Name: Eterotopico mucosa engrafting Procedura di Drug Delivery diretto al cervello nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Scopri la procedura di innesto eterotopico della mucosa nasale per la somministrazione diretta di farmaci al cervello nei topi. Questo metodo innovativo supera la barriera ematoencefalica per migliorare il delivery di terapeutici ad alto peso molecolare.

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Questo studio è stato finanziato dalla Fondazione Mcihael J. Fox per la ricerca 2011 Rapid Response Innovations di Parkinson Awards Program. I finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l&#39;analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

Prima dell&#39;intervento assicurarsi tutte le procedure da fare sono approvati dalla IACUC e qualsiasi autorità etiche o giuridiche addizionali e utilizzare crudeli pratiche di trattamento degli animali. Questo include l&#39;utilizzo di condizioni di chirurgia sterili, anestetizzare il mouse utilizzando IACUC metodo approvato, lubrificanti occhi topi con vet unguento durante l&#39;intervento chirurgico, e fornire assistenza post-chirurgica. Non procedere con la chirurgia se c&#39;è qualche problema se aspetti della procedura sono approvati. Tutte le procedure eseguite nel presente documento sono state approvate dalla Università Institutional Animal Care ed uso comitato di Boston. 1. Preparazione degli animali e Forniture chirurgici <ol><li> Autoclavare tutto strumento chirurgico che verrà utilizzato durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Assicurarsi che tutte le tecniche che devono essere eseguite sono approvati dalle agenzie di regolamentazione degli animali. </li></ol> 2. Raccolta della mucosa Graft <ol><li> Ha scelto un topo geneticamente identico di età simile comeil mouse sperimentale e eutanasia in un metodo approvato IACUC (qui: asfissia isoflurane seguita da dislocazione cervicale). </li><li> Utilizzando forbici chirurgiche, togliere la pelle intorno alla regione nasale della testa del mouse esporre il cranio. </li><li> Con un martello pneumatico, volume con tre linee di cui due laterali fiancheggiano la regione nasale e un terzo in linea con gli occhi che collega le due linee perpendicolarmente. </li><li> Drill-down ventralmente al fine di separare il setto nasale dal tessuto circostante. Un percorso più ampio eviterà danni alla membrana mucosa tuttavia sarà anche rendere più difficile isolare la membrana. Si raccomanda un taglio stretto vicino al linea mediana. </li><li> Usare le forbici per tagliare il setto libero da qualsiasi tessuto aderito ad essa e conservarla in una soluzione salina sterile. A questo punto l&#39;innesto può essere pulito per rimuovere qualsiasi tessuto collegato. La situazione ideale è avere membrane mucose integre esposti su entrambi i lati del setto cartilagine. Uno grpoppiera può fornire membrana per due topi disponibile la superficie della membrana è sufficiente a coprire i siti craniotomia. Si raccomanda che l&#39;innesto viene utilizzato il più rapidamente possibile e il ricercatore procede alla fase 3 non appena l&#39;innesto è isolato. </li></ol> 3. Impianto chirurgico di innesto mucoso <ol><li> Utilizzo di procedure standard, asettiche murini chirurgici, anestetizzare e montare un topo nella cornice stereologica. Utilizzare circa il 2% isoflurano in ossigeno puro utilizzando una macchina di anestesia roditore. </li><li> Immobilizzare il mouse in un apparato stereotassico con orecchio bar e un supporto naso. Applicare una pomata oftalmica per gli occhi e strofinare il cuoio capelluto con Betadine e il 75% di etanolo per tre turni. Utilizzando sia le forbici o un regolatore dei capelli, rimuovere il pelo sulla testa. Esporre il cranio con una lametta e livellare la testa. Eseguire una craniotomia sopra la posizione del cervello che verrà dosato. Per esempio, quando il targeting striato tagliare un 1,25 millimetridiametro del foro circolare nel cranio (centrato a AP: 1,00 mm, ML: 0,88 mm) utilizzando un martello pneumatico. Bagnare la zona forata con soluzione fisiologica sterile e utilizzare una lama di rasoio per rimuovere il cranio. </li><li> Rimuovere con cautela la