Misurare spinale Presinaptiche inibizione nei topi radice dorsale Recording potenziale

L'inibizione presinaptica è uno dei meccanismi inibitori più potenti nel midollo spinale. Cambiamenti patologici nell'inibizione presinaptica sono coinvolti in diversi meccanismi di malattia. Ad esempio, il dolore neuropatico e infiammatorio, così come un'alterata elaborazione centrale del dolore.

È importante nelle lesioni del midollo spinale e nei disturbi del sistema nervoso centrale con ipereccitabilità motoria. Pertanto, quando si studiano modelli animali di queste patologie, conoscere l'intensità dell'inibizione presinaptica fornirebbe informazioni significative. Presentiamo qui un metodo per valutare l'inibizione presinaptica in un modello murino.

L'inibizione presinaptica in vivo è mediata dalla depolarizzazione delle fibre afferenti primarie, che viene indotta da sinapsi asso-assoniche GABAergiche sulle fibre presinaptiche sensoriali. L'attività del recettore GABA_A determina un aumento della conduttanza al cloruro, che a sua volta provoca la depolarizzazione afferente primaria a causa della distribuzione ionica locale. Questa depolarizzazione blocca la propagazione dei potenziali d'azione verso i terminali assonici e ne riduce l'intensità, portando a una diminuzione dell'ingresso di calcio e alla riduzione del rilascio del neurotrasmettitore.

Pertanto, i potenziali postsinaptici eccitatori nei neuroni monosinaptici possono essere inibiti senza modificare il potenziale di membrana postsinaptico e l'eccitabilità dei potenziali condotti di volume dei neuroni moderni; il potenziale di depolarizzazione primario di questo ENT fornisce una misura diretta dell'inibizione presinaptica nel midollo spinale, e questi potenziali possono essere misurati dalle radici dorsali del midollo spinale dopo stimolazione, ed sono chiamati potenziali delle radici dorsali. La misurazione dei potenziali delle radici dorsali è ben consolidata ed è stata ampiamente utilizzata in gatti, ratti e rane, ma nei topi le registrazioni sono state effettuate quasi esclusivamente in preparati spinali isolati ex vivo. Qui descriviamo un metodo per registrare tali potenziali radicolari in topi anestetizzati in vivo, consentendo una misura diretta dell'inibizione presinaptica nell'organismo integro.

Per la registrazione del DRP nei topi in vivo, è necessario il seguente equipaggiamento. Strumenti standard per zuccheri, un microscopio stereoscopico e tre manipolatori manuali per posizionare rispettivamente l'elettrodo di stimolazione, l'elettrodo di registrazione e l'elettrodo di riferimento. Inoltre, un telaio per topo e un sistema di riscaldamento per controllare la temperatura corporea del topo durante la stimolazione e la registrazione, singolarmente o con lo stimolatore.

Sono necessari un amplificatore standard e una raccolta dati per migliorare il rapporto segnale-rumore. Durante la registrazione del DRP, sono necessari elettrodi a sezione personalizzata per la loro fabbricazione. Tirare un tubo di vetro convenzionale con un tiratore di pipette standard.

Rompere la punta dell'elettrodo utilizzando una lima di diamante per allargare l'apertura della punta. Lucidare la punta con una fiamma da laboratorio standard per renderla liscia. Prima di iniziare la preparazione, anestetizzare l'animale mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e fissare la testa del topo all'interno del telaio stereotassico.

Quindi verificare la profondità dell'anestesia pizzicando il PO posteriore del topo. Iniziare la preparazione solo quando non è visibile alcun ritrarsi del PO; la profondità dell'anestesia deve essere controllata ripetutamente durante l'intervento. Iniezioni ripetute di ketamina nel muscolo quadriceps posteriore.

Protrarre l'anestesia, monitorare la temperatura corporea dell'animale con la sonda rettale. Per la preparazione della colonna dorsale, aprire la cute lungo la linea mediana dorsale.

Separa la pelle dal tessuto sottostante per isolare la vertebra dal tessuto connettivo circostante. Effettua due incisioni su entrambi i lati della spina dorsale e allarga le incisioni spingendo i tessuti verso l'esterno con il bisturi. Quindi rimuovi i processi spinosi S utilizzando un piccolo estrattore osseo.

Partendo dai livelli lombari, procedere verso i livelli toracici medi per prevenire l'essiccazione della ferita operatoria. Posizionare piccoli pezzi di garza attorno alla ferita e inumidirli con cloruro di sodio 0,9%.

Quindi iniziare a preparare il midollo spinale a partire dalla regione lombare. Inserire con attenzione la punta del bisturi osseo nello spazio compreso tra due vertebre adiacenti. Prestare particolare attenzione a ridurre al minimo la pressione esercitata sul midollo spinale.

Procedere a livelli toracici inumiditi nel midollo spinale con fluido cerebrospinale artificiale. Eseguire questa operazione ripetutamente durante tutti i passaggi successivi. Aprire con attenzione il durometro utilizzando un ago da 30 gauge.

Quindi allentare e separare due radici adiacenti ipsilaterali dal midollo spinale. Successivamente, recidere le radici il più distalmente possibile. Durante la procedura.

Evitare un eccessivo tiraggio delle radici poiché ciò comprometterebbe irrimediabilmente un corretto registro del potenziale dorsale radicolare (DRP). Dopo aver posizionato l'elettrodo di riferimento vicino al midollo spinale, avvicinare la punta di un elettrodo a sezione alla porzione prossimale di una radice dorsale. Successivamente, posizionare la radice dorsale sopra l'apertura della punta dell'elettrodo a suggizione.

Successivamente, aspirare la radice dorsale all'interno dell'elettrodo applicando una breve pressione negativa tramite una siringa collegata all'elettrodo. Quindi riempire l'elettrodo con un liquido CSF applicando una leggera pressione negativa continua finché la soluzione non circonda sia la radice dorsale sia il filo di argento clorurato all'interno dell'elettrodo. In seguito, sollevare la punta dell'elettrodo dal midollo spinale in modo che nessun ponte liquido crei un cortocircuito nell'elettrodo.

Ripetere i passaggi per la seconda radice ipsi-adiacente. Una volta posizionati entrambi gli elettrodi, iniziare la registrazione dei potenziali della radice dorsale stimolando una via mentre si registra dall'altra; aumentare la tensione dello stimolo fino a livelli sovramassimali. Le registrazioni tipiche dei potenziali della radice dorsale sono simili a quella mostrata nel pannello di sinistra.

Un breve artefatto di stimolazione è seguito da una breve deflessione positiva e da una deflessione negativa prolungata. L'ultima deflessione è il potenziale effettivo della radice dorsale. La sua ampiezza può essere calcolata rispetto alla linea di base registrata direttamente prima del tracciato dello stimolo.

Diversi tracciati da una coppia di radici possono presentare artefatti dovuti ai movimenti respiratori e/o artefatti dell'ECG che potrebbero interferire con il potenziale di risposta dorsale registrato. Dopo una registrazione riuscita, è possibile scambiare il sito di stimolazione con quello di registrazione ed effettuare una seconda registrazione. Il metodo di registrazione presentato.

La registrazione dei potenziali radicolari nel mio modello in vivo consente la valutazione dell'attività primaria, dell'anti-polarizzazione e dell'animale integro, specialmente in combinazione con topi geneticamente modificati. Può rappresentare uno strumento potente per indagare i meccanismi alla base dell'inibizione spinale. L'integrazione spinale è fondamentale per la funzione motoria e la percezione sensoriale multimodale.

Questo metodo è utile nella ricerca su dolore, lesioni del midollo spinale, lesioni dei nervi periferici e infiammazione. La registrazione del DRP in vivo consente di analizzare le interazioni tra l'attività sopraspinale e il pad. Questo non è possibile nelle preparazioni isolate del midollo spinale comunemente utilizzate per misurare il DRP nei topi.

In linea di principio, è possibile applicare un farmaco al midollo spinale durante la registrazione. L'applicazione locale mediante pipette aggiuntive potrebbe potenziare e accelerare il controllo della concentrazione locale del farmaco.