Determinazione del locomotore attività spontanea in
10 aprile 2014
Drosophila melanogaster sono utili per studiare le manipolazioni genetiche o ambientali che influenzano i comportamenti come l'attività locomotoria spontanea. Qui si descrive un protocollo che utilizza il monitor con raggi infrarossi e software di analisi dei dati per quantificare l'attività locomotoria spontanea.
L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare l'attività locomotoria spontanea delle mosche della frutta. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo e invecchiando le mosche sperimentali. Il secondo passaggio consiste nell'impostare monitor di popolazione in un incubatore a temperatura controllata e scaricare il software appropriato.
Successivamente, le mosche vengono trasferite in provette di vetro e quindi posizionate all'interno di monitor di popolazione, dove vengono eseguiti i monitoraggi dell'attività. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare i dati. In definitiva, i monitor di popolazione vengono utilizzati per evidenziare le differenze nell'attività fisica spontanea delle mosche.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'asse geografico negativo, è che consente una registrazione continua semplice, affidabile e oggettiva dell'attività fisica spontanea di diverse popolazioni di moscerini. Questo metodo può aiutarci a determinare come diverse manipolazioni influenzino i moscerini. A dimostrazione della procedura, interverrà Suzanne Kowski, assistente di laboratorio di un laboratorio. Per iniziare, preparare il terreno di coltura seguendo i passaggi indicati nel protocollo testuale allegato e lasciarlo raffreddare con un mescolamento costante su un agitatore riscaldato.
Aliquotare cinque millilitri di cibo in ciascun vial di vetro stretto, assicurandosi che la quantità di cibo sia al di sotto dell'anello più basso della popolazione. Monitorare dopo che il cibo si è raffreddato a temperatura ambiente. Coprire i vial con tappi di spugna e mantenerli a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane.
Riscaldare le provette a temperatura ambiente prima dell'uso. Successivamente coltivare le mosche Canton S in provette di plastica con alimento standard da laboratorio. Mantenere le provette in una camera controllata per temperatura e umidità a 25 gradi Celsius con un ciclo luce/buio di 12 ore.
Rimuovere le mosche adulte chiare dalle provette al mattino. Quindi separare le mosche appena emerse per sesso su un tappetino di anidride carbonica entro otto ore dall’emergenza, per garantire che le femmine siano vergini. Preparare 10 provette di mosche parentali posizionando maschi e femmine vergini di età compresa tra cinque e dieci giorni.
Insetti in un vial standard con alimento e alcuni granelli di lievito. Mantenere gli insetti in un incubatore a 25 gradi Celsius con un ciclo luce/buio di 12 ore per due giorni. Trasferire gli insetti in un nuovo vial di plastica ogni due giorni e mantenere i vial con le uova prodotte in un incubatore a 25 gradi Celsius.
Quindi, eliminare gli insetti raccolti il primo giorno e riposizionare i vial nell'incubatrice per ottenere una popolazione di moscerini maggiormente sincronizzata il secondo giorno. Successivamente, su un tappetino a anidride carbonica, raccogliere rapidamente 25 moscerini maschi e 25 femmine per ogni vial utilizzando un cucchiaio metallico entro 24 ore. Riportare sul vial il giorno dell'ELO.
Preparare almeno cinque provette replicate per ciascun gruppo sperimentale e di controllo. Mantenere le provette in camere ambientali a temperatura controllata a 25 gradi Celsius con un ciclo luce/buio di 12 ore.
Passare le mosche in un nuovo flacone di plastica ogni due giorni per 10 giorni. Utilizzando un imbuto, posizionare i monitor di popolazione in un incubatore con temperatura controllata. Successivamente, collegare ciascun monitor a un'unità di interfaccia di alimentazione (PSIU) tramite un cavo telefonico a quattro fili e un divisore a cinque vie.
Quindi collegare il cavo telefonico al PSIU. Collegare il PSIU a una presa di corrente da 100 a 240 volt e inserire il connettore di uscita dell'alimentatore in una delle prese di accoppiamento del PSIU. Successivamente, scaricare il software USB utilizzato dal PSIU per creare un collegamento dati tra il programma del computer e il PSIU e i monitor di attività.
Avviare il programma. Quindi, nelle preferenze, selezionare la porta seriale PSIU per Macintosh.