dura con la punta di un ago. Inoltre, questo può essere realizzato applicando una quantità minima di tessuto adesivo alla superficie durale umida. Una volta che questo strato è indurito, il movimento laterale con una punta lametta può essere usato per rimuovere la membrana. </li><li> Posizionare la membrana mucosa al di sopra della superficie del cervello avendo cura estrema per mantenere il lato epiteliale rivolto lontano dalla ferita. Questo è fatto meglio trasferendo l&#39;intero setto sulla superficie del cranio adiacente al sito craniotomia con le pinzette. Con la punta di un paio di forbici chirurgiche, tirare fuori la membrana della cartilagine e sulla superficie del cranio e cervello. Non lasciate che la membrana asciugare o toccare con qualsiasi materiale assorbente. L&#39;innesto dovrebbe generosamente sovrapporsi tutti i bordi ossee del craniotomia site. </li><li> Coprire l&#39;innesto con un pezzo sterile di nitrile. Questo agisce per impedire l&#39;adesione della pelle per l&#39;innesto durante la guarigione. Il nitrile deve essere abbastanza grande da coprire l&#39;intera membrana mucosa. Tagliare eccessivo membrana se necessario. Evitare qualsiasi movimento del nitrile una volta entrato in contatto con l&#39;innesto. </li><li> Chiudere la pelle con un running 5-0 sutura sterile e lasciare il mouse recuperare per 3-7 giorni prima di procedere alla fase successiva. Fare attenzione a non perturbare la barriera nitrile o l&#39;innesto di mucosa durante la chiusura della pelle. </li></ol> 4. Amministrazione di dosaggio Soluzione <ol><li> Dopo aver assicurato il topo anestetizzato nel frame stereotassico, tagliare la sutura con le forbici e togliere la pelle in eccesso intorno al cranio. </li><li> Rimuovere la barriera nitrile e pulire la superficie del cranio. Usare tamponi salini e cotone sterile per pulire la zona fino a quando l&#39;innesto è visibile. Può essere necessario tagliare l&#39;innesto con un rasoio se ha assunto dimensioni desired superficie. </li><li> Se l&#39;esperimento sarà più lungo di un paio di giorni, è saggio impiantare almeno due viti cranio a rafforzare l&#39;impianto testa. </li><li> Posizionare il ben sopra l&#39;innesto in modo che i bordi sono in contatto con il cranio. Applicare l&#39;adesivo cianoacrilato all&#39;incrocio tra il bene e il cranio. Riempire il pozzetto con soluzione salina sterile e verificare che non vi siano perdite. Wells sono costituiti da aghi di siringa taglio. </li><li> Applicare cemento osseo sul cranio per fissare il bene in posizione. </li><li> Rimuovere la soluzione fisiologica dal pozzo con una pipetta. Lavare le ben diverse volte per verificare che l&#39;adesivo non è trapelato trovi Aggiungi la soluzione desiderata; in questo caso viene utilizzato 50 ml di destrano fluorescente. Si prevede che i composti idrosolubili di una polarità simile si comportano come destrano. Consegna di composti idrofobi o sospensione non è stato esplorato con questo metodo. </li><li> Chiudere la parte superiore del pozzo utilizzando un pezzo circolare di nitrile fissato altop con cianoacrilato. Controllare che l&#39;adesivo non venga a contatto con il contenuto dei pozzetti. </li></ol> 5. Analisi dei Transmucosal consegna <ol><li> Dopo la quantità desiderata di tempo è passato, anestetizzare il mouse e scambiare il contenuto dei pozzetti con una soluzione di colorante blu di Evan. Questo colorante è utilizzato per verificare che l&#39;innesto era intatto. </li><li> Dopo 30 minuti, anestetizzare il mouse pesantemente, rimuovere la soluzione colorante, e eutanasia mediante decapitazione. </li><li> Rimuovere manualmente l&#39;impianto e rimuovere il cervello con le forbici chirurgiche. Fare attenzione a tenere l&#39;innesto in posizione. </li><li> Una volta rimosso, Flash-congelare il cervello in una soluzione di isobutano raffreddata in un bagno di ghiaccio secco. </li><li> Incorporare il cervello in Ottimale taglio Temperatura soluzione (OCT) e la fetta a 50 micron. </li><li> Collocare le fette desiderati direttamente su un vetrino da microscopio. </li><li> Immagine della sezione utilizzando un microscopio a fluorescenza non appena la soluzione Ottobre è asciugato. </li></ol>

