Name: Applicazione di acido retinoico per ottenere colture osteocytes da principale del mouse osteoblasti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Impara a ottenere osteociti ramificati maturi da osteoblasti primari di topo usando l'acido retinoico (ATRA). Questo metodo permette di generare rapidamente popolazioni cellulari omogenee per studi di biologia ossea.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Il finanziamento è stato fornito da &quot;Progetto di un concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010&quot; per MD, e Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo la normativa vigente europee relative alla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e sono stati esaminati e approvati dal comitato etico dell&#39;Università di Milano e nazionali. 1. Isolamento di osteoblasti primari Il metodo, con lievi modifiche, segue la procedura descritta da Dodig et al 14. <ol><li> Preparare digerire medio, aggiungendo 0,1% collagenasi P e 0,05% tripsina (partendo dal 2,5% tripsina 10X, senza rosso fenolo) per mezzo HBSS (Hanks Balanced Salt Solution, senza calcio, magnesio, o rosso fenolo). </li><li> Utilizzare 3-4 giorni di età topi (il procedimento può essere applicato a appena 1 mouse). </li><li> Sacrifica per decapitazione. Spruzzare la testa con il 70% di etanolo e tenere in ghiaccio. Togliere la pelle e muscoli strati da pinzette e dissezione / forbici chirurgiche. </li><li> Rimuovere delicatamente le ossa parietali esepararli seguendo la sutura sagittale in due metà. Assicurarsi che le ossa sono liberi di suture e di eventuali tessuti aderenti e posizionare singoli pezzi ossei in piastre a pozzetti contenenti HBSS medio fino a quando la procedura è completata. </li><li> Scartare HBSS e aggiungere a ciascun pozzetto il mezzo digerire per 15 min a 37 ° C. </li><li> Scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere nuovamente il mezzo digerire per 15 min a 37 ° C. </li><li> Questa volta salvare il surnatante e trasferirla in alfa-MEM (Medium Minimum Essential) supplementato con 10% FBS (siero fetale bovino) e l&#39;1% di streptomicina / penicillina. </li><li> Ripetere i punti 1.7 e 1.8 2x. </li><li> In comune le tre frazioni raccolte, le cellule di spin mediante centrifugazione a 425 g per 5 minuti, scartare il surnatante, aggiungere 3 ml di INTEGRAZIONI alfa-MEM per risospendere il pellet cellulare, e trasferirli in un pallone di 25 centimetri 2. </li><li> Cambia il mezzo dopo 24 ore per rimuovere i detriti e le cellule morte. </li><li> Aggiungi l&#39;acido 50 mg / ml ascorbico (AA) e 3 mm Glycerol 2-fosfato idrato sale disodico (GP) al mezzo alfa-MEM. </li><li> Successivamente, cambiare il mezzo (alfa-MEM più AA / GP) a giorni alterni. </li></ol> 2. ATRA protocollo <ol><li> Condurre tutti gli esperimenti con ATRA (acido all-trans retinoico), in una stanza buia per evitare inattivazione. </li><li> Preparare una soluzione di tripsina 1X in HBSS medio e mantenerlo a 37 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Rimuovere il supporto da cellule subconfluenti e accuratamente lavarli con HBSS. </li><li> Aggiungere 1 ml di tripsina, ruotare delicatamente il pallone per consentire tutte le celle da coprire con tripsina, e incubare per 3 min a 37 ° C. </li><li> Controllare il distacco effettivo di cellule al microscopio invertito. </li><li> Aggiungere 3 ml di alfa-MEM per inattivare la tripsina. </li><li> Recuperare le cellule e centrifugare per 15 minuti a 425 g. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in terreno fresco. </li><li> Mettere una goccia in una camera di conteggio emocitometro, lasciare riposare per un paio di minuti e contare il cell numero. </li><li> Cellule posto a 25 centimetri 2 palloni con una densità di 10.000 cellule / cm 2 con alfa-MEM più AA / GP. Essere consapevoli del fatto che la densità cellulare è rilevante per lo sviluppo ottimale dei processi cellulari e contatti intercellulari. Una densità iniziale superiore a 10.000 cellule / cm 2 compromette il corretto sviluppo di processi cellulari, ma il numero di cellule inferiori provocare la morte prematura delle cellule, a causa dell&#39;assenza di contatti intercellulari. </li><li> Aggiungere 5 mM ATRA al mezzo ogni 24 ore. </li><li> Monitorare le cellule quotidianamente per valutare la morfologia: cambiamenti morfologici sono generalmente osservati dopo 48 ore. Se, dopo le prime 24-48 ore, le cellule sono ancora proliferano, replate alla densità sopra. Una popolazione omogenea di osteocytes matura è presente dopo 4-5 giorni. A seconda delle esigenze, utilizzare cellule in qualsiasi punto di tempo, fino a 12-15 giorni. </li><li> Quando le cellule vengono piastrate su altri supporti (come coprioggetto o piastre a pozzetti), assicurarsi che la densità sopra è mantenuta econtinuare ad aggiungere ATRA ogni 24 ore fino al momento dell&#39;uso. Lasciare cellule di aderire al nuovo supporto per almeno 24 ore prima dell&#39;esperimento. </li></ol> 3. Immunostaining <ol><li> Per immunostaining, piastra le cellule su vetrini e seguire le metodologie stabilite (si veda ad esempio Burry 15). </li><li> Ad esempio, per immunofluorescenza indiretta, fissare in paraformaldeide al 4% o acetone freddo, incubare sequenzialmente con l&#39;anticorpo primario a temperatura ambiente per 1 ora in una camera umidificata, poi con l&#39;anticorpo secondario marcato fluorescente al buio, a temperatura ambiente per 30 min, in una camera umidificata. </li><li> Utilizzare DAPI o analoghi per contrasto nucleare, e montare anti-fading medio. </li></ol> 4. Alizarina rossa colorazione e estrazione <ol><li> Piastra le cellule su vetrini. </li><li> Fissare le cellule immergendo il vetrino in etanolo al 70% per 10 min. </li><li> Coprire le cellule con alcune gocce di soluzione colorante rosso alizarina (1 mg / ml, pH 5,5)per 30 minuti. </li><li> Lavare i coprioggetti con acqua di rubinetto. Montare con una goccia di glicerolo su vetrini e prendere le immagini utilizzando un microscopio verticale a 10X e 20X di ingrandimento. </li><li> Dopo la procedura di cui sopra, recuperare i coprioggetto immergendo i vetrini in acqua di rubinetto. </li><li> Mettere ogni vetrino in una piastra ben. </li><li> Aggiungere acido perclorico al 60% (la quantità deve essere sufficiente a coprire completamente le cellule) e lasciare O / N a 4 ° C con agitazione. </li><li> Leggere la densità ottica del surnatante mediante spettrofotometria a 450 nm. </li><li> Per normalizzare i valori per numero di cellule, aggiungere Janus verde (soluzione allo 0,2% in PBS) per coprire il preparato cellulare per 10 min. </li><li> Lavare accuratamente con acqua ultrapura. </li><li> Aggiungere 0,5 N HCl (la quantità deve essere sufficiente a coprire tutte le cellule) e agitare delicatamente a mano per pochi secondi. </li><li> Leggere l&#39;assorbanza a 615 nm mediante spettrofotometria. </li></ol>

