Name: Imaging confocale di confinati riposo e fluenti miscele colloidali e polimeri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Scopri la microscopia confocale per analizzare il comportamento di fase e le proprietà di trasporto di sospensioni colloidali attrattive confinate. Questa tecnica rivela come il confinamento geometrico modifica la dinamica strutturale.

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Ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto da una Università di Houston Nuova Facoltà Grant, una sovvenzione seme dal Centro Texas per la superconduttività e la Petroleum Research Fund American Chemical Society (52537-DNI).

1. Preparazione di miscele colloidali e polimeri Nota: Questo protocollo utilizza poli (metilmetacrilato) (PMMA) particelle, stericamente stabilizzati usando poli (acido 12-idrossistearico) e marcato con un colorante fluorescente (come Nilo Rosso, rodamina B, o fluoresceina), che sono stati sintetizzato seguendo uno standard ricetta 52. <ol><li> Preparare un w / w miscela di cicloesil bromuro (CXB) e decaidronaftalene (DHN) come uno stock di solvente 3:1. Questa miscela corrisponde quasi la densità e l&#39;indice di rifrazione delle particelle. Aggiungere un sale organico, cloruro di tetrabutilammonio (TBAC) 46, a solvente ad una concentrazione di 1,5 mM per schermare parzialmente le cariche sulle particelle. </li><li> Per determinare con precisione la densità delle particelle, preparare una sospensione in frazione approssimativa volume di particelle Φ = 0,10 nel CXB: solvente DHN. Centrifugare la sospensione a 800 xg per 75 minuti e aggiungere CXB o DHN goccia a goccia per migliorare la galleggiabilitàcorrispondenza. In questi esperimenti, la densità delle particelle di PMMA è stata misurata da ρ = 1.223 g / ml. </li><li> Preparare uno stock sospensione concentrata di particelle di PMMA (qui, Φ = 0,40) nel CXB: miscela di solventi DHN. </li><li> Preparare una soluzione concentrata di polistirene lineare (PS) nel CXB: miscela di solventi DHN. Qui, una soluzione di PS di peso molecolare M w ≈ 3.000.000 (raggio di girazione r g = 15 nm) viene preparato in concentrazione c p ≈ 50 mg / ml. </li><li> Mescolare pesi adatti della particella, polimero, e miscele di solventi archivi formulare sospensioni alle concentrazioni desiderate di particelle e polimeri. Nota: Qui, sospensioni di particelle monodisperse sono predisposti alla frazione di volume colloide costante Φ = 0,15 e concentrazione di polimero variabile nel volume libero 53 c p = 0,25 mg / ml, e bidispersed sospensioni contenenti due dimensioni di particelle colloidali, with ogni formato muniti di una etichetta fluorescente distinta, sono preparati a frazione volumetrica colloide fisso totale Φ = 0,15, rapporto frazione volumetrica di piccole particelle r = 0,50, e la concentrazione di polimero nel volume libero di 5 o 25 mg / ml. </li><li> Dopo ogni sospensione è disposta, aggiungere CXB o DHN goccia a goccia e centrifugare i campioni a 800 xg per almeno 75 minuti per confermare che le particelle e cluster all&#39;interno della sospensione rimangono galleggiabilità abbinato. </li><li> Equilibrare tutti i campioni per almeno 24 ore prima di esperimenti di imaging. </li></ol> . 2 Esperimenti campione quiescenti: Fase di Comportamento <ol><li> Per determinare il comportamento di fase bulk, fabbricare camere rettangolari da vetrini (Figura 1a). Per le miscele colloide polimeriche in questo studio, camere di spessore h = 1 mm (impostato dallo spessore di un vetrino da microscopio) danno comportamento rinfusa. </li><li> Per accedere a più confini in un singolo esperimento microscopia, fabbricare sottile cuneocamere di forma, utilizzando un unico coprioggetto da distanziatore su un cuneo (Figura 1b). L&#39;angolo della camera di apertura è &lt;0,5 °, in modo che in un unico campo visivo le pareti sono quasi parallele. Una camera di rappresentante consente l&#39;accesso a spessori di confinamento di h = 6&gt; 100 micron. </li><li> Costruire delle camere su una base coprioggetto per l&#39;esposizione su un microscopio invertito e sigillare con resina epossidica UV, che non si scioglie nella miscela solvente CXB-DHN. </li><li> Campioni di immagini utilizzando un microscopio confocale. Questo protocollo dimostra l&#39;imaging confocale con una scansione lineare collegato ad un microscopio invertito dotato di una lente immersione in olio 100X di apertura numerica NA = 1,40. </li><li> Eccitare i coloranti utilizzando una sorgente laser. Qui lunghezze d&#39;onda λ = 491 o 561 nm sono usati per eccitare la fluoresceina e rodamina coloranti / Nilo Rossi, rispettivamente. </li><li> Nel sistema punto-scansione, generare un&#39;immagine mediante una rapida scansione del punto focale attraverso il campione (in x-y piano) utilizzando il software confocale. Una immagine bidimensionale di 512 pixel x 512 pixel, che coprono circa il 50 micron x 50 micron, possono essere acquisiti in 1/32 sec. Migliorare la qualità dell&#39;immagine media più immagini o aumentando il tempo di