Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish
21 maggio 2014
Dopo la sezione spinale, zebrafish adulto ha recupero funzionale da sei settimane post-infortunio. Per usufruire di trasparenza larvale e recupero più veloce, vi presentiamo un metodo per sezionare il midollo spinale larvale. Dopo la resezione, osserviamo il recupero sensoriale che inizia a 2 giorni dopo l'infortunio, e il movimento C-bend per tre giorni post-infortunio.
L'obiettivo generale di questa procedura è garantire una sezione completa del midollo spinale nei pesci zebra larvali attraverso un metodo relativamente ad alto rendimento e riproducibile, massimizzando al contempo la sopravvivenza. Questo risultato si ottiene innanzitutto accoppiando adulti del genotipo appropriato e effettuando le necessarie analisi di selezione. Il secondo passaggio consiste nell'allevare gli embrioni fino a cinque giorni dopo la fecondazione.
Successivamente, eseguire la transezione con una pipetta per microiniezione smussata. Infine, ai pesci feriti viene consentito di riprendersi in un mezzo trattato con antibiotici fino al termine dell'esperimento. In ultima analisi, la microscopia a immunofluorescenza viene utilizzata per mostrare la risposta dei progenitori neurali alla lesione.
I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come quelli sviluppati nei laboratori di Becker e Fetcher, includono un numero maggiore di animali da studiare, un tempo di recupero più breve e l'utilizzo di strumenti genetici non altrimenti disponibili nel pesce zebra adulto. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della rigenerazione, come la risposta dei progenitori neurali alla lesione. Iniziare i preparativi creando piastre chirurgiche utilizzando piatti di Petri da 60 millimetri e il kit di elastomero siliconico Sylgard 180.
Seguire le istruzioni del produttore. Riempire le piastre, senza superare la metà della capacità, e lasciarle polimerizzare. Successivamente, conservare le piastre coperte a temperatura ambiente.
Successivamente, preparare micropipette riscaldando e tirando tubi capillari in borosilicato con pareti sottili in un polarizzatore per micropipette, utilizzando le stesse impostazioni impiegate per la fabbricazione di aghi per microiniezione sotto un microscopio stereoscopico. Utilizzare pinzette per spezzare la punta della micropipetta fino a un diametro di circa 200 micron. Quindi smussare il bordo fratturato con una mola micrometrica, inizialmente a 35 gradi, seguito da un secondo smusso a 25 gradi quando il rumore della molatura cessa.
Verificare al microscopio stereoscopico che la punta sia affilata e liscia. L'utilizzo di una punta troppo larga tende a provocare un numero maggiore di decessi a causa dell'aumentata probabilità di lesione dell'aorta dorsale. D’altra parte, una punta troppo stretta tende a scivolare sulla pelle anziché tagliare il tessuto; pertanto, conservare le micropipette correttamente smussate in una capsula di Petri su una piccola quantità di argilla sette giorni prima dell'intervento chirurgico.
Preparare vasche di accoppiamento con maschi e femmine di spr. I pesci raccolgono gli embrioni fecondati la mattina successiva, tre ore dopo l'accensione delle luci. Per garantire la resa massima.
Se si utilizza una linea trasgenica con genotipi misti, posizionare 100 embrioni per piastra e incubare le piastre a 28,5 gradi Celsius. Se si utilizza una linea reporter, esaminare gli embrioni per l'espressione fluorescente a 48 ore dalla fecondazione.
Lasciare maturare gli embrioni fluorescenti a 28,5 gradi Celsius fino alle larve o ai cinque giorni post-fecondazione. Preparare la piastra per l'intervento chirurgico coprendo la griglia cellulare con E due e 10 milligrammi per litro di solfato di gentamicina e trica. Inoltre, preparare una capsula di recupero aggiungendo 25 millilitri di E due e solfato di gentamicina a una capsula di Petri da 100 millimetri.