<ol><li>Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+quantitative+3D+imaging+of+the+osteocyte+lacuno-canalicular+network%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network.</a> Bone. 47 (5), 848-858 (2010).</li>
<li>Cheng, F., Hulley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteocyte--a+novel+endocrine+regulator+of+body+phosphate+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Maturitas%22%5BJournal%5D)">The osteocyte--a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis.</a> Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).</li>
<li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> 45 (4), 682-692 (2009).</li>
<li>Dallas, S. L., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+transition+from+osteoblast+to+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte.</a> Ann N Y Acad Sci. 1192, 437-443 (2010).</li>
<li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of osteocytes.</a> J Bone Miner Res. 7 (4), 389-396 (1992).</li>
<li>Nijweide, P. J., van der Plas, A., Alblas, M. J., Klein-Nulend, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+isolation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Osteocyte isolation and culture.</a> Methods Mol Med. 80, 41-50 (2003).</li>
<li>Stern, A. R., Stern, M. M., Van Dyke, M. E., Jähn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+osteocytes+from+the+long+bones+of+skeletally+mature+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice.</a> Biotechniques. 52 (6), 361-373 Forthcoming.</li>
<li>Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte.</a> Bone. 54 (2), 296-206 Forthcoming.</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+an+osteocyte-like+cell+line%2C+MLO-Y4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Metab%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4.</a> J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).</li>
<li>Mattinzoli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+of+in+vitro+osteocytogenesis+induced+by+retinoic+acid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment.</a> Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).</li>
<li>Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoids+in+embryonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Retinoids in embryonal development.</a> Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).</li>
<li>Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+all-trans+retinoic+acid+in+neurite+outgrowth+and+axonal+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation.</a> J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).</li>
<li>Vaughan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATRA+induces+podocyte+differentiation+and+alters+nephrin+and+podocin+expression+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo.</a> Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).</li>
<li>Dodig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+TAAT-containing+motif+required+for+high+level+expression+of+the+COL1A1+promoter+in+differentiated+osteoblasts+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice.</a> J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).</li>
<li>Burry, R. W. Immunocytochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurry%2C+RW+%22A+practical+guide+for+biomedical+research%22">A practical guide for biomedical research</a>. , Springer. New York Dordrecht Heidelberg London. (2010).</li>
<li>Woo, S. M., Rosse, rJ., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
<li>Gu, G., Nars, M., Hentune, nT. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).</li>
<li>Boukhechba, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+osteocyte+differentiation+in+a+3D+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system.</a> J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).</li>
<li>Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenesis+in+vitro%3A+from+pre-osteoblasts+to+osteocytes%3A+a+contribution+from+the+Osteobiology+Research+Group%2C+The+Pennsylvania+State+University%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 Forthcoming.</li>
<li>Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+mineralization+as+a+trigger+for+osteocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation.</a> J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 Forthcoming.</li>
<li>Hirao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+is+an+important+mediator+of+the+transformation+of+osteoblasts+to+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes.</a> J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).</li>
<li>Brounais, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+oncostatin+M+treatment+induces+an+osteocyte-like+differentiation+on+osteosarcoma+and+calvaria%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria.</a> Bone. 44 (5), 830-839 (2009).</li>
<li>Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+an+osteocyte-like+phenotype+by+fibroblast+growth+factor-2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2.</a> Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).</li>
<li>Poole, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sclerostin+is+a+delayed+secreted+product+of+osteocytes+that+inhibits+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation.</a> FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).</li>
<li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Osteocyte%3A+An+Endocrine+Cell+and+More%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">The Osteocyte: An Endocrine Cell and More.</a> Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Negli ultimi anni il osteociti è emerso come la cella più centrale nell&#39;osso. Progressi della ricerca stanno progressivamente rivelando un certo numero di proprietà osteociti insospettabili o non provati, che sono di enorme valore per la progettazione di nuovi e migliore trattamento per una varietà di malattie delle ossa. Tuttavia, indagini di biologia osteociti è stato colpito dalla limitata disponibilità di modelli in vitro a tal punto che osteoblasti sono state usate come cellule surrogati per un lungo p...