acquisizione. </li><li> Individuare il fondo della camera (z = 0), ad esempio concentrando sulle particelle attaccate al suo fondo. In questa configurazione, l&#39;altezza (z) aumenta con l&#39;aumentare fuoco nella camera. </li><li> Come esempio, caratterizzare l&#39;effetto di confinamento sulla dinamica delle particelle con l&#39;acquisizione di una serie temporale 2-D di immagini (nel piano xy) al piano medio della camera. In un tipico esperimento, 500 immagini di dimensione 512 pixel x 512 pixel vengono acquisiti ad un frame rate di 1 frame / sec (tempo di spaziatura At = 1 sec). </li><li> Come secondo esempio, caratterizzare la struttura 3-D di particelle acquisendo una serie tridimensionale di immagini (x, y, z). In un tipico esperimento, le immagini bidimensionali (512 pixel x 512 pixel) sonoacquisita in più posizioni z all&#39;interno della camera, con un passo costante di Az = 0,2 micron tra immagini consecutive stabiliti da un piezo. Una pila di volume copre spessore h = 30 um contiene quindi 151 immagini. </li><li> Individuare e particelle di pista nel corso del tempo in 2-D e 3-D utilizzando il software di particelle di monitoraggio scritto in IDL 23,54-56, MATLAB 57,58, LabView 59, 60 o Python. Questi algoritmi permettono generalmente centri delle particelle da risolvere entro 40-50 nm. Particle tracking successo richiede che le particelle si muovono meno la spaziatura interparticellare tra fotogrammi consecutivi. </li><li> Dalle posizioni delle particelle, calcolare le metriche strutturali e dinamiche. Tre metriche convenienti qui indicati sono la funzione paio di correlazione 3-D g (r) 61, lo spostamento 2-D quadratico medio (MSD) 58,62, e l&#39;auto parte 2-D della funzione di correlazione van Hove G s ( x, t) 58. Gli ultimi due parametri possono essere calcolati anche in 3-D. </li></ol> . 3 Esperimenti Flowing: proprietà di flusso <ol><li> Fabbricare una cella di flusso semplice mediante un microcapillare vetro con sezione quadrata (100 micron x 100 micron) che viene apposto al tubo in Teflon. Utilizzare vetrini per sostenere il capillare e fornire rigidità meccanica, come mostrato nello schema di figura 7. </li><li> Caricare la miscela colloidale-polimero in una siringa di vetro. Attaccare la siringa pompa a siringa o un sistema di erogazione di fluido pneumatico. </li><li> Montare la configurazione della cella di flusso sul microscopio invertito. Conservare la siringa, cella di flusso, e la presa alla stessa altezza per minimizzare l&#39;effetto della gravità sul profilo di flusso. </li><li> Controllare la portata della sospensione attraverso la cella di flusso dalla portata volumetrica (per la pompa a siringa) o la pressione applicata (per la casella pressione). La velocità media della sospensione nei microcanali dipende anche suformulazione spension. Valori tipici della velocità massima dei microcanali quadrati misurati qui sono 200-2.000 micron / sec. </li><li> Durante il flusso, acquisire una serie temporale confocale 2-D a frame rate veloci. Qui, 500 immagini di dimensione 512 pixel x 512 pixel vengono acquisiti a 32 fotogrammi / sec (tempo spaziatura Δ t = 1/32 sec) a diverse altezze sopra il fondo della microcanali (z = 0 micron) vanno da z = 5 - 50 pm. Ogni immagine copre circa la metà della dimensione laterale (y) dei microcanali, come mostrato nel riquadro alla Figura 7. Se le particelle appaiono ellittica, aumentare il frame rate di acquisizione. </li><li> Come negli esperimenti quiescenti, individuare le particelle in 2-D utilizzando algoritmi standard per la localizzazione e il monitoraggio di particelle in IDL e MATLAB. Per flussi lenti, in cui le particelle si muovono meno della distanza media tra i fotogrammi interparticellare, utilizzano algoritmi di monitoraggio avere le traiettorie. </li><li> Utilizzare l&#39;immagine correlazione calcUlate i profili di velocità per i flussi veloci. <ol><li> Suddividere l&#39;immagine in immagini orizzontali di altezza costante (y) lungo la direzione del flusso (x). Per due immagini sequenziali I 1 (x, y) e 2 (x, y) spostare quest&#39;ultima immagine di un fattore Ax e quindi calcolare il cross-covarianza tra I 1 (x, y) e 2 (x + Dx, y). </li><li> Identificare la posizione picco dell&#39;istogramma dei valori Ax che massimizzano il cross-covarianza tra ogni coppia di immagini per avere la velocità avvezione medio in ciascuna posizione laterale y. Se questa distribuzione non è fortemente raggiunto il picco, acquisire immagini ad un frame rate più veloce. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Sospensioni colloidali sono ampiamente studiati come modelli di comportamento di fase limitata, perché le particelle colloidali micron di dimensioni mostrano dinamiche notevolmente più lento di atomi e molecole e quindi possono essere facilmente esposte e monitorati nel tempo 10. Per questi studi fondamentali, capire l&#39;effetto delle attrazioni interparticellari sul comportamento di fase confinata offre l&#39;opportunità di esplorare fenomeni come la condensazione capillare ed evaporazione 21,22,67.</...

Questo documento dimostra (a) confocale di miscele colloide-polimero quiescenti e fluenti confinati in due e tre dimensioni e (b) particelle di monitoraggio e correlazione analisi delle immagini risultanti per ottenere informazioni quantitative sul comportamento di fase e proprietà di flusso. Sospensioni colloidali con interazioni interparticellari interessanti appaiono ubiquitariamente in applicazioni tecnologiche come materiali per il montaggio diretto 1-3, la consegna della droga 4, migliorato 5-7 il recupero di idrocarburi e stoccaggio di energia 8. Una caratteristica comune di queste applicazioni è che le particelle devono essere attraversati geometrie pregiati, quali ugelli, testine di stampa, microcanali o supporti porosi, e / o essere trasformati in film sottili o aste. Le tecniche utilizzate per sondare la struttura di colloidi micron di dimensioni in geometrie confinate, comprese microscopia elettronica 17,18, microscopia a raggi X 19, e diffrazione laser microscopy 20, può essere utilizzato per misurare la struttura e la dinamica di particelle su microscala. Queste tecniche, tuttavia, non consentono l&#39;accesso alle traiettorie delle singole particelle, da cui metriche strutturali e dinamiche possono essere calcolati per confronto diretto simulazioni numeriche 21,22. Microscopia confocale è una variante di microscopia a fluorescenza che permette l&#39;imaging di sezioni sottili di un campione fluorescente. Per la scienza colloidale 10, questa tecnica è particolarmente utile per l&#39;imaging in profondità all&#39;interno sospensioni dense o in tre dimensioni. Algoritmi di Particle-tracking 23 applicati a due o serie temporali tridimensionale di micrografie confocali cedere le traiettorie di tutte le particelle visibili. Di conseguenza, la combinazione di microscopia confocale e particella-inseguimento è stato applicato per studiare il comportamento di fase, la struttura e la dinamica di sospensioni colloidali, compresi cristalli ordinati 24-27 e disturboed occhiali 28-31 e 32-35 gel. Altri algoritmi di analisi dell&#39;immagine possono essere applicati per misurare la dinamica delle particelle di serie temporali di micrografie confocale. Ad esempio, la dinamica delle particelle diffusiva possono essere studiati analizzando le fluttuazioni di intensità nel tempo utilizzando differenziale microscopia confocale dinamico 36. Quando gli spostamenti delle particelle sono più grandi della spaziatura interparticellare, immagine correlazione 37 basato su particelle immagine velocimetry 38-40 può essere applicato per misurare profili di velocità delle particelle. La combinazione di algoritmi di localizzazione e di correlazione ha permesso dinamiche colloidali da misurare nei sistemi sottoposti a lento e veloce il flusso 11-16,41-45. Usiamo miscele colloide-polimero come modelli per interessanti sospensioni colloidali 9. In queste miscele, la copertura e il livello della interessante potenziale interparticellare sono controllati tramite il rapportodel raggio di girazione polimero al raggio delle particelle e la concentrazione del polimero e la repulsione elettrostatica è controllata tramite l&#39;aggiunta di un sale organico monovalente 46. Poiché le interazioni interparticellari possono essere messi a punto, la solidificazione di queste miscele è stata ampiamente studiata con microscopia confocale 34,47-51. Qui mostriamo confocale e analisi di immagine 37 di miscele colloide-polimero quiescenti e scorre, in cui la frazione di volume colloide è tenuta fissa a Φ = 0,15, che sonda l&#39;effetto di contenimento sul comportamento di fase e proprietà di flusso di queste miscele. Queste tecniche sono ampiamente applicabili a sistemi particellari che sono indice di rifrazione-coincidenti ed in cui le particelle e / o solvente possono essere marcate con un colorante fluorescente.