Il passo successivo consiste nel preparare un manico di bisturi incollando insieme tre tamponi. Questo forma uno strumento triangolare con tre scanalature. Successivamente, montare la micropipetta preparata sui tamponi fissandola con del nastro adesivo in una delle scanalature per completare il bisturi; quindi, mettere da parte la micropipetta fino al momento dell'utilizzo.
Iniziare l'intervento anestetizzando una piastra di 25 larve alla volta. Con la trica, i pesci sono sufficientemente anestetizzati quando non presentano più una risposta al tocco. Trasferire le larve in una piastra per intervento e posizionare la piastra sotto un microscopio stereoscopico.
Con l'ingrandimento massimo, ruotare una larva in modo che giaccia su un fianco, con la schiena rivolta verso la mano che tiene il bisturi. Posizionare la pinzetta in modo che poggia sulla guardia cellulare. Inclinare trasversalmente rispetto alla larghezza della larva, appoggiando il bisturi in vetro su uno dei bracci della pinzetta.
Tagliare nella faccia laterale dorsale delle larve a livello del poro anale. Assicurarsi di non tagliare oltre il margine ventrale del cordone nervoso. Quindi ruotare il bisturi per recidere il midollo spinale.
La torsione richiesta è solitamente molto inferiore ai 90 gradi. Ripetere la sezione del midollo spinale con le larve rimanenti. Una volta completata la chirurgia sul gruppo di larve, utilizzare una pipetta posteriore e una pompa per pipetta per trasferire gli animali feriti alla piastra di recupero.
Per eliminare l'anestesia, assicurarsi di raccogliere prima la testa o la coda della larva durante il trasferimento. Non stressare il sito della lesione piegando le larve dopo che l'anestesia è svanita. Trasferire le larve ferite dalla piastra di recupero alle piastre da 100 millimetri contenenti 25 millilitri di E due e solfato di gentamicina, a una densità di 25 larve per piastra.
Quindi posizionarli in un incubatore a 28,5 gradi Celsius mentre la ferita guarisce. Controllare le piastre ogni giorno. Rimuovere eventuali animali malati o morti.
Non cambiare il mezzo finché non diventano visibili nel mezzo i costrutti di protozoi d'acqua dolce. Quando si cambia il mezzo, non trasferire il pesce in una nuova piastra. Invece, rimuovere il più possibile il mezzo e allagare la stessa piastra con nuovo mezzo.
Ripetere il cambio del mezzo secondo necessità per ridurre la popolazione di coops. Nutrire le larve quotidianamente con una piccola quantità di cibo in polvere per avannotti. Qui viene mostrato un pesce zebra con il midollo spinale completamente trasversalizzato a un giorno.
Dopo la lesione, la GFP viene espressa in tutti i neuroni e la freccia gialla identifica il sito della lesione. Qui è mostrato un pesce zebra con il midollo spinale completamente trassecato a tre giorni dalla lesione. Questo pesce zebra fissato e marcato UCD mostra un midollo spinale completamente trassecato.
La freccia gialla identifica nuovamente il sito della lesione. Al contrario, la regione contigua di marcatura dei neuroni lungo il margine ventrale del midollo spinale. In questo pesce zebra fissato a tre giorni dalla lesione, si osserva una sezione incompleta.
Una volta acquisita padronanza, questa tecnica consente di processare 300 larve all'ora.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per la sezione del midollo spinale in zebrafish larvali, sfruttando la loro trasparenza e il rapido recupero. Dopo la sezione, il recupero sensoriale viene osservato già a partire da 2 giorni dopo la lesione, con movimenti a C osservati entro 3 giorni dopo la lesione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia Rigenerativa
- Modelli di Zebrafish
Sfondo
- Le lesioni del midollo spinale presentano sfide significative nella fase di recupero.
- Il pesce zebra è un modello prezioso per lo studio della rigenerazione del midollo spinale.
- I pesci zebra larvali offrono vantaggi grazie alla loro trasparenza e al rapido processo di guarigione.
- Comprendere i meccanismi di recupero può orientare le strategie terapeutiche.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo riproducibile per la sezione del midollo spinale nei zebrafish larvali.
- Valