrofobiche. Lavare perline adsorbenti in 5 CV DDH 2 O, 5 CV 70% (v / v) etanolo, 5 CV DDH 2 O e 5 tampone CV GPC manca il detersivo. Aggiungere 200 mg di perline adsorbenti lavate per ml di proteina purificata e incubare a 4 ° C per una notte con agitazione. </li><li> Raccogliere il campione di ricostituzione delle perle adsorbenti in una nuova provetta utilizzando un puntale sottile-ended. </li></ol> 7. Misurazione della ATPasi attività <ol><li> Determinare il tasso di CFTATPasi attività specifica-R utilizzando un saggio modificato Chifflet 26,27 in un formato di piastra da 96 pozzetti. Con la soluzione stock di fosfato di sodio (0,65 mm) preparare 0-20 nmol fosfato in un volume finale di 50 microlitri come standard. Utilizzare una miscela 1:1 di tampone CFTR e tampone ATPasi per diluire il brodo fosfato. </li><li> Incubare sia CFTR ricostituito e liposomi bianco con 1:100 (v / v) gli inibitori ATPasi (Passo 1.9) in ghiaccio per 10 min. Utilizzare almeno 5 mg di CFTR ricostituito. </li><li> Aggiungere ATP (Passo 1.9) ad una concentrazione finale di 2 mM e incubare a 25 ° C per 1 ora. Arrestare la reazione aggiungendo 40 ml di 10% (w / v) di SDS (punto 1.9) a ciascun pozzetto (compresi gli standard). </li><li> Aggiungere 100 ml di tampone A (punto 1.10) e incubare per 10 min. Aggiungere 100 microlitri tampone B (1,10) a ciascun pozzetto e misurare l&#39;assorbanza alla lunghezza d&#39;onda di 800 nm in un 96-ben UV / Vis spettrofotometro compatibile piastra. </li><li> Convertire assorbanza a 800 nm in una quantità di fosfato liberato usando l&#39;standard di fosfati. Calcolare il tasso di idrolisi dopo aver sottratto il segnale di fondo (liposomi solo pozzetti). </li><li> Per CFTR non ricostituito seguire lo stesso protocollo utilizzando tampone CFTR per le letture di fondo. </li></ol>

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<li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylglycerol%3A+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+determination+of+inorganic+phosphate+in+the+presence+of+labile+organic+phosphate+and+high+concentrations+of+protein%3A+Application+to+lens+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases.</a> Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).</li>
<li>Rothnie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+cholesterol+in+maintenance+of+P-glycoprotein+activity+and+its+membrane+perturbing+influence%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence.</a> Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari in competizione né altri interessi in conflitto rispetto a questo lavoro.

Abbiamo precedentemente descritto un metodo per la sovraespressione di CFTR murino 14. Dopo la pubblicazione di tale protocollo, abbiamo espresso e purificato diversi ortologhi diversi di CFTR utilizzando lo stesso sistema. Tutti gli ortologhi testati finora purificati bene il detersivo GPL, mentre la purificazione DDM mostrato più variazione tra differenti ortologhi (dati non mostrati). Questa flessibilità illustra la forza dell&#39;approccio lievito: è possibile schermare molti costrutti con relativa rapidità al fine di selezionare uno per uno scopo particolare. Lavare i microsomi lievito con tampone contenente 1 M NaCl prima di solubilizzazione con i risultati DDM in una preparazione microsome più pulita e riduce gli agenti inquinanti in fasi successive. Questo passo è necessario nel protocollo GPL come campione CFTR finale è&gt; 90% puro senza lavaggio microsome. Inoltre, purificazione nel DDM richiede alcune modifiche ai buffer di solubilizzazione unnd purificazione, cioè l&#39;aggiunta di glicerolo oliva e sale. Insieme, queste aggiunte notevolmente aumentato il legame della proteina DDM-solubilizzato alla colonna. La metodologia purificazione DDM ha margini di miglioramento, in particolare alla rimozione di un importante contaminante 40 kDa che, giudicato mediante spettrometria di massa, è dovuto alla subunità ribosomiale L3 lievito, che sembra avere un&#39;affinità intrinseca per la resina nichel. Non c&#39;è polyHis evidente sequenza nella proteina L3, ma l&#39;esame della sua struttura 3D quando si lega al ribosoma (PDB = 1FFK) mostra che la subunità L3 piegato ha un potenziale polyHis cluster. Che questa band è meno problematica in materia GPL-purificato potrebbe essere dovuto al più duro detersivo GPL. Sebbene la purificazione nel DDM sembra essere più povera di quella a GPL, detergenti lievi come DDM può essere più compatibile con analisi funzionali e strutturali e sono già stati utilizzati in vari crystall X-raystudi radiografico delle proteine ​​di membrana 15-21. Inoltre, i nostri risultati hanno indicato che l&#39;uso del GPL porta alla perdita della funzione ATPasi in CFTR relativo alla purificazione in DDM. Quindi si consiglia il protocollo di purificazione a base di GPL per la generazione di CFTR dove la purezza è cruciale, per esempio in applicazioni come la caratterizzazione di modificazioni post-traduzionali, o nella generazione di anticorpi, il protocollo basato GPL-verrebbe scelto . D&#39;altra parte in applicazioni dove è essenziale l&#39;attività e stato completamente nativo della proteina, proponiamo il protocollo basato DDM-come una scelta migliore. Per concludere, questo protocollo descrive un metodo riproducibile per l&#39;isolamento di CFTR nella zwitterionici detersivo GPL-14 o il detergente non ionico DDM. Come tale indica una più ampia gamma di condizioni di depurazione per CFTR che precedentemente sono stati segnalati 10-13. Inoltre milligrammi quantità di CFTR purificata possono essereottenuti mediante questi procedimenti quando combinato con un sistema di crescita del lievito alto volume come un fermentatore 20 L e un sistema di raccolta di cellule di capacità elevata come una L 6 bassa velocità del rotore della centrifuga. Il CFTR ottenuto ha un tag GFP scindibile, che consente un facile monitoraggio della proteina in vari saggi biochimici e biofisici. Il reagente descritto in questo manoscritto (pollo plasmide-CFTR contenenti o cellule di lievito congelate) può essere ottenuto attraverso la Cystic Fibrosis Foundation (USA).

La fibrosi cistica (FC) è la malattia genetica più diffusa in Europa e Nord America, con un&#39;incidenza di circa 1 su 2.500 nati vivi. CF si verifica quando le mutazioni del regolatore transmembrana della fibrosi cistica conduttanza (CFTR) perdita di proteine ​​causa della sua funzione a livello della membrana plasmatica delle cellule epiteliali 1. La conseguenza più grave di questo difetto è un danno polmonare irreversibile, che riduce l&#39;aspettativa di vita dei malati a &lt;40 anni di 2,3 anni. CFTR è un ATP-binding cassette (ABC) trasportatore che si è evoluto per diventare un 1,4 canale ionico. Nonostante la sua funzione abbastanza alterato nella membrana plasmatica delle cellule, mantiene ancora una significativa omologia di sequenza con altri trasportatori ABC. Curiosamente, le parti specializzate di CFTR (cioè la sua regione regolatrice e il suo N-e C-terminali) non condividono rilevante somiglianza di sequenza con altri metazoi ABC trasportatori, quindi non ci sono indizi al secoloe le origini di queste sequenze in CFTR. Sulla base della sua struttura primaria, CFTR è classificato come un membro C-famiglia della famiglia trasportatore ABC, ma non vi è una forte evidenza di un legame funzionale residua a questa sottofamiglia. Ci sono state alcune segnalazioni di attività di trasporto glutatione per CFTR 5-7, che sarebbe coerente con i ruoli degli altri membri della famiglia C-8,9, anche se altri rapporti suggeriscono che il glutatione ridotto può inibire l&#39;attività di CFTR ATPasi, piuttosto che mostrare l&#39; substrato indotta da stimoli che caratterizzano i trasportatori ABC 10. Misurazione della conduttanza ionica è sufficientemente sensibile per consentire l&#39;attività del canale di singole molecole CFTR da studiare 1 e proprietà del canale CFTR è stata monitorata in funzione del tempo, temperatura, concentrazione di ATP, potenziale di membrana, e stato di fosforilazione, nonché nella presenza di una miriade di piccoli inibitori della molecola, potenziatori e modificatori. QuesteGli studi hanno anche aggiunto in modo significativo alla nostra conoscenza di come funzionano trasportatori ABC. Tuttavia, l&#39;espressione di CFTR in quantità significativa e la sua successiva purificazione ha dimostrato di essere particolarmente impegnativo e successo limitato a pochi laboratori 10-13. La necessità di sviluppare farmaci più efficaci è pressante, ma questo processo è stato ostacolato dalla mancanza di CFTR purificato per lo screening di piccole molecole. Risolvere il problema espressione CFTR e purificazione consentirebbe high-throughput screening di farmaci volti a correggere il difetto primario nella FC e sarebbe anche aprire un percorso per studi strutturali ad alta risoluzione per informare la progettazione razionale di farmaci. Inoltre, anche relativamente caratteristiche biochimiche fondamentali della proteina, come lo stato oligomerico funzionale, proteine ​​interagenti e ATPasi rimangono poco caratterizzati. Abbiamo precedentemente riportato un protocollo per l&#39;espressione su larga scala di GFP-e His-tag CFTR murinoin S. cerevisiae 14 e ora descrivere ulteriormente i protocolli per la purificazione della proteina CFTR. Abbiamo usato questi metodi per purificare cinque ortologhi di CFTR e dati presenti per la purificazione di CFTR pollo come esempio. La selezione di detergenti per solubilizzazione e purificazione è un passaggio fondamentale nella purificazione di qualsiasi proteina di membrana. Avendo a screening per la solubilità di CFTR in diversi detergenti, abbiamo scelto due contrastanti detergenti per uso nella purificazione. Dodecil-β-D-maltoside (DDM) è un detergente non ionico che è stato ampiamente utilizzato per entrambi gli studi strutturali e funzionali delle proteine ​​di membrana 15-21. Il detergente ionico 1-tetradecanoyl-sn-glicero-3-fosfo-(1&#39;-rac-glicerolo) (LPG-14) è molto efficace nella solubilizzazione di CFTR ed è stato precedentemente utilizzato nella purificazione di proteine ​​di membrana funzionali 10, 22,23, compreso purificazione della CFTR da S. cerevisiae 24. &lt;/ P&gt;

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu; m filtro siringa&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>FC121</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore centrifugo MWCO 100 kDa (membrana PES)</td><td>Vivaspin</td><td>VS0641</td><td></td></tr><tr><td>Provette microfuge da 2 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.695</td><td></td></tr><tr><td>Rotore 40Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td><a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901">337901</a></td><td></td></tr><tr><td>50 ml provette Falcon sterili</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina trifosfato sale disodico (Na2ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di cromatografia liquida</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td></td></tr><tr><td>Aminoetilbenzensulfonilfluoruro (AEBSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8456</td><td></td></tr><tr><td>Disgregatore cellulare a perle di vetro</td><td>BioSpec</td><td>1107900</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco&nbsp;</td><td>Centrifuga da banco HERMLE</td><td>Z300</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Microfuga da banco</td><td>Fisher</td><td>13-100-511</td><td></td></tr><tr><td>Benzammidina cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>434760</td><td></td></tr><tr><td>Perle idrofobiche SM-2 Adsorbente</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>357000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging su gel</td><td>BioRad</td><td>170-808</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Chimostatina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>E. coli estratto lipidico totale</td><td>Avanti lipidi</td><td>100500</td><td></td></tr><tr><td>Epossisuccinil-leucillamido-butano (E-64)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Perle di vetro, acido lavato</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher</td><td>65017</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP colonne (5 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-05</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Coomassie Stain</td><td>Novexin</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga JA-17 rotore</td><td>Beckman Coulter</td><td>369691</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Merck</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>Lisofatidil glicerolo-14 (LPG)</td><td>Avanti lipidi</td><td>858120</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio gel Sistema SDS-PAGE</td><td>BioRad</td><td>165-8006</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecil-&beta;-D-maltopiranoside (DDM)</td><td>Affymetrix</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>Standard di proteine prestained</td><td>Fermentas</td><td>SM1811</td><td></td></tr><tr><td>Colonne di desalinizzazione (Sephadex G-25)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4265</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetanosulfonilfluoruro (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>SCH28080</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4443</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil solfato di sodio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>Tiocianato di sodio (NaSCN)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251410</td><td></td></tr><tr><td>Filtrazione su gel Colonna 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>Provette per ultracentrifuga</td><td>Coltro Beckman 355618</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>Star Labs</td><td>N2400-0001</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua ad ultrasuoni</td><td></td><td>Ultrawave F0002202</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre multimodale</td><td>BioTek</td><td>BTH1MF</td><td></td></tr></tbody></table>

purificazione della fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana proteina espressa in<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Difetti nel regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) proteine ​​causano fibrosi cistica (CF), una malattia autosomica recessiva che limita l&#39;aspettativa media di vita dei malati a &lt;40 anni di età. Lo sviluppo di molecole di farmaci innovativi per ripristinare l&#39;attività di CFTR è un obiettivo importante nel CF trattamento, e l&#39;isolamento di CFTR funzionalmente attivo è un utile passo verso il raggiungimento di questo obiettivo. Descriviamo due metodi per la purificazione di CFTR da un sistema di espressione eterologo eucariotico, S. cerevisiae. Come sistemi procariotici, S. cerevisiae può essere rapidamente coltivata in laboratorio a basso costo, ma può anche traffico e posttranslationally modificare grandi proteine ​​di membrana. La selezione di detergenti per solubilizzazione e purificazione è un passaggio fondamentale nella purificazione di qualsiasi proteina di membrana. Dopo aver proiettato per la solubilità di CFTR in diversi detergenti, abbiamo scelto due contrasting detergenti per uso nella purificazione che permette la preparazione finale CFTR venga adattata agli esperimenti successivamente pianificati. In questo metodo, forniamo confronto della purificazione di CFTR in dodecil-β-D-maltoside (DDM) e 1-tetradecanoyl-sn-glicero-3-fosfo-(1&#39;-rac-glicerolo) (LPG-14). Proteina purificata in DDM con questo metodo mostra ATPasi in saggi funzionali. Proteina purificata in GPL-14 mostra elevata purezza e resa, possono essere utilizzati per studiare le modificazioni post-traduzionali, e può essere utilizzato per i metodi strutturali come piccolo angolo X-ray scattering e microscopia elettronica. Tuttavia visualizza ATPasi notevolmente inferiore.

Il protocollo descritto sopra è un mezzo efficace per isolare microsomi CFTR arricchito, con quasi totale recupero del CFTR durante la rottura delle cellule e la preparazione dei microsomi greggi (Figura 1). Altri metodi di rottura delle cellule possono anche essere impiegati efficacemente. Abbiamo utilizzato una cella francese pressione, e altri dispositivi high-pressure/cavitation (anche in combinazione con un impatto contro un bersaglio rubino) con uguale efficienza. Per comodità e basso costo iniziale delle attrezzature, troviamo il metodo bead-battere i migliori. Utilizzo di GPL per solubilizzare e purificare proteine ​​CFTR prodotto 80 ug / L coltura a&gt; 90% di purezza (Figura 2). L&#39;alto rendimento è dovuto alla solubilizzazione efficiente di CFTR GPL (confronta Figura 2b, corsie 2 e 4). Inoltre, efficiente e stretto legame alla colonna provocato minima perdita di CFTR della frazione non legata e l&#39;assenza di CFTR nelle frazioni di lavaggio (figura 2, corsie 3, 5, e6). La proteina eluita aveva una purezza&gt; 90%, stimato da Coomassie macchiati gel SDS-PAGE e utilizzando densitometria del CFTR e bande contaminanti. Cromatografia a permeazione di gel (GPC) separato GPL-CFTR purificato da contaminanti a basso peso molecolare (Figura 4, pannello inferiore). Il protocollo di purificazione CFTR utilizzando DDM dà purezza di circa il 60% e la resa di circa 50 mg / L (Figura 3). La microscopia elettronica (EM) di frazioni colorate negativamente dalla GPC eluizione a circa 10 ml (Figura 4) ha mostrato che CFTR DDM-purificato contiene aggregati di diametro 20-30 nm e le particelle più piccole di 10 nm di diametro (dati non mostrati). E &#39;possibile che i piccoli aggregati possono reversibilmente associare e dissociare come ultrafiltrazione con un filtro cut-off 1 MDa omesso di rimuovere gli aggregati EM-rilevabili. Materiale LPG-purificato non assorbire a una griglia incandescente scaricata, quindi è stato studiato da Cryo-EM delle frazioni non colorati. Questo ha dimostratouna popolazione molto omogenea delle particelle di una dimensione relativamente piccola (6-8 nm di diametro, dati non mostrati). Infine, l&#39;attività ATPasi delle proteine ​​purificate è stata misurata (Figura 5). Come membro della famiglia delle proteine ​​ABC, CFTR ha due domini nucleotide-binding (NBDS) in grado di legare e / o idrolisi dell&#39;ATP. I dati indicano che la proteina purificata non era in grado di idrolizzare ATP nello stato GPL-solubilizzato e ha mostrato attività ATPasi debole in presenza di DDM (Figura 5, bar vacanti). Dopo l&#39;aggiunta di lipidi e rimozione detersivo, ATPasi è 4 volte maggiore per campioni che erano stati purificati in DDM (13 nmol ATP / min / mg di proteina). L&#39;aggiunta di lipidi e rimozione di GPL attività simile ripristinato CFTR che era stato isolato utilizzando GPL, ma con un tasso inferiore finale (1,5 nmol ATP / min / mg proteina) rispetto al materiale DDM purificato e ricostituito. <img alt="Figura 1"fo: content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Livelli di monitoraggio di CFTR pollo in lisato cellulare (CL), surnatanti (S) e pellets (P) durante varie fasi di centrifugazione utilizzati per l&#39;isolamento microsome e lavaggio. Gel SDS-PAGE sono state visualizzate utilizzando la fluorescenza in-gel della GFP tag. Il surnatante dopo la rottura delle cellule e centrifugazione a 14.000 xg contiene praticamente tutto il CFTR (compresi i prodotti di degradazione). Ultracentrifugazione a 200.000 xg sedimenti tutto il full-length CFTR lasciando alcuni frammenti nel supernatante. Ultracentrifugazione a 100.000 xg di sale lavato microsomi pellets quasi tutto il CFTR con la rimozione di alcune ulteriori frammenti. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2.jpg" /> Figura 2. Purificazione di CFTR pollo in GPL mediante cromatografia di affinità ione metallo immobilizzato. Frazioni sono state analizzate mediante SDS-PAGE seguita da colorazione con Coomassie (pannello superiore) e rivelazione per fluorescenza del tag GFP (pannello inferiore). Tracks: (1) microsomi. (2) microsomi GPL-solubilizzati. (3) Il materiale non legato. (4) Il materiale insolubile. (5) e (6) 40 e 100 mM imidazolo lavaggi. (7) Materiale eluita con imidazolo 400 mM. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3.jpg" /> Figura 3. Purificazione di CFTR pollo in DDM mediante cromatografia di affinità ione metallo immobilizzato. Frazioni sono state analizzate mediante SDS-PAGE seguita da colorazione con Coomassie. Il pannello a sinistra mostra le frazioni prima di eluizione. Più frazioni di eluizione consecutivi sono mostrati nel pannello a destra con CFTR inindicato da freccia. Frazioni successive sono arricchiti in un contaminante 40 kDa, che è stato identificato mediante spettrometria di massa come proteina ribosomiale L3. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4.jpg" /> Figura 4. Purificazione di CFTR pollo mediante cromatografia a permeazione di gel. CFTR purificato mediante cromatografia Ni-affinità è stata concentrata e applicata a una colonna GPC. Il profilo di eluizione per CFTR (pannello superiore) purificato in tampone contenente GPL-14 (linea continua) o DDM (linea tratteggiata) sono sovrapposti. SDS-PAGE (pannello inferiore) ha rivelato che CFTR eluito tra 8 e 11 ml. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5.jpg" /> Figura 5. ATPasi activitY di frazioni purificate CFTR pollo. proteina purificata in DDM o GPL è stata saggiata usando un saggio modificato Chifflet 26 in presenza di un cocktail di inibitori ATPasi di eliminare qualsiasi sfondo ATPasi da F-, P-e V-ATPasi di tipo (bar vacanti ). Il tasso di idrolisi dell&#39;ATP è stata misurata anche dopo la rimozione del detersivo e l&#39;aggiunta di lipidi (barre piene). Il grafico mostra la media e la deviazione standard (n = 3). Le differenze tra i valori medi per ATPasi in presenza e assenza di lipidi, e differenza tra attività DDM e GPL sono significativi per p &lt;0,05.

Espressione eterologa e purificazione del regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) sono sfide importanti e fattori limitanti per lo sviluppo di terapie farmacologiche per la fibrosi cistica. Questo protocollo descrive due metodi per l&#39;isolamento di quantitativi milligrammo di CFTR adatti per studi funzionali e strutturali.