<table><tbody><tr><td>Bromuro di cicloesile</td>, <td>Sigma Aldrich</td><td>135194</td><td>Numero CAS: 108-85-0, Peso molecolare = 163,06, Utilizzato in magazzino solvente</td></tr><tr><td>Decaidronaftalene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D251</td><td>Numero CAS 91-17-8, Peso molecolare = 138,25, Utilizzato in magazzino solvente</td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>Sigma Aldrich</td><td>72485</td><td>Colorante fluorescente</td></tr><tr><td>Fluoresceina 5(6)-isotiocianato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3651</td><td>Colorante fluorescente</td></tr><tr><td>Rodamina B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83689</td><td>Colorante fluorescente</td></tr><tr><td>Diffusione dinamica della luce&nbsp;</td><td>Brookhaven Instruments</td><td>Apparecchiature BI-APD</td><td>DLS utilizzate per la misurazione della dimensione delle particelle</td></tr><tr><td>Polistirene</td><td>Varian/Agilent</td><td>PL20138-23</td><td>Polistirene (polimero) per indurre l'attrazione per l'esaurimento</td></tr><tr><td>Tetrabutil(cloruro di ammonio) (TBAC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86870</td><td>sale monovalente</td></tr><tr><td>Adesivo UV</td><td>Adesivo Norland NOA</td><td>68T</td><td>Codice 68T01 (adesivo polimerizzato UV)</td></tr><tr><td>VT Eye</td><td>Visitech</td><td>VT Scanner confocale per occhi</td><td></td></tr><tr><td>VT Infinity</td><td>Visitech</td><td>VT </td><td>Microscopio scanner confocale</td></tr><tr><td>Infinity&nbsp;</td><td>Leica</td><td>DMI3000B</td><td>Centrifuga per microscopio invertito</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall ST 16</td><td>1-5.000 giri/min</td></tr><tr><td>Tubi in teflon</td><td>piccole parti</td><td>SLTT 26-72</td><td>Zeus PTFE Sublite Wall Tubing 26 AWG 0,016" ID x 0,003"</td></tr><tr><td>Wall Epoxy Devcon</td><td></td><td>DA051</td><td>Siringa epossidica da 5 min</td></tr><tr><td>Siringa</td> in vetro <td>Micromate/Cadence</td><td>5004</td><td>con luer in metallo punta di blocco</td></tr><tr><td>Punte per siringhe&nbsp;</td>Punte di precisione <td>Nordson</td><td>7018462</td><td>32 GA&nbsp;</td></tr><tr><td>Pompa a siringa&nbsp;</td><td>Sistema di pompaggio New Era Inc.</td><td>NE1002X</td><td>Pompa microfluidica programmabile (syringepump.com)</td></tr><tr><td>Bilancia</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB204-S</td><td>0,0001-220 g</td></tr><tr><td>Particelle di PMMA</td><td>Particelle colloidali sintetizzate</td><td></td> in <td>poli(metilmetacrilato)</td></tr></tbody></table>

imaging confocale di confinati riposo e fluenti miscele colloidali e polimeri

Confocal Imaging of Confined Quiescent and Flowing Colloid-polymer Mixtures

Il comportamento di sospensioni colloidali confinati con interazioni interparticellari attraenti è fondamentale per il disegno razionale di materiali per il montaggio diretto 1-3, drug delivery 4, 5-7 migliorato recupero di idrocarburi, e elettrodi fluidi di immagazzinamento 8. Sospensioni contenenti colloidi fluorescenti e polimeri non adsorbenti sono interessanti sistemi modello, come il rapporto tra il raggio di girazione polimero al raggio delle particelle e la concentrazione del controllo polimero rispettivamente l&#39;intervallo e la forza di attrazione interparticellare,. Sintonizzando le proprietà del polimero e la frazione volumetrica dei colloidi, fluidi colloidali, fluidi di cluster, gel, cristalli e vetri possono essere ottenuti 9. Microscopia confocale, una variante di microscopia a fluorescenza, permette un campione otticamente trasparente e fluorescente da acquisire con elevata risoluzione spaziale e temporale in tre dimensioni. In questa tecnica, un piccolo foro o fessura blocca la luce fluorescente emessa dalle regioni del campione che sono al di fuori del volume focale del sistema ottico del microscopio. Di conseguenza, solo una sezione sottile del campione nel piano focale viene esposta. Questa tecnica è particolarmente adatta per sondare la struttura e la dinamica in sospensioni colloidali dense a scala singola particella: le particelle sono abbastanza grandi da essere risolto utilizzando luce visibile e diffondono abbastanza lentamente da catturare a velocità di scansione tipiche dei sistemi confocali commerciali 10 . Miglioramenti nella velocità di scansione e algoritmi di analisi hanno inoltre consentito confocale imaging quantitativo di sospensioni fluide 11-16,37. In questo lavoro, dimostriamo esperimenti di microscopia confocale per sondare il comportamento di fase confinata e fluidità di miscele colloide-polimero. Per prima cosa prepariamo collmiscele oid-polimero che sono densità e indice di rifrazione abbinati. Poi, riportiamo un protocollo standard per l&#39;imaging miscele colloide-polimero densi quiescenti sotto diversi confinamento nelle cellule a forma di cuneo sottili. Infine, dimostriamo un protocollo per l&#39;imaging miscele colloide-polimero durante il flusso microcanali.

Per dimostrare confocale e particelle-tracking, abbiamo studiato l&#39;effetto del confinamento sul comportamento di fase di miscele colloide-polimero 63-65. Per questi esperimenti il diametro colloide era 2 a = 0,865 micron. La frazione di volume colloide è fissato a Φ = 0,15 e la concentrazione del polimero c p è stata variata 0-23,6 mg / ml. Immagini confocali rappresentativi sono riportati nella Figura 2 63, colonna a sinistra. Dalle posizioni delle...

La microscopia confocale viene utilizzato per immagini miscele colloide-polimero quiescenti e fluenti, che vengono studiati come sistemi modello per sospensioni interessanti. Algoritmi di analisi dell&#39;immagine sono utilizzati per calcolare le metriche strutturali e dinamici per le particelle colloidali che misurano le variazioni dovute al confino geometrica.