Osteociti, il più abbondante tipo cellule ossee, sono terminalmente differenziate, cellule altamente ramificati localizzati in profondità all&#39;interno dello scheletro. Il corpo cellulare dei osteocytes mature sono contenute nelle lacune di osso e hanno forme diverse; osteociti con corpi cellulari allungati si trovano nell&#39;osso corticale, osteociti arrotondati che sono più frequenti nell&#39;osso trabecolare 1. Dendriti ramificati estendono dal corpo cellulare e risiedono in piccoli canali chiamati canalicoli, formando una rete complessa che rende più contatti non solo con altri osteociti, ma anche con altri tipi di cellule di midollo, midollo osseo, vasi sanguigni e periciti associati. Attraverso il fluido interstiziale contenuta in lacune e canalicoli, osteociti sono anche definitiva collegato al sistema di circolazione, quindi possono influenzare non solo locale ma anche eventi sistemici, e viceversa il loro comportamento può essere regolata da variazioni sia locali che sistemici 2. Ilstudio di osteociti ha recentemente acquisito slancio, grazie a diversi miglioramenti tecnici, quali la generazione di tessuti e animali transgenici cellula-specifici, l&#39;uso di potenti tecniche di microscopia e di high throughput screening molecolare 3,4. Tuttavia, la conoscenza di queste cellule è ancora incompleta, principalmente a causa della relativa scarsità di adeguati modelli in vitro. In realtà, osteociti sono stati sempre difficili da ottenere e mantenere in coltura a causa della posizione profonda, e il basso livello di proliferazione che caratterizza tale tipo di cellula differenziata. Nel corso degli anni, un certo numero di metodi sono stati sviluppati per isolare osteociti primario 5-7, se generalmente producono produzioni di cellule basse e comportano il rischio che anche alcuni fibroblasti contaminanti saranno rapidamente invadere il osteociti 8. Per questo motivo, più sperimentale in opera vitro è stato condotto finora sulla cella osteociti consolidata line MLO-Y4 9. Metodologie aggiuntive in vitro potrebbero aumentare la possibilità di studiare queste cellule e potrebbero migliorare l&#39;analisi della osteociti biologia e fisiopatologia. Per essere ampiamente adottati, tali metodi dovrebbero essere facili da riprodurre, e non richiederebbero particolari strumentazioni o tempi molto lunghi per raggiungere la maturazione delle cellule. Importante, se applicabile a cellule primarie, che consentirebbero di sfruttare animali transgenici. Recentemente abbiamo descritto che il trattamento della linea cellulare osteoblastica MC3T3-E1 e di osteoblasti primari con acido retinoico induce un cambiamento fenotipo rapido portando allo sviluppo di una popolazione omogenea di cellule ramificate recanti caratteristiche morfologiche e molecolari di osteociti 10. All-trans retinoico (ATRA) è un prodotto del metabolismo attivo della vitamina A che regola la trascrizione genica legandosi ai recettori dell&#39;acido retinoico nucleari (ARSA). RARslegarsi al DNA come eterodimeri con i retinoidi X recettori (RXRs), portando in definitiva a modulazione di acido retinoico (RA)-reattiva geni bersaglio 11. ATRA è stato dimostrato che modulano la differenziazione e la maturazione dei diversi tipi di cellule, tra i quali altre cellule ramificate come le cellule neuronali 12 e podociti 13. Il metodo qui descritto è basato sulla aggiunta di ATRA di osteoblasti primari. Per essere efficace, ATRA deve essere aggiunto in una fase di maturazione preciso su cellule piastrate ad una densità definita; nella nostra esperienza queste condizioni sono fondamentali per ottenere l&#39;interruttore fenotipo di osteoblasti a osteocytes.

