Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è garantire la completa transezione del midollo spinale nel pesce zebra larvale attraverso un rendimento relativamente elevato e un metodo riproducibile, massimizzando al contempo la sopravvivenza. Ciò si ottiene accoppiando prima gli adulti del genotipo appropriato e lo screening se necessario. Il secondo passo è allevare gli embrioni fino a cinque giorni dopo la fecondazione.

Successivamente, eseguire la transezione con una pipetta per microiniezione smussata. Infine, i pesci feriti possono riprendersi in terreni trattati con antibiotici fino alla fine dell'esperimento. In definitiva, la microscopia a immunofluorescenza viene utilizzata per mostrare la risposta dei progenitori neurali alla lesione.

I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come quelli sperimentati dai laboratori Becker e fetcher, includono un numero maggiore di animali da studiare, un tempo di recupero più breve e l'uso di strumenti genetici non altrimenti disponibili nel pesce zebra adulto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della rigenerazione, come la risposta dei progenitori neurali alle lesioni. Iniziare i preparativi realizzando piastre chirurgiche utilizzando piastre di Petri da 60 millimetri e il kit di elastomeri siliconici cell guard 180 4.

Seguendo le istruzioni del produttore. Riempite i piatti, non più della metà e lasciateli polimerizzare. Quindi conservare le stoviglie coperte a temperatura ambiente.

Successivamente, fabbricare micropipette riscaldando e tirando un tubo capillare in silicato di bo a parete sottile in una micro pipetta polare, utilizzando le stesse impostazioni utilizzate per realizzare aghi per microiniezione al microscopio da dissezione. Utilizzare una pinza per staccare la punta della micropipetta a circa 200 micron di diametro. Quindi smussare il bordo rotto con una micro smerigliatrice inizialmente a 35 gradi, seguita da una seconda smussatura a 25 gradi quando il rumore di macinazione cessa.

Controllare sotto un cannocchiale da dissezione per assicurarsi che la punta sia affilata e liscia. L'uso di una punta troppo larga tende a provocare un numero maggiore di decessi a causa della maggiore probabilità di intaccare l'aorta dorsale. Mentre una punta troppo stretta tende a sfiorare la pelle piuttosto che tagliare il tessuto, conservare le micropipette correttamente smussate in una capsula di Petri su una piccola quantità di argilla sette giorni prima dell'intervento.

Allestire vasche di accoppiamento di maschi e femmine di spr. I pesci raccolgono gli embrioni fecondati la mattina seguente, tre ore dopo l'accensione delle luci. Per garantire la massima resa.

Se si utilizza una linea reporter transgenica con genotipi misti, posizionare 100 embrioni per piastra, incubare le piastre a 28,5 gradi Celsius. Se si utilizza una linea reporter, eseguire lo screening degli embrioni per l'espressione fluorescente a 48 ore. Post fecondazione.

Lascia che gli embrioni fluorescenti maturino a 28,5 gradi Celsius quando le larve o cinque giorni dopo la fecondazione. Preparare la placca chirurgica coprendo la protezione cellulare con E due e 10 milligrammi per litro, gentamicina solfato e trica. Inoltre, preparare una piastra di recupero aggiungendo 25 millilitri di E two e gentamicina solfato a una piastra di Petri da 100 millimetri.

Il passo successivo è preparare un manico di bisturi fissando insieme tre tamponi. Questo forma uno strumento triangolare con tre scanalature. Successivamente, montare la micro pipetta preparata sui tamponi fissandola con nastro adesivo in una delle scanalature per completare il bisturi, mettere da parte la micro pipetta fino al momento del bisogno.

Inizia l'intervento anestetizzando una piastra di 25 larve alla volta. Con la trica, i pesci sono sufficientemente anestetizzati quando non mostrano più una risposta al tatto. Trasferire le larve su una piastra chirurgica e posizionare la piastra sotto un microscopio da dissezione.

Sotto l'ingrandimento massimo, ruota una larva in modo che si sdrai su un fianco con la parte posteriore più vicina alla mano che tiene il bisturi. Posizionare la pinza in modo che poggi sulla protezione della cella. Angolato sulla larghezza delle larve, appoggia il bisturi di vetro contro uno dei bracci del forcipe.

Tagliare la faccia laterale dorsale delle larve a livello del poro anale. Facendo attenzione a non tagliare oltre il bordo ventrale del cordino no. Quindi attorcigliare il bisturi per recidere il midollo spinale.

La torsione richiesta è solitamente molto inferiore a 90 gradi. Ripetere la transezione del midollo spinale con le larve rimanenti. Una volta completato l'intervento chirurgico sul lotto di larve, utilizzare una pipetta posteriore e una pompa per pipette per trasferire gli animali feriti alla piastra di recupero.

Per eliminare l'anestesia, assicurati di raccogliere prima la testa o la coda della larva durante il trasferimento. Non stressare il sito della lesione piegando le larve dopo che l'anestesia è svanita. Trasferire le larve ferite dalla piastra di recupero alle piastre da 100 millimetri riempite con 25 millilitri di E two e gentamicina solfato a una densità di 25 larve per piastra.

Quindi mettili in un'incubatrice a 28,5 gradi Celsius mentre la ferita guarisce. Controlla le targhe ogni giorno. Rimozione di animali malati o morti.

Non cambiare il terreno fino a quando i pollai di protozoi d'acqua dolce non sono visibili nel terreno. Quando si cambia il supporto, non trasferire il pesce in un nuovo piatto. Invece, rimuovi il più possibile il terreno e inonda la stessa lastra con nuovi mezzi.

Ripetere il cambio di terreno se necessario per ridurre la popolazione dei pollai. Nutri le larve ogni giorno con una piccola quantità di cibo per avannotti in polvere. Un pesce zebra con un midollo spinale completamente sezionato viene mostrato qui in un giorno.

Dopo la lesione, la GFP è espressa in tutti i neuroni e la freccia gialla identifica il sito della lesione. Un pesce zebra con un midollo spinale completamente sezionato è mostrato qui a tre giorni dopo l'infortunio a tre giorni dopo l'infortunio. Questo pesce zebra marcato con UCD fisso mostra un midollo spinale completamente sezionato.

La freccia gialla identifica nuovamente il sito della lesione. Al contrario, la regione contigua dell'etichettatura dei neuroni lungo il bordo ventrale del midollo spinale. In questi tre giorni dopo l'infortunio, il pesce zebra fisso indica una transezione incompleta.

Una volta padroneggiate, 300 larve all'ora possono essere lavorate con questa tecnica.