Purificazione della fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana proteina espressa in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare grandi quantità di regolatore della conduttanza transmembranosa della fibrosi cistica, o proteina CFTR. Questo risultato viene ottenuto innanzitutto tramite la sovraespressione eterologa della proteina CFTR di pollo in Charmy visi. Il secondo passaggio consiste nell'alterare le cellule di lievito e isolare la frazione microsomale accumulata.Successivamente, il CFTR viene solubilizzato e purificato. L'ultimo passaggio consiste nel misurare la velocità di idrolisi dell'a TP da parte della proteina purificata al fine di valutare se questa mantiene la sua funzionalità. In definitiva, la sovraespressione in s visi consente la produzione di CFTR altamente puro e funzionalmente attivo in quantità dell'ordine del milligrammo.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'espressione in linee cellulari di mammifero, è che i lieviti sono facili, rapidi ed economici da coltivare in laboratorio. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande fondamentali nel campo della fibrosi cistica, poiché la proteina purificata può essere impiegata per studiare le interazioni tra farmaci attualmente in fase di sviluppo e la proteina CFTR o addirittura per cercare nuovi farmaci. Questo metodo può fornire informazioni dettagliate sulla purificazione di CFTR ed è inoltre applicabile ad altre proteine di membrana difficili da esprimere e purificare.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà poiché la CFTR viene rapidamente degradata dagli enzimi proteolitici nel lievito e tende ad aggregarsi in soluzione. In questo protocollo, la CFTR di pollo verrà purificata da una precedente congelazione di cellule S SEI. Le procedure per la coltivazione e il recupero delle cellule S SEI esprimenti CFTR sono illustrate in un precedente articolo di JoVE.I microsomi vengono isolati dalle cellule di lievito come descritto nel manoscritto allegato, quindi risospesi in un volume minimo di tampone CFTR compreso tra cinque e quindici millilitri. Un saggio di Bradford può essere utilizzato per determinare la quantità totale di proteine microsomiali, che dovrebbe essere compresa tra 70 e 200 milligrammi, e lo spettro di emissione della fluorescenza delle membrane dovrebbe presentare un picco distinto di fluorescenza GFP. Per la solubilizzazione e la purificazione di C-F-T-R-D-D-M-A verranno utilizzati due detergenti contrastanti: un detergente non ionico LPG 14 e un detergente ionico.Preparare in anticipo i tamponi appropriati seguendo il protocollo descritto nel manoscritto per solubilizzare le membrane. Diluire i microsomi con un volume uguale del tampone di solubilizzazione appropriato per ottenere una concentrazione finale di detergente del 2% e una concentrazione proteica microsomiale di cinque milligrammi per millilitro. Incubare questa miscela per un'ora a quattro gradi Celsius con agitazione.Dopo un'ora, centrifugare la miscela a 100.000 ×g e a 4 gradi Celsius per 45 minuti. Rimuovere e conservare il soprannatante contenente le proteine di membrana solubilizzate.Risospendere il frazionamento insolubile in una soluzione di SDS al 1% fino a raggiungere un volume pari a quello del frazionamento solubile. Misurare la fluorescenza in questo frazionamento e conservare un'equivalente di 50 microlitri per l'analisi tramite elettroforesi SDS-PAGE. Per iniziare la procedura di purificazione per affinità al nichel della CFTR, collegare in serie colonne di Nickel Spheros da cinque millilitri; lavare con due volumi di colonna (CV) di etanolo al 20%, seguiti da due CV di acqua distillata deionizzata. Successivamente, lavare con due CV di buffer di solubilizzazione contenente un molar di MiaSole, seguiti da due CV di buffer di solubilizzazione privo di midsole.Aggiungere MiaSole a una concentrazione finale di cinque millimolari al materiale solubilizzato e caricare il materiale in un loop campione di un dispositivo di cromatografia liquida automatizzato dopo due lavaggi con tampone privo di ole. Per rimuovere il materiale non legato, lavare la colonna con tre CV di tampone di purificazione contenente 40 millimolari di ole a una velocità di flusso di un millilitro al minuto. Raccogliere questa frazione in un tubo da 50 millilitri.Per il secondo lavaggio, utilizzare tre CV di tampone di purificazione con 100 millimolar ole. Raccogliere frazioni da due millilitri in una piastra a 96 pozzetti. Eluire CFTR dalla colonna hiss trap con tre CV di tampone di purificazione contenente 400 millimolar ole. Raccogliere frazioni da due millilitri in una piastra a 96 pozzetti, monitorare la fluorescenza nelle frazioni eluite e conservare aliquote delle frazioni di picco.Per l'analisi mediante elettroforesi SDS-PAGE, i campioni delle frazioni residue dei picchi verranno utilizzati per il successivo passaggio di purificazione. Iniziare questa procedura equilibrando la colonna con 1,2 volumi di colonna di acqua distillata deionizzata, seguiti da 1,2 volumi di colonna di tampone per cromatografia di permeazione su gel o tampone GPC mentre la colonna è in fase di equilibrazione. Concentrare le frazioni purificate mediante affinità per il nichel con la più alta fluorescenza GFP utilizzando un filtro centrifugo con cutoff di peso molecolare di 100.000 chilodalton a quattro gradi Celsius.Se la purificazione viene eseguita in DDM, evitare di concentrare il campione a una concentrazione proteica superiore a 0,3 milligrammi per millilitro, poiché ciò causerebbe una perdita significativa del campione. Trasferire il RENATE dai concentratori in provette da centrifuga e centrifugare a 100.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius per ottenere un pellet di particelle grandi. Iniettare questo campione sulla colonna equilibrata ed eluire con un gradiente isocratico di 1,2 CV di buffer GPC.Raccogliere frazioni da 0,5 millilitri. Misurare la fluorescenza della GFP per identificare le frazioni contenenti CFTR. Conservare un piccolo volume di ciascuna frazione per l'analisi mediante elettroforesi SDS-PAGE al fine di reconstituire CFTR.Aggiungere lipidi al CFTR purificato. Aggiungere un rapporto lipidi su proteina di 100 a uno. Analogamente, preparare un controllo contenente solo lipidi.Sostituire la proteina purificata con lo stesso volume di tampone GPC. Incubare entrambi i campioni a quattro gradi Celsius per un'ora. Successivamente, rimuovere il detergente dalla miscela proteina-lipidi utilizzando perle assorbenti idrofobiche.Utilizzare 200 milligrammi di perle adsorbenti prelavate per millilitro di proteina purificata e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte con agitazione delicata; il giorno seguente, raccogliere il campione di ricostituzione dalle perle adsorbenti in una provetta pulita utilizzando una punta di pipetta sottile. L'attività specifica di APAs del CFTR ricostituito viene misurata mediante un saggio Chile modificato in formato piastra a 96 pozzetti; come standard, utilizzare da zero a 20 nanomoli di fosfato di sodio diluiti in una miscela uno a uno di tampone CFTR e tampone APAs. Incubare sia il CFTR ricostituito che i liposomi bianchi con da uno a 100 inibitori di APAs sul ghiaccio per 10 minuti.Utilizzare almeno cinque microgrammi di CFTR ricostituito. Trasferire i campioni nella piastra a 96 pozzetti e aggiungere un TP fino a una concentrazione finale di due millimolari; incubare a 25 gradi Celsius per un'ora. Dopo un'ora, arrestare la reazione aggiungendo 40 microlitri di SDS al 10% in ogni pozzetto.Successivamente, aggiungere 100 microlitri di tampone A in ogni pozzetto e incubare per 10 minuti. Quindi aggiungere 100 microlitri di tampone B in ogni pozzetto e misurare l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 800 nanometri utilizzando un spettrofotometro UV-vis compatibile con piastre a 96 pozzetti. Trasporre i dati di assorbanza in una nuova tabella.Convertire l'assorbanza a 800 nanometri nella quantità di fosfato liberato utilizzando gli standard di fosfato e calcolare la velocità di idrolisi dell'ATP seguendo i passaggi indicati. Il protocollo dimostrato in questo video rappresenta un metodo efficiente per isolare microsomi arricchiti in CFTR con un recupero quasi completo del CFTR durante la rottura cellulare e la preparazione dei microsomi grezzi. Questa immagine di un gel SDS-PAGE mostra i livelli di CFTR del pollo monitorati mediante fluorescenza in gel di un marcatore GFP durante vari passaggi di centrifugazione utilizzati per l'isolamento e il lavaggio dei microsomi.CL indica il lisato cellulare, S indica i soprannatanti e P indica i pellet. Il soprannatante dopo la rottura cellulare e la centrifugazione a 14.000 × g contiene virtualmente tutta la CFTR, inclusi i prodotti di degradazione; la ultracentrifugazione a 200.000 × g sedimenta tutta la CFTR a lunghezza intera, lasciando alcuni frammenti nel soprannatante; ultracentrifugazione a 100.000 × g di pellet di microsomi lavati con sale.Quasi tutto il CFTR con la rimozione aggiuntiva di alcuni frammenti; la purificazione del CFTR di pollo in LPG 14 mediante cromatografia di affinità con ioni metallici immobilizzati ha prodotto 80 microgrammi di proteina per litro di coltura con una purezza superiore al 90%. Il pannello superiore mostra le frazioni analizzate mediante elettroforesi su SDS-PAGE, seguita da colorazione con Coomassie. Il pannello inferiore mostra le stesse frazioni rilevate mediante fluorescenza del marcatore GFP.Il rendimento elevato era dovuto alla solubilizzazione efficiente del CFTR da parte di LPG 14, come indicato dal confronto tra la corsia due, caricata con microsomi solubilizzati in LPG, e la corsia quattro, caricata con materiale insolubile. Inoltre, un legame efficiente e stretto alla colonna ha determinato una perdita minima di CFTR nella frazione non legata mostrata nella corsia tre e l'assenza di CFTR nelle frazioni di lavaggio rappresentate dalle corsie cinque e sei. La proteina eluita presentava una purezza superiore al 90%, stimata mediante gel SDS-PAGE colorati con Coomassie e mediante citometria delle bande di CFTR e delle bande di contaminanti.Purificazione del CFTR di pollo. Mediante cromatografia di affinità con ioni metallici immobilizzati in DDM si è ottenuto circa 50 microgrammi di proteina per litro di coltura con una purezza di circa il 60%. Questa figura mostra le frazioni analizzate mediante elettroforesi SDS-PAGE seguita da colorazione con Coomassie, con le frazioni precedenti l'eluzione a sinistra e diverse frazioni consecutive di EEU a destra.CFTR è indicato dalla freccia in un secondo momento. Le frazioni sono arricchite da un contaminante di 40 chilodalton, che è stato identificato mediante spettrometria di massa come la proteina ribosomica L3. Il CFTR di pollo purificato in LPG-14 o in DDM mediante cromatografia di affinità con ioni metallici immobilizzati è stato ulteriormente purificato mediante cromatografia di permeazione in gel.Il profilo eluciano della CFTR purificata in un tampone contenente LPG 14 è rappresentato dalla linea continua. Mentre il profilo Ian della CFTR purificata in un tampone contenente DDM è rappresentato dalla linea tratteggiata, l'elettroforesi in gel SDS ha rivelato che la CFTR purificata con LPG, indicata dalla freccia, si è eluita tra gli otto e gli undici millilitri. Inoltre, la cromatografia a permeazione su gel ha separato la CFTR purificata con LPG da contaminanti a basso peso molecolare. Infine, è stata misurata l'attività APA delle proteine purificate.I risultati indicano che la proteina purificata non è stata in grado di idrolizzare l'ATP nello stato solubilizzato con LPG e ha mostrato un'attività APAs debole in presenza di DDM dopo l'aggiunta di lipidi e la rimozione del detergente. L'attività APAs è risultata quattro volte maggiore nei campioni purificati in DDM: 13 MATP al minuto per milligrammo di proteina. L'aggiunta di lipidi e la rimozione del LPG hanno ripristinato in modo simile l'attività al CFTR che era stato isolato utilizzando LPG, ma con un tasso finale inferiore rispetto al materiale purificato con DDM e recostituito: 1,5 MLEs ATP al minuto per milligrammo di proteina, una volta ottimizzato.Questa tecnica può essere completata in due giorni se eseguita correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di mantenere i campioni sempre sul ghiaccio dopo averla iniziata. Altri metodi, come la stabilità termica, la microscopia elettronica e la diffusione a piccolo angolo dei raggi X, possono essere utilizzati per rispondere ad ulteriori domande riguardo alla struttura e alla stabilità della proteina.Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea chiara di come esprimere e purificare grandi quantità di proteina CFTR.

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