<table><tbody><tr><td>Collagenasi P</td><td>Roche Applied Science</td><td>11213857001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14175129</td><td>Pre-riscaldare a 37 ° deg; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>22571038</td><td>Pre-riscaldare a 37 gradi C prima dell'uso</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Streptomicina/Penicillina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo 2-fosfato sale disodico idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>ATRA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>Proteggere l'ATRA dalla luce</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Sciogliere in PBS e filtrare prima dell'uso. Lavorare sempre sotto una cappa chimica.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32670</td><td>Può essere aggiunto all'anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Alizarina rosso</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Janus Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201677</td><td></td></tr><tr><td>Acido perclorico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>176745</td><td>Usare con cautela (si raccomanda la protezione della pelle e degli occhi)</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Usare con cautela (si consiglia di proteggere la pelle e gli occhi)</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsave</td><td>Calbiochem - Merck</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Economy Pinzetta #7, punte da 0,40 x 0,5 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>501981</td><td></td></tr><tr><td>Economy Pinzetta #4, punte da 0,40 x 0,45 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>501978</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione, diritte, curve 10 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14394</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche, 14 cm, diritte, palloni da coltura S/S</td><td>World Precision Instruments</td><td>501218</td><td></td></tr><tr><td>Piastre</td><td>per</td> pozzetti Cor <td>430168</td><td></td>ning</tr><tr><td></td><td>3335</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti Thermanox</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>12-565-27</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss Spettrometro Apotome</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Safas Xenius</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

applicazione di acido retinoico per ottenere colture osteocytes da principale del mouse osteoblasti