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Benjamin S. Bleier MD è inventore di piombo di metodi di copertura brevettuale provvisori di somministrazione di farmaci per il sistema nervoso centrale.

Il passo più difficile della procedura qui descritta è la riuscita del trasferimento di una membrana mucosa adeguate dimensioni sulla superficie del cervello. Questo passaggio è notevolmente semplificata se il setto nasale raccolto è abbastanza grande e ben puliti. Se la parte ventrale del setto viene troncato, un nuovo innesto deve essere ottenuta. L&#39;angolo di perforazione deve essere perpendicolare alla testa mouse per assicurare che la membrana mucosa non è danneggiato dal trapano. Se viene preso un percorso di p...

Il trattamento della malattia neurologica e psichiatrica è fortemente ostacolato dalla presenza della barriera ematoencefalica (BBB) ​​che impedisce oltre il 95% di tutti i potenziali agenti farmaceutici di raggiungere il sistema nervoso centrale 1-3. Ad esempio, derivazione gliale fattore neurotrofico (GDNF) ha dimostrato di essere efficace nel trattamento della malattia di Parkinson quando iniettato direttamente nel cervello, tuttavia è inefficace quando consegnato sistemica perché non può penetrare la BBB 4-6. Numerosi avvicinato sono stati sviluppati per cercare di aggirare questo problema. Miglioramento della consegna sistematica di neurotheraputics è stata dimostrata utilizzando coniugati contenenti anticorpi selettivi per le proteine ​​di trasporto localizzate sull&#39;endotelio capillare cervello; tuttavia questo metodo non ha dimostrato di essere applicabile per una vasta gamma di farmaci 7,8. Inoltre, l&#39;apertura osmotica della BBB è stato usato clinicaalleato, tuttavia questo metodo soffre di dosaggio di farmaci sistemici rispetto a una consegna più diretto alla regione del cervello di interesse 9. Notevole sforzo è stato messo in ottimizzazione consegna transnasale nella speranza di mira direttamente il cervello 10-12. Sebbene un certo successo è stato raggiunto, risultati conclusivi sono stati ottenuti solo per farmaci che posseggono recettori endogeni, come l&#39;insulina 13,14. Inoltre il meccanismo di consegna transnasale è stato controverso con prove che suggeriscono ingresso indiretto nel cervello attraverso olfattivo neurone assorbimento o attraverso il flusso sanguigno 11. , Consegna transcranica diretta utilizzando cateteri impiantabili è stato raggiunto, tuttavia questa procedura è altamente invasiva e associata a numerose complicanze 15,16. Ad oggi, non esiste un metodo generale, minimamente invasivo per fornire composti ad alto peso molecolare nel cervello. Qui presentata è una procedura chirurgica murinoche crea un&#39;interfaccia semipermeabile con il cervello. Questo si ottiene innestando un espianto membrana mucosa 17 su un difetto craniotomia chirurgica in un topo. Utilizzando questa procedura è stato dimostrato che i composti solubili fino a 500 kDa possono essere trasportati nel sistema nervoso centrale (direttamente nel parenchima cerebrale e nel liquido cerebrospinale) sia un tempo e peso molecolare di modo dipendente 18. Questo metodo di aggirare la BBB è un modello per la riparazione dei difetti di base del cranio negli esseri umani che utilizza innesti di mucosa vascolarizzati per riparare buchi nel cranio dopo la chirurgia endoscopica transnasale 19,20.

