Eterotopico mucosa engrafting Procedura di Drug Delivery diretto al cervello nei topi

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire con successo un intervento chirurgico di innesto di mucosa eterotrofica per la somministrazione di composti nel cervello. Ciò si ottiene isolando prima un innesto di setto nasale da un topo donatore. Il secondo passo consiste nel trapiantare la membrana mucosa dal setto su un difetto del cranio su un topo ricevente.

Successivamente, il cervello viene dosato attraverso l'innesto per un periodo di tempo desiderato. Il passo finale consiste nell'analizzare le conseguenze della procedura di dosaggio cerebrale utilizzando la fluorescenza, la microscopia o l'immunoistochimica per mostrare la diffusione dei composti somministrati nel cervello. Parenchima. L'utilizzo di farmaci neuropici è altamente limitato a causa della presenza della barriera emato-encefalica.

Abbiamo sviluppato una tecnica basata sulla chirurgia endoscopica transnasale umana in cui possiamo rappresentare graficamente la mucosa in un foro nella barriera emato-encefalica e utilizzarla come condotto per la somministrazione di farmaci direttamente al cervello. Qui, Richie Komen, uno studente post-dottorato presso il laboratorio di Han presso la Boston University, dimostrerà questa tecnica in un modello murino. Inizia questa procedura rimuovendo la pelle intorno alla regione nasale di un topo soppresso per esporre il cranio.

Quindi segna tre linee con il trapano pneumatico. Due delle linee fiancheggiano lateralmente la regione nasale e la terza è in linea con gli occhi, che collega le due linee perpendicolarmente. Quindi, approfondisci ventralmente.

Per separare il setto nasale dal tessuto circostante, tagliare il setto libero da qualsiasi tessuto ad esso aderito. Quindi conservarlo in una soluzione salina sterile al microscopio, pulire l'innesto e rimuovere l'eventuale tessuto collegato. La situazione ideale è quella di rimuovere con successo tutto il tessuto connettivo senza danneggiare le membrane mucose presenti su entrambi i lati del setto cartilagineo.

Dopo aver anestetizzato un topo utilizzando procedure chirurgiche standard di specchiatura asettica montate in una cornice teologica, applicare un unguento sugli occhi per prevenire la secchezza. Quindi, esponi il teschio e livella la testa. Quindi praticare un foro circolare di 1,25 millimetri di diametro sul cranio utilizzando un trapano pneumatico.

Quando si mira l'atu, bagnare l'area perforata con soluzione fisiologica sterile e utilizzare una lama di rasoio per rimuovere il cranio. Dopodiché, rimuovere manualmente la dura madre utilizzando la punta di un ago calibro 30. Successivamente, posizionare la membrana mucosa sopra la superficie cerebrale, prestando estrema attenzione a mantenere il lato epiteliale rivolto lontano dalla ferita.

Usando la punta di un paio di forbici chirurgiche, tenere la membrana fuori dalla cartilagine e sulla superficie del cranio e del cervello per sovrapporre generosamente tutti i bordi ossei del sito della craniotomia. Quindi, coprire l'innesto con un pezzo sterile di nitrile. Questo agisce per prevenire l'adesione della pelle all'innesto durante la guarigione.

Se necessario, tagliare la membrana in eccesso ed evitare qualsiasi movimento del nitrile una volta che è entrato in contatto con l'innesto. Quindi chiudere la pelle con la sutura e lasciare che il topo si riprenda per tre-sette giorni prima di procedere alla fase successiva. Assicurarsi che vengano eseguiti trattamenti post-chirurgici appropriati e che vengano somministrati regolarmente analgesici per dosare l'animale.

Dopo aver fissato il topo anestetizzato nel telaio stereotassico, tagliare la sutura con le forbici e rimuovere la pelle in eccesso intorno al cranio. Rimuovere la barriera di nitrile e pulire la superficie del cranio. Utilizzare soluzione fisiologica sterile e tamponi di cotone per pulire l'area fino a quando l'innesto non è visibile.

Potrebbe essere necessario tagliare l'innesto con il rasoio se è cresciuto più grande della superficie desiderata. Quindi, posiziona il pozzetto sopra l'innesto in modo che i bordi siano a contatto con il cranio. Quindi applicare l'adesivo cianoacrilato all'incrocio tra il pozzo e il cranio.

Riempire il pozzetto con soluzione fisiologica sterile e verificare che non vi siano perdite. Successivamente, applicare del cemento sul cranio per fissare il pozzo in posizione. Successivamente, rimuovere la soluzione salina dal pozzetto con una pipetta.

Lavare il pozzetto più volte per verificare che l'adesivo non sia fuoriuscito. Quindi aggiungere 50 microlitri di destrano fluorescente. Tappare la parte superiore del pozzetto utilizzando un pezzo circolare di nitrile fissato alla parte superiore con adesivo cianoacrilato e assicurarsi che l'adesivo non venga a contatto con il contenuto del pozzetto.

Trascorso il tempo desiderato, sopprimere l'animale e rimuovere l'impianto e il cervello. Fare attenzione a mantenere l'innesto in posizione. Una volta rimosso, flashare, congelare il cervello in una soluzione di isobutano raffreddato in un bagno di ghiaccio secco, incorporare il cervello in una soluzione OCT e affettare a 50 micrometri.

Posizionare le fette desiderate direttamente su un vetrino da microscopio. Quindi visualizzare la fetta utilizzando un microscopio a fluorescenza non appena la soluzione OCT si è asciugata. Questa è un'immagine al microscopio fluorescente di una fetta di cervello di topo dopo il dosaggio transmucoso.

Con 40 kilodalton di destrano coniugato tetraetil rumine per 24 ore, l'innesto di mucosa è visibile sulla superficie del cervello. Una volta padroneggiata, questa tecnica dovrebbe richiedere un totale di quattro ore di intervento chirurgico per essere eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di isolare un setto nasale e trasferire la membrana mucosa su un sito di craniotomia allo scopo di somministrare il farmaco al cervello.