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

<html> La necessità di culture osteociti è ben noto alla comunità dei ricercatori ossee; isolamento di osteociti primario è difficile e produce il numero di cellule bassi. Pertanto, il sistema cellulare più usato è la linea cellulare MLO-Y4 osteociti-like. Il metodo qui descritto si riferisce all&#39;uso di acido retinoico per generare una popolazione omogenea di cellule ramificate con caratteristiche osteociti morfologici e molecolari. Dopo l&#39;isolamento degli osteoblasti da calvaria topo, acido all-trans retinoico (ATRA) viene aggiunto a un terreno cella, e di monitoraggio delle cellule viene effettuato giornalmente al microscopio invertito. I primi cambiamenti morfologici sono rilevabili dopo 2 giorni di trattamento e differenziazione, è completa in 5 giorni, con progressivo sviluppo dei dendriti, perdita della capacità di produrre matrice extracellulare, down-regulation dei marcatori osteoblasti e up-regolazione di molecole specifiche per osteociti. contenuto &quot;&gt; monitoraggio delle cellule giornaliero è necessaria a causa della variabilità intrinseca delle cellule primarie, e il protocollo può essere adattato con minime variazioni di cellule ottenute da diversi ceppi di topi e applicate ai modelli transgenici. Il metodo è di facile esecuzione e non richiede strumenti speciali, è altamente riproducibile, e genera rapidamente una popolazione osteociti maturo in completa assenza di matrice extracellulare, permettendo l&#39;uso di queste cellule per applicazioni biologiche illimitati.

Risultati sono stati ottenuti da 5 a 10 esperimenti indipendenti. Morfologia cellulare AA / GP trattati con cellule primarie hanno caratteristiche prevalentemente di ciottoli simili, caratteristici degli osteoblasti maturi. Cellule ramificate intervallati (come indicato dalle frecce rosse in figura 1A) possono essere trovati, che probabilmente rappresentano alcuni osteocytes. Con il trattamento ATRA, le cellule in rapida in...

Trattamento di osteoblasti di topo primari con acido retinoico produce una popolazione omogenea di cellule ramificate recanti caratteristiche morfologiche e molecolari di osteociti. Il metodo supera la difficoltà di ottenere e mantenere osteociti primari in coltura, e può essere vantaggioso per studiare cellule derivate da modelli transgenici.

Applicazione di acido retinoico per ottenere colture osteocytes da principale del mouse osteoblasti