<table><tbody><tr><td>Topi</td><td>Taconic</td><td>C57BL / 6</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Student forbici fini</td><td>Strumenti di scienze fini</td><td>91461-11</td><td></td></tr><tr><td>Trapano pneumatico</td><td>MTI Dental</td><td>333-CB</td><td></td></tr><tr><td>Punta</td><td></td><td></td><td></td>da trapano</tr><tr><td>Pinze</td><td>Strumenti di scienze fini</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9% USP</td><td>Abbott Laboratories</td><td>4925</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri in polistirene</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td>per la conservazione temporanea dell'innesto</td></tr><tr><td>Sterilizzatore di perline</td><td>Strumenti di scienze fini</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di ossigeno/isoflurano</td><td>SurgiVet</td><td>V720100</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di controllo della temperatura</td><td>Physitemp</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Strumento stereotassico per piccoli animali</td><td>KOPF</td><td>Modello 940</td><td></td></tr><tr><td>Unguento</td><td></td><td></td><td></td>per gli occhi</tr><tr><td>Rasoio</td><td></td><td></td><td></td>elettrico</tr><tr><td>Applicatori con punta in cotone</td><td>Fisher</td><td>23-400-106</td><td></td></tr><tr><td>7,5% Providone iodio</td><td></td><td></td><td>Scrub chirurgico Betadine</td></tr><tr><td>70% Etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lama chirurgica stainless</td><td>Feather</td><td>2976#10</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi - #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr>Perossido <td></td><td></td> di<td>idrogena al 3%</td><td>per la pulizia del cranio</td></tr><tr><td>Adesivo tissutale Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Aghi</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305176</td><td>punta dell'ago tagliata e utilizzata anche</td></tr><tr><td>Siringhe</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Guanti in nitrile</td><td>Denville Scientific Inc</td><td>G4162</td><td>per la chiusura e la protezione dell'innesto</td></tr><tr><td>5-0 Filo</td><td></td><td></td><td></td>di sutura in nylon</tr><tr><td>Student Halsey porta ago</td><td>Fine Science Tools</td><td>91201-13</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo</td><td></td><td></td> cianoacrilato <td>disponibile in commercio Kit</td></tr><tr><td>di cemento dentale, 1 lb, rosa opaco</td><td>Stoelting</td><td>51458</td><td></td></tr><tr><td>Isobutano (2-metilbutano)</td> <td>Aldrich</td><td>M32631</td><td>per bagno di ghiaccio secco</td></tr><tr><td>Ghiaccio</td><td></td><td></td><td></td> secco</tr></tbody></table>

eterotopico mucosa engrafting procedura di drug delivery diretto al cervello nei topi

Heterotopic Mucosal Engrafting Procedure for Direct Drug Delivery to the Brain in Mice

Consegna di terapeutica nel cervello è ostacolato dalla presenza della barriera ematoencefalica (BBB) ​​che limita il passaggio di composti polari e ad alto peso molecolare dal flusso sanguigno e nel tessuto cerebrale. Alcuni successi consegna diretta negli esseri umani è stato raggiunto tramite l&#39;impianto di cateteri transcraniali; Tuttavia questo metodo è altamente invasiva e associati con numerose complicazioni. Un&#39;alternativa meno invasiva sarebbe dosare il cervello attraverso una impiantato chirurgicamente, membrana semipermeabile come la mucosa nasale che viene utilizzato per riparare difetti base cranica seguente endoscopica transnasale rimozione chirurgica del tumore nell&#39;uomo. Trasferimento Drug se questa membrana potrebbe effettivamente bypassare la BBB e diffondere direttamente nel cervello e nel liquido cerebrospinale. Ispirato da questo approccio, un approccio chirurgico nei topi è stata sviluppata che utilizza una membrana mucosa del setto donatore innestato su un difetto extracranica BBB chirurgico. Questo modello è stato dimostrato efficaceconsentire il passaggio di composti ad alto peso molecolare nel cervello. Dal momento che numerosi farmaci candidati sono in grado di attraversare la BBB, questo modello è utile per l&#39;esecuzione di sperimentazione preclinica di nuove terapie per le malattie neurologiche e psichiatriche.