Imaging confocale di confinati riposo e fluenti miscele colloidali e polimeri

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare i cambiamenti nel comportamento di fase confinata e nelle proprietà di trasporto di sospensioni colloidali attrattive mediante microscopia confocale. Questo viene ottenuto formulando miscele colloidale-polimero per modellare sospensioni colloidali attrattive. Le miscele vengono osservate e confinate in celle a cuneo sottile per mostrare come il confinamento modifichi la struttura, la dinamica e il comportamento di fase di queste miscele.Successivamente, le miscele vengono analizzate mediante immagini mentre scorrono attraverso microcanali, al fine di determinare l'effetto dell'intensità dell'attrazione tra i colloidi sulle proprietà di trasporto confinato delle miscele. L'analisi automatizzata delle immagini e gli algoritmi di tracciamento delle particelle possono mostrare come il confinamento in condizioni di quiete porti alla solidificazione e alla correlazione delle immagini. Gli algoritmi possono inoltre mostrare come un aumento dell'intensità dell'attrazione determini un comportamento di flusso sempre più non newtoniano.Il principale vantaggio di questa tecnica, o di altri metodi come il microscopio elettronico e la diffusione dinamica della luce, è che consente di tracciare direttamente le traiettorie delle singole particelle, a partire dalle quali possono essere calcolate metriche dinamiche e strutturali per un confronto diretto con le simulazioni. Questo metodo standard può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della fisica della materia condensata morbida, come ad esempio in che modo le sospensioni si autoassemblano in presenza di interazioni tra particelle, oppure come le sospensioni solide e leggere cedono sotto una forza o uno sforzo applicato. Per questo protocollo, sono state preparate particelle di PMMA marcate con un colorante, consultare il materiale di riferimento collegato nel protocollo testuale per le preparazioni standard.Preparare una miscela in rapporto di tre a uno in peso di broy heane in deco idro natalina lean; successivamente, aggiungere tetra butil ammonio e un sale organico fino a raggiungere una concentrazione di 1,5 millimolare. Il solvente ha un indice di rifrazione uguale a quello delle particelle e scherma parzialmente la loro carica, permettendo di determinare con precisione la densità delle particelle, sospese al 0,1% in volume nel solvente preparato. Centrifugare la sospensione a 800 ×g per 75 minuti.Verificare che le particelle non sedimentino dopo la centrifugazione. Successivamente, per evitare che le particelle si depositino, aggiungere goccia a goccia il solvente base in modo da adattare la densità del solvente a quella delle particelle. Preparare quindi una sospensione al 40% delle particelle di PMMA nella miscela di solvente preparata.Preparare anche poli-cirene lineare nella miscela di solvente ad alta concentrazione. Ad esempio, 50 milligrammi per millilitro calcolati dal peso molecolare e dal raggio di inerzia del polistirene. L'uso della sospensione concentrata di particelle di PMMA e della soluzione di polistirene consente di ottenere sospensioni con la concentrazione desiderata di particelle e polimeri.Qui la sospensione contiene il 15 percento in volume di particelle di PMMA e la concentrazione del polimero varia da zero a 25 milligrammi per millilitro, mediante sospensioni disperse di due tipi di particelle di PMMA di dimensioni diverse e con etichette diverse, in volumi uguali. Le frazioni possono essere anche miscelate con la soluzione polimerica. Dopo aver mescolato ciascuna sospensione, centrifugarle e quindi aggiungere un solvente goccia a goccia per adattare il più possibile la densità del solvente a quella delle particelle.Infine, equilibrare tutti i campioni posizionando i campioni sigillati in un boccione per almeno 24 ore prima di procedere all'acquisizione delle immagini. Iniziare assemblando camere rettangolari realizzate con lamelle di vetro. Lo spessore del vetrino microscopico è di un millimetro e, di conseguenza, lo spessore della camera, che permette il comportamento collettivo delle miscele polimeriche con collare.Se si desidera una camera ad altezza multipla, realizzare camere sottili a forma di cuneo utilizzando un unico vetrino coprioggetto distanziato mediante un cuneo. L'angolo di apertura della camera è inferiore a 0,5 gradi e lo spessore della camera aumenta da sei micrometri a un millimetro. Questa configurazione permette di variare continuamente lo spessore del confinamento; costruire le camere in modo che possano essere posizionate su un microscopio invertito e sigillarle con una resina epossidica curabile con raggi UV e resistente alla miscela di solventi utilizzata dal microscopio.Ecco una testa di scansione confocale a scansione lineare collegata a un microscopio invertito con un obiettivo ad immersione in olio da 100x. Con un'apertura numerica di 1,4, utilizzare le lunghezze d'onda appropriate per eccitare i coloranti ed acquisire immagini quadrate di 50 micron a 512 pixel quadrati. Iniziare con un'esposizione di un trentaduesimo di secondo, quindi regolare in base alla qualità dell'immagine.Successivamente, individuare la parte inferiore della camera