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere osteociti maturi ramificati a partire da osteoblasti primari. Questo risultato si ottiene innanzitutto isolando osteoblasti primari dalle ossa di topi neonati e coltivandoli per consentire la maturazione degli osteoblasti. Successivamente, gli osteoblasti confluenti vengono trattati con tripsina.Successivamente, le cellule vengono contate e reimpiantate a una densità definita per garantire il successo. Quindi, all'ambiente cellulare viene aggiunto acido tutto-trans retinoico o ATRA per ridurre la proliferazione cellulare e indurre una completa differenziazione verso una morfologia di osteocita. I risultati ottenuti mostrano che in presenza di ATRA le cellule acquisiscono rapidamente una morfologia ramificata, interrompono la produzione di matrice extracellulare e si differenziano verso un fenotipo maturo di osteocita, come dimostrato dall'espressione dei marcatori degli osteociti. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'isolamento di osteociti primari o la differenziazione di osteoblasti in una matrice tridimensionale, è che essa produce un numero sufficiente di osteociti in pochi giorni.L'assenza di metriche circostanti facilita l'uso di queste cellule in saggi di biologia cellulare e biologia molecolare su N cellule. Inoltre, il metodo può essere applicato a topi transgenici, consentendo studi funzionali su molecole di interesse. A dimostrare la procedura sarà Deborah, un dottorato del mio laboratorio.Per iniziare, preparare il mezzo digestivo aggiungendo 0,1% di collagenasi P e 0,05% di tripsina in soluzione salina equilibrata di Hank o HBSS. Dopo l'eutanasia e la decapitazione di topi di tre o quattro giorni di vita, spruzzare la testa con etanolo al 70% e posizionarla sul ghiaccio. Quindi, utilizzando pinzette e forbici da dissezione, rimuovere gli strati di pelle e muscolo.Rimuovere delicatamente le ossa parietali e separarle in due parti seguendo la sutura sagittale. Dopo aver rimosso tutte le suture e i tessuti aderenti, posizionare i singoli frammenti ossei nel mezzo HBSS. Successivamente, scartare l'HBSS e aggiungere il mezzo digestivo a ciascuno.Quindi incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo aver eliminato il soprannatante, aggiungere mezzo di digestione fresco e ripetere l'incubazione. Dopo la seconda incubazione, raccogliere il soprannatante e combinarlo con alfa mam integrato con FBS e pen strep.Ripetere la digestione altre due volte. Unire il soprannatante al mezzo, quindi centrifugare le frazioni combinate a 425 G per cinque minuti, scartare il soprannatante e risospendere il pellet in alfa MEM integrato, prima di trasferire la sospensione cellulare in una fiala da 25 centimetri quadrati. Dopo aver incubato a 37 gradi Celsius per 24 ore, rimuovere i detriti e le cellule morte.Quindi aggiungere alpha mem, seguito da 50 microgrammi per millilitro di acido ascorbico o aa, e da tre millimoli di glicerofosfato disodico, sale idrato, o GP, alla coltura prima di reinserirla nell'incubatore. Dopo aver rimosso il mezzo da cellule subconfluenti e averle lavate con HBSS, aggiungere tripsina appena preparata e incubare per tre minuti. A 37 gradi Celsius, quando le cellule si sono staccate, aggiungere tre millilitri di mezzo Alpha M per inattivare la tripsina.Raccogliere le cellule e centrifugare a 425 G per 15 minuti prima della risospensione, sospendendo il pellet cellulare in mezzo fresco; posizionare una goccia della sospensione in un emocitometro. Lasciare sedimentare per alcuni minuti e contare le cellule utilizzando alpha men plus A A GP. Trasferire le cellule in fiasche da 25 centimetri quadrati a una densità di 10.000 cellule per centimetro quadrato. Una densità cellulare più elevata comprometterà lo sviluppo adeguato dei processi cellulari, mentre un numero inferiore di cellule può portare alla morte cellulare a causa dell’assenza di contatti intercellulari. Durante l’incubazione, aggiungere ATRA al mezzo a una concentrazione di cinque micromolari ogni 24 ore.Generalmente, i cambiamenti morfologici si osservano dopo 48 ore. Una popolazione omogenea di osteociti maturi dovrebbe essere presente dopo quattro o cinque giorni. Le cellule possono essere utilizzate fino a 12-15 giorni, come mostrato qui.Le cellule primarie trattate con GP presentano per lo più caratteristiche simili a selciato. Sono presenti cellule con aspetto tipico di osteoblasti maturi. Le cellule ramificate indicate dalle frecce rosse rappresentano probabilmente alcuni osteociti.Dopo due giorni di trattamento con ATRA, le cellule iniziano rapidamente a mostrare ramificazioni, come visibile in questa figura. Le cellule ramificate necessitano di spazio per estendere i loro dendriti e, man mano che il trattamento con ARA prosegue, le ramificazioni aumentano progressivamente in numero e complessità. La colorazione dell'actina filamentosa mediante la dominio rho marcato con foid mette in evidenza i prolungamenti cellulari.Gli osteoblasti primari producono grandi quantità di matrice calcificata, che si accumula sopra e tra le cellule ed è visibile mediante colorazione con rosso alizarina. Al contrario, gli osteociti non producono matrice extracellulare calcificata e la colorazione con rosso alizarina risulta completamente negativa nelle cellule incubate con ATRA. Di conseguenza, dopo la procedura di estrazione non si rileva alcun rosso alizarina o solo quantità minime.Come mostrato qui, la colorazione immunologica per sclerostina rivela un'espressione citoplasmatica intensa e la presenza di punti positivi lungo i prolungamenti cellulari. Inoltre, FGF 23 è altamente rilevabile nelle cellule trattate con ATRA sia nel corpo cellulare che lungo i prolungamenti cellulari.Mentre si esegue questa procedura, è importante ricordare che si stanno utilizzando cellule primarie, pertanto potrebbe essere necessario regolare la concentrazione di aro e sostituire le cellule. Se la proliferazione rimane elevata dopo una tradizione, ciò deve essere preso in considerazione, specialmente quando si lavora con animali transgenici. Ricordare che la morfologia cellulare è fondamentale per guidare ogni passaggio di questo metodo.Controllare la cellula ogni giorno al microscopio invertito.

application-retinoic-acid-to-obtain-osteocytes-cultures-from-primary

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video mostra una tecnica di colorazione per rilevare l'entità della mineralizzazione o della deposizione di calcio in osteoblasti primari in coltura utilizzando il colorante rosso alizarina.

Colorazione con rosso di alizarina: una tecnica per visualizzare la mineralizzazione da parte di osteoblasti in coltura

In questo video, descriviamo un saggio di riassorbimento osteoclastico in vitro su piastre di coltura cellulare rivestite di fosfato di calcio coltivate con osteoclasti derivati da cellule mononucleate di sangue periferico umano. Gli osteoclasti formano un caratteristico anello di actina sulla matrice rivestita di fosfato di calcio della piastra di coltura cellulare e degradano la matrice all'interno della regione dell'anello di actina per rilasciare ioni calcio e fosfato, con conseguente...

Saggio del pozzo di riassorbimento: una tecnica in vitro per quantificare l'attività di riassorbimento del calcio degli osteoclasti maturi utilizzando piastre di coltura rivestite di fosfato di calcio

Gli osteoclasti sono cellule che riassorbono l'osso principale nel corpo. La capacità di isolare osteoclasti in gran numero ha causato notevoli progressi nella comprensione della biologia osteoclasti. In questo protocollo, si descrive un metodo per l'isolamento, la coltivazione e quantificare l'attività degli osteoclasti in vitro.

Osteoclasti derivazione dal midollo osseo di topo

La segnalazione notch è una forma di comunicazione cellulare che si basa sul contatto diretto tra le cellule. Per indurre correttamente la segnalazione di Notch in vitro, i ligandi di Notch devono essere presentati alle cellule in uno stato immobilizzato. Questo protocollo descrive i metodi per la stimolazione in vitro della segnalazione Notch nei precursori degli osteoclasti di topo.

La stimolazione di Notch segnalazione in mouse osteoclasti Precursori

Questo manoscritto descrive un protocollo a isolare e cultura gli osteoclasti in vitro da midollo osseo di topo e di studiare il ruolo della destinazione dei mammiferi/meccanicistica della rapamicina complesso 1 nella formazione degli osteoclasti.

Un base di RANKL Osteoclast cultura Assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti

In questo articolo, presentiamo metodi per isolare e differenziare cellule stromali del midollo osseo e cellule staminali ematopoietiche da ossa lunghe del mouse. Due differenti protocolli sono presentati ottenendo diverse popolazioni cellulari adatte per espansione e differenziazione in osteoblasti, adipociti e gli osteoclasti.

Isolamento, la cultura e la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e dei progenitori degli osteoclasti dai topi

Il numero di nuovi biomateriali ingegnerizzati per la riparazione di lesioni dell'osso grande è in continua espansione con l'obiettivo di migliorare la guarigione ossea e superare le complicazioni connesse con trapianto osseo. Qui, presentiamo una strategia multidisciplinare per test di biocompatibilità pre-clinico di biomateriali per riparazione ossea.

Profilo di compatibilità biologica sui biomateriali per la rigenerazione ossea

Gli osteoclasti sono polykaryons di macrofage specifici del tessuto derivato dal lignaggio dei monociti-macrofage delle cellule staminali ematopoietiche. Questo protocollo descrive come isolare le cellule del midollo osseo in modo da ottenere grandi quantità di osteoclasti riducendo il rischio di incidenti riscontrati nei metodi tradizionali.

Isolamento, purificazione e differenziazione dei precursori dell'osteoclast dal midollo osseo del ratto

Questo protocollo descrive la dissezione della calvaria di topo neonatale dmp1-topazio e l'isolamento degli osteociti che esprimono la proteina fluorescente verde attraverso la digestione e il frazionamento cellulare, oltre alla preparazione degli osteociti per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).

Ottenere osteociti primari attraverso il frazionamento calvario murino degli osteociti che esprimono GFP

Qui, presentiamo una procedura di analisi semplice ed efficace per i saggi di riassorbimento della fossa utilizzando piastre di coltura cellulare rivestite di fosfato di calcio.

Un semplice protocollo di analisi dei pozzi per visualizzare e quantificare il riassorbimento osteoclastico in vitro

Questo studio fornisce un protocollo per l'utilizzo di topi knockout Stat3 inducibili specifici per il lignaggio osteoblastico per studiare il rimodellamento osseo sotto la forza ortodontica e descrive i metodi per analizzare il rimodellamento dell'osso alveolare durante il movimento ortodontico dei denti, facendo così luce sulla biologia meccanica scheletrica.

Utilizzo di topi knockout Stat3 inducibili specifici per il lignaggio osteoblastico per studiare il rimodellamento dell'osso alveolare durante il movimento ortodontico dei denti

Impara a ottenere osteociti ramificati maturi da osteoblasti primari di topo usando l'acido retinoico (ATRA). Questo metodo permette di generare rapidamente popolazioni cellulari omogenee per studi di biologia ossea.

Applicazione di acido retinoico per ottenere colture osteocytes da principale del mouse osteoblasti

Esplora altri video