Ottenere un grande abbastanza setto nasale espianto è fondamentale per le fasi successive. Questo può essere realizzato mediante foratura nella posizione sul cranio del topo donatore mostrato in Figura 1a. Tagliando lungo questo percorso produrrà un espianto di sufficiente dimensione come mostrato in Figura 1b. Se la profondità non è abbastanza profonda, l&#39;innesto sarà troncata e sarà difficile ottenere una grande membrana sufficiente a coprire la superficie del cervello. Perforazio...

Un modello murino di ricostruzione base cranica endoscopica umana sviluppato che crea un&#39;interfaccia semipermeabile tra il cervello e il naso utilizzando innesti mucose nasali. Questo metodo permette ai ricercatori di studiare consegna al sistema nervoso centrale di alto peso molecolare terapeutica che altrimenti esclusi dalla barriera emato-encefalica, se somministrati per via sistemica.

Eterotopico mucosa engrafting Procedura di Drug Delivery diretto al cervello nei topi

Delivery of therapeutics into the brain is impeded by the presence of the blood-brain barrier (BBB) which restricts the passage of polar and high ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire con successo un trapianto mucoso eterotrofico per il rilascio di composti nel cervello. Ciò viene realizzato isolando innanzitutto un innesto dal setto nasale di un topo donatore. Il secondo passaggio consiste nel trapiantare la membrana mucosa dal setto su un difetto cranico di un topo ricevente.Successivamente, il cervello viene somministrato attraverso l'innesto per un periodo di tempo desiderato. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare l'esito della procedura di somministrazione al cervello, utilizzando fluorescenza, microscopia o immunohistochemia per dimostrare la diffusione dei composti somministrati nel parenchima cerebrale. L'utilizzo di farmaci neuroprotici è fortemente limitato a causa della presenza della barriera ematoencefalica.Abbiamo sviluppato una tecnica basata sulla chirurgia endoscopica transnazale umana in cui è possibile innestare la mucosa in un'apertura nella barriera ematoencefalica e utilizzarla come canale per la somministrazione diretta di farmaci al cervello. Qui, Richie Komen, uno studente postdottorato del laboratorio di Han alla Boston University, dimostrerà questa tecnica in un modello murino.

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Fonte: Zamboni, M., et al., Induzione della modifica delle cellule leptomeningee tramite iniezione intracisternale. J. Vis. Exp. (2020)Questo video mostra la procedura di somministrazione di un farmaco induttore nella cisterna magna di un topo anestetizzato. L'iniezione induce selettivamente l'espressione di marcatori fluorescenti nelle cellule della superficie cerebrale accessibili tramite il liquido cerebrospinale, confermata dall'imaging a fluorescenza.

Somministrazione mirata di farmaci in un modello murino tramite iniezione di Cisterna Magna

In questo video, descriviamo la procedura per rilasciare cellule tumorali di derivazione umana nella cisterna magna del cervello di un topo. Il modello murino ortotopico può essere utilizzato per studiare la diffusione metastatica del cancro alle meningi craniche.

Iniezione chirurgica di Cisterna Magna: un metodo per la somministrazione di cellule tumorali direttamente nel sistema nervoso centrale del modello murino

Questo video mostra l'iniezione intracerebroventricolare mediata da ommaya in un modello murino. Il metodo consente la somministrazione localizzata di potenziali farmaci candidati ed elude la barriera emato-encefalica.

Iniezione intracerebroventricolare nel topo: un metodo di somministrazione diretta di farmaci mediato da Ommaya per somministrare farmaci ai ventricoli cerebrali del cervello del topo

Questo video presenta una procedura per l'impianto di cannula intracranica in un modello murino di tumore cerebrale, per facilitare la somministrazione di un agente immunoterapeutico. La somministrazione di cellule T del recettore dell'antigene chimerico specifico per glipicano-2 nel microambiente tumorale innesca l'attivazione delle cellule T, con conseguente lisi tumorale e regressione del tumore.

Impianto di cannulare intracranico in un topo per somministrare agenti terapeutici ai tumori cerebrali

Fonte: Leda, A. R., et al. Tecnica di infusione di microchirurgia del topo per la somministrazione mirata di sostanze nel SNC attraverso l'arteria carotide interna. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra una procedura microchirurgica progettata per facilitare l'infusione mirata di una sostanza in esame nel cervello attraverso l'arteria carotide interna (ICA). La procedura prevede una sutura precisa e una manipolazione vascolare per limitare temporaneamente il flusso sanguigno, garantendo una...

Somministrazione mirata di sostanze al cervello del topo tramite infusione nell'arteria carotide interna

Il presente protocollo descrive una tecnica di infusione di microchirurgia del topo, che eroga efficacemente sostanze direttamente nel cervello attraverso l'arteria carotide interna.

Tecnica mouse Microchirurgia infusione per Targeted Sostanza consegna nel sistema nervoso centrale via Carotide interna

Le cellule staminali sono promettenti vettori terapeutici per curare i tumori cerebrali a causa del loro tropismo tumorale intrinseco. La consegna delle cellule staminali intranasali non invasive bypassa la barriera del cervello e dimostra un forte potenziale per la traduzione clinica. Questo articolo riassume i principi fondamentali della consegna delle cellule staminali intranasali in un modello di topo di glioma.

Intranasale consegna delle cellule staminali terapeutiche a Glioblastoma in un modello di mouse

Qui, presentiamo un protocollo utilizzando un dispositivo di posizionamento del mouse che consente il posizionamento appropriato dei topi per la somministrazione intranasale di una formulazione di peptidi-siRNA mirata al cervello che consente un silenziamento genico efficace nel sistema nervoso centrale.

Un dispositivo di posizionamento per il posizionamento dei topi durante la consegna del siRNA intranasale al sistema nervoso centrale

Qui, descriviamo un modello di xenotrapianto murino che assomiglia funzionalmente a un serbatoio di Ommaya nei pazienti. Abbiamo sviluppato il Murine Ommaya per studiare nuove terapie per la malattia leptomeningea universalmente fatale.

Un modello murino di ommaya xenotrapianto per studiare la terapia mirata diretta della malattia leptomeningea

Il protocollo qui presentato consente il trapianto di microglia umana derivata da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSMG) nel cervello attraverso una via transnasale in topi immunocompetenti. Viene mostrato il metodo per la preparazione e il trapianto transnasale di cellule e la somministrazione di miscela di citochine per il mantenimento di iPSMG.

Trapianto di microglia derivata da cellule staminali pluripotenti indotte umane nel cervello di topi immunocompetenti tramite via transnasale non invasiva

Lo sviluppo di modelli ortotopici di tumore cerebrale pediatrico richiede una precisione meticolosa, utilizzando un dispositivo stereotassico per impiantare con precisione le cellule tumorali. La metodologia qui presentata delinea le fasi coinvolte nella preparazione delle cellule tumorali cerebrali, nell'esecuzione di iniezioni intracraniche e nell'implementazione di un sistema di monitoraggio post-operatorio per valutare l'attecchimento del tumore cerebrale.

Istituzione di modelli ortotopici di xenotrapianto derivati da pazienti per tumori cerebrali utilizzando un dispositivo stereotassico

Scopri la procedura di innesto eterotopico della mucosa nasale per la somministrazione diretta di farmaci al cervello nei topi. Questo metodo innovativo supera la barriera ematoencefalica per migliorare il delivery di terapeutici ad alto peso molecolare.

Eterotopico mucosa engrafting Procedura di Drug Delivery diretto al cervello nei topi

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