Quindi selezionare l'intervallo di lettura. Successivamente, selezionare i monitor in base al loro numero identificativo del produttore. Selezionare il campo di monitoraggio corrispondente ai numeri assegnati ai monitor.
Verificare che tutti i monitor siano correttamente collegati osservando la spia verde. Una spia rossa indica che la connessione è stata persa. Una scatola nera indica che il sistema è spento o che la connessione USB non è stata stabilita correttamente.
Separare moscerini maschi e femmine della stessa età. Su un tappetino a base di anidride carbonica, posizionare 10 moscerini maschi e 10 femmine in provette di vetro separate a temperatura ambiente.
Utilizzare almeno tre fiale per ogni linea sperimentale e di controllo e per ciascun sesso di moscerini, tenendo le fiale di lato fino a quando i moscerini non si riprendono dall'anidride carbonica, per evitare che rimangano intrappolati nel cibo. Lasciarli riposare per due ore a temperatura ambiente per consentire il recupero dall'ossido di carbonio. Successivamente, posizionare le fiale all'interno della popolazione.
Monitoraggi ospitati negli incubatori. Trasferire le mosche dopo tre o quattro giorni in nuove provette per evitare che il cibo si secchi. Al termine dell'esperimento, analizzare i dati per eliminare letture duplicate e verificare che le registrazioni siano complete.
Utilizzando la scansione del file 110 x, selezionare l'intervallo per la raccolta dei dati e scartare i dati raccolti entro le prime 24 ore nel periodo di tempo selezionato. Il programma invierà al computer il conteggio totale corrente per ciascun monitor e ricomincerà a contare da zero. Successivamente, scegliere un nome sperimentale e copiare i file dalla cartella dati del computer per salvare i dati.
Iniziare l'analisi dei dati copiando attentamente i dati raccolti nei file di testo in colonne di fogli di calcolo Excel. Calcolare quindi l'attività totale all'interno di un periodo di tempo desiderato per ciascun monitor, rappresentante la somma dell'attività raccolta a tre altezze diverse dei fasci infrarossi. Infine, determinare l'attività locomotoria media e la deviazione standard tra i tre monitor, che rappresentano tre repliche biologiche, utilizzando il test t di Student a due code.
L'attività locomotoria spontanea nei drosophila dipende dal sesso della mosca e dal ciclo luce-buio. Come dimostrato da questo grafico dell'attività media di mosche maschio e femmina, la freccia indica la transizione dalla luce al buio. Dove si osserva una diminuzione dell'attività, l'attività totale delle mosche maschio di 20 giorni aumenta quando viene somministrata metà della quantità di cibo standard in una dieta ipocalorica, rispetto alla riduzione dell'attività delle mosche su una dieta ipercalorica.
Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come determinare l'attività fisica spontanea di Drosophila. Questo metodo è utile per stabilire in che modo diverse manipolazioni genetiche o ambientali influenzano l'attività dei moscerini.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per quantificare l'attività locomotoria spontanea in Drosophila melanogaster. Utilizzando monitor a fascio infrarosso e software di analisi dati, i ricercatori possono misurare efficacemente l'attività fisica delle mosche della frutta in condizioni controllate.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia del comportamento
- Genetica
Sfondo
- Drosophila melanogaster è utilizzato come organismo modello per lo studio del comportamento.
- Comprendere l'attività locomotoria può fornire informazioni sulle influenze genetiche e ambientali.
- La tecnologia di monitoraggio a infrarossi consente un tracciamento preciso dell'attività.
- L'analisi dei dati è fondamentale per interpretare i modelli locomotori.
Scopo dello studio
- Quantificare l'attività locomotoria spontanea nei moscerini della frutta.
- Valutare l'impatto di fattori genetici e ambientali sul comportamento.
- Fornire un protocollo standardizzato per i ricercatori del settore.
Metodi Utilizzati
- Raccolta e invecchiamento di Drosophila melanogaster per esperimenti.
- Allestimento di monitor per popolazioni in un incubatore a temperatura controllata.
- Trasferimento delle mosche in provette di vetro per il monitoraggio.
- Esecuzione dei monitor di attività e analisi dei dati raccolti.
Risultati principali
- I monitoraggi delle popolazioni quantificano efficacemente le differenze nell'attività locomotoria.
- L'analisi dei dati rivela informazioni sui livelli di attività fisica spontanea.
- I risultati possono orientare futuri studi sul comportamento e sulla genetica.
- Il protocollo è riproducibile e applicabile a diverse configurazioni sperimentali.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un approccio affidabile per lo studio dell'attività locomotoria nei moscerini della frutta.
- Comprendere questi comportamenti può migliorare la conoscenza delle interazioni genetiche e ambientali.
- Il protocollo può essere adattato a diverse esigenze di ricerca in neuroscienze e biologia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione dell'attività locomotoria spontanea in Drosophila melanogaster fornisce un indicatore oggettivo e scalabile per valutare l'influenza di fattori genetici e ambientali sul comportamento, supportando la validazione precoce di bersagli nella ricerca neuroscientifica e sulle malattie metaboliche. Questo metodo consente una riduzione del rischio meccanicistica collegando gli esiti fenotipici alla modulazione di vie biologiche, offrendo una previsione affidabile nei flussi di identificazione dei composti promettenti. La sua riproducibilità e la capacità di monitoraggio continuo lo posizionano come piattaforma biomarker traslazionale per la validazione di modelli preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche misurando l'attività fisica spontanea come parametro funzionale dell'integrità delle vie neurali e metaboliche.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico attraverso una quantificazione oggettiva e continua del comportamento locomotorio in diverse condizioni genetiche e ambientali.
- Valore predittivo: Facilita la selezione di progetti identificando composti o manipolazioni genetiche che alterano in modo significativo i modelli di attività, indicando un'effettiva interazione con il bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive, stabilendo profili di attività locomotoria di base in condizioni controllate.
- Riproducibilità: Fornisce output standardizzati e quantitativi mediante il monitoraggio con fasci infrarossi, consentendo una valutazione affidabile dei composti tra ripetizioni.
- Scalabilità: Consente il monitoraggio multiplo e parallelo in diversi vial per la valutazione ad alto rendimento di interventi farmacologici o genetici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella stati patologici umani valutando i cambiamenti della locomozione in manipolazioni genetiche che imitano disturbi neurologici o metabolici.
- Continuità traslazionale: Collega i fenotipi comportamentali della fase di scoperta alla validazione preclinica attraverso metriche di attività continue e quantificabili.
- Decisioni basate sul rischio: Guida i criteri di avanzamento correlando le variazioni dell'attività con la modulazione del bersaglio, riducendo i falsi positivi nell'ottimizzazione dei composti promettenti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio fino all'identificazione del composto promettente e alla validazione preclinica, fornendo un endpoint comportamentale che collega l'approfondimento meccanicistico con l'esito fenotipico.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi e la validazione degli obiettivi quantificando come le variazioni genetiche o indotte da farmaci influenzino l'output locomotorio spontaneo.
- Screening: Permette la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso un monitoraggio continuo dell'attività multi-parametrica in popolazioni di moscerini.
- Analisi: Genera misurazioni quantitative di variabili dipendenti (attività totale, deviazione standard) che consentono il confronto statistico tra condizioni sperimentali mediante analisi t-test.
- Ricerca traslazionale: Si allinea allo sviluppo di biomarcatori collegando i cambiamenti nell'attività locomotoria a perturbazioni genetiche o metaboliche sottostanti rilevanti per i modelli di malattie umane.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma di screening comportamentale riutilizzabile in diversi progetti di ricerca nel campo delle neuroscienze, del metabolismo e dell'invecchiamento.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica attraverso la misurazione diretta dell'attività fisica spontanea come ancoraggio fenotipico.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità mediante monitoraggio infrarosso calibrato e flussi di analisi dati definiti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati comportamentali precoci e quantificabili che riducono l'attrito biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio identificando interventi con effetti significativi e riproducibili sull'output locomotorio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella gestione di Drosophila, nell'allestimento di saggi comportamentali e nei sistemi di monitoraggio a infrarossi.
- È dipendente da monitor per popolazioni, interfaccia PSIU, incubatori con controllo della temperatura e software per l'acquisizione dei dati.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di invecchiamento delle mosche, di separazione per sesso e di preparazione dei vial.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi background genetici, condizioni dietetiche e trattamenti farmacologici.
- Comprende limitazioni pratiche come l'essiccamento del cibo nel tempo e la necessità di trasferimenti periodici dei vial per mantenere l'integrità dei dati.