dove le particelle aderiranno. Poi spostare il fuoco al punto medio della camera. Ora acquisire circa 500 immagini a una velocità di un fotogramma al secondo nel piano centrale per l'analisi 2D.Quindi, per l'analisi 3D, acquisire immagini a stack Z con intervalli di 0,2 micron su un totale di 30 micron in qualsiasi esperimento di imaging collaterale. È fondamentale ottimizzare le condizioni di imaging per ottenere immagini ad alto contrasto. Analizzare le immagini utilizzando un pacchetto software per il tracciamento delle particelle.Deve essere disponibile un algoritmo in grado di risolvere le particelle fino a 40 o 50 nanometri. Il tracciamento delle particelle è possibile solo se queste si spostano di meno rispetto alla distanza interparticellare tra frame consecutivi. Per valutare la struttura e la dinamica delle particelle, utilizzare le seguenti metriche.Una funzione di correlazione a coppie 3D, uno spostamento quadratico medio 2D o 3D e la parte autonoma della funzione di correlazione di Van Hove in 2D o 3D. Per questo esperimento, realizzare una semplice cella di flusso utilizzando un capillare di vetro quadrato largo 100 micron. Collegare un tubo in teflon e utilizzare lamelle di vetro come supporto strutturale.Successivamente, caricare la miscela polimerica colloidale di interesse in una siringa di vetro e collegarla a un sistema di erogazione come una pompa. Montare ora l'intero apparato sul microscopio invertito utilizzato nella sezione precedente. La cella a flusso della siringa e l'uscita devono essere mantenute il più possibile in posizione orizzontale.Impostare la portata in base alla miscela polimerica colloidale. Durante il flusso, sono state utilizzate concentrazioni attraverso capillari quadrati da 200 a 2000 micron al secondo. Acquisire immagini 2D come descritto nella sezione precedente a diverse distanze dal fondo del canale, da cinque a 50 micron.Se le particelle appaiono ellittiche, aumentare la frequenza di acquisizione dei fotogrammi. Utilizzare un software di tracciamento insieme a IDL o MATLAB per analizzare il flusso. Ottenere una risoluzione sub-pixel nel tracciamento delle particelle richiede un'accurata regolazione dei parametri di tracciamento, in modo da produrre OIDs non distorti in una direzione particolare.Durante un flusso lento. Quando le particelle si spostano meno della distanza interparticellare tra un fotogramma e l'altro, è possibile ottenere le traiettorie utilizzando routine di tracciamento in un flusso più rapido. Utilizzare la correlazione d'immagine per calcolare la velocità.Suddividere ogni immagine in immagini orizzontali nella direzione del flusso. Nelle immagini sequenziali, spostare la seconda immagine in modo da allinearla con la prima e utilizzare la distanza di spostamento per calcolare la velocità tra coppie di immagini o ciascuna suddivisione delle immagini originali. Creare un istogramma di tutti i valori di spostamento calcolati.Se i valori non presentano un picco accentuato, ripetere l'esperimento con una frequenza di acquisizione più elevata. Particelle di PMMA con un diametro definito di 0,865 micron sono state sospese al 15% in volume in 23,6 milligrammi di polimero per millilitro di solventi miscelati. Metriche strutturali e dinamiche sono state utilizzate per valutare le immagini, inclusa la correlazione a coppie e lo spostamento quadratico medio.La modifica del liquido di sospensione può alterare la struttura e la dinamica di sospensioni confinate. Ad esempio, è stata formulata una sospensione disperdente di particelle di 1,48 micron e 0,73 micron, in cui le particelle occupavano il 15% del volume, riducendo lo spessore del confinamento. È stata indotta una fase gel colloidale di tipo solido contenente entrambi i tipi di particelle, e lo spostamento quadratico medio delle particelle più grandi è diminuito all'aumentare del confinamento del sistema.In conformità al flusso di solidificazione, sono state confrontate le proprietà delle particelle debolmente attrattive e fortemente attrattive. La concentrazione del polimero è variata da cinque a 25 milligrammi per millilitro. Nelle sospensioni, la sospensione debolmente attrattiva ha mostrato un profilo di densità che variava notevolmente con la posizione attraverso il canale.Con un flusso di 10 microlitri all'ora, il profilo di densità della sospensione fortemente attrattiva era quasi costante lungo il canale nelle stesse condizioni. Analogamente, si osservavano differenze nei profili di velocità di queste sospensioni. Le particelle debolmente attrattive si avvicinavano alla previsione newtoniana per la loro velocità, mentre le particelle fortemente attrattive si discostavano leggermente dalla previsione newtoniana per la velocità, in particolare nelle zone più vicine alla parete laterale del canale, dove Y è zero.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la microscopia confocale per studiare il comportamento di fase e le proprietà di flusso delle sospensioni colloidali seguendo questa procedura. Altre metriche, come le dimensioni degli aggregati e le dimensioni frattali, possono essere calcolate a partire dalle posizioni delle particelle per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio su come il confinamento modifichi la forma degli aggregati.

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Viene presentato un protocollo per la quantificazione e il confronto simultaneo di tre componenti cellulari ed extracellulari all'interno di biofilm. La metodologia prevede l'uso della microscopia a scansione laser confocale, del software di analisi e visualizzazione strutturale del biofilm e del software di analisi statistica.

Quantificazione concomitante di cellulare e extracellulare componenti del biofilm

I biofilm hanno interazioni complesse con l'ambiente circostante. Per studiare in modo completo le interazioni biofilm-ambiente, presentiamo qui una serie di metodi per creare un ambiente chimico eterogeneo per lo sviluppo del biofilm, per quantificare la velocità del flusso locale e per analizzare il trasporto di massa all'interno e intorno alle colonie di biofilm.

Metodi per caratterizzare il co-sviluppo di biofilm e Habitat Eterogeneità

Per studiare le velocità di flusso e la direzionalità dell'actina filamentosa nella sinapsi immunologica delle cellule T, l'imaging a super-risoluzione su cellule vive è combinato con la fluorescenza a riflessione interna totale e quantificato con la spettroscopia di correlazione delle immagini spazio-temporali.

Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

Non agitata polimerizzazione precipitazione fornisce un rapido, riproducibile approccio prototipazione alla sintesi di stimoli-sensibili poli (N -isopropylacrylamide) microgel di distribuzione dimensionale ristretta. In questa sintesi protocollo, luce caratterizzazione dispersione e unico rilevamento di fluorescenza delle particelle di questi microgel in una configurazione di microscopia a largo campo sono dimostrati.

Sintesi controllata e fluorescenza di monitoraggio altamente uniforme Poli (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) microgel

Questo protocollo descrive la sintesi e la formulazione di biomateriali idrogel iniettabili, supramolecolari polimeri-nanoparticella (PNP). Vengono dimostrate le applicazioni di questi materiali per la somministrazione di farmaci, la stabilizzazione biofarmaceutica e l'incapsulamento e la consegna delle cellule.

Idrogel supramolecolari supramolecolari iniettabili per applicazioni di somministrazione di cellule e farmaci

La tecnica proposta fornirà un approccio nuovo, efficiente, frugale e non invasivo per l'imaging del flusso fluidico attraverso un letto di polvere imballato, producendo un'elevata risoluzione spaziale e temporale.

Tecnica di imaging frugale del flusso capillare attraverso polveri di stampa polimerica tridimensionale

Presentiamo un protocollo per l'implementazione della microscopia a riflessione di interferenza e della microscopia a riflessione totale interna-fluorescenza per l'imaging simultaneo di microtubuli dinamici e proteine associate a microtubuli marcati fluorescenti.

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna simultanea e riflessione interna totale per l'imaging di microtubuli dinamici e proteine associate

Qui viene presentato un protocollo per eseguire e analizzare il legame, la mobilità e l'assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate artificiali utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale a singola molecola (smTIRF).

Diffusione e assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate di polimeri

Questo protocollo descrive in dettaglio la progettazione e la fabbricazione di un dispositivo microfluidico adatto per studiare la meccanica dei polimeri dei microtubuli. La sintesi di tecniche di microfabbricazione, controllo automatizzato del flusso e modellazione computazionale consente un sistema flessibile ideale per sondare il citoscheletro cellulare in vitro.

Sviluppo di un approccio basato sulla microfluidica per lo studio della meccanica dei polimeri dei microtubuli

Scopri la microscopia confocale per analizzare il comportamento di fase e le proprietà di trasporto di sospensioni colloidali attrattive confinate. Questa tecnica rivela come il confinamento geometrico modifica la dinamica strutturale.

Imaging confocale di confinati riposo e fluenti miscele colloidali e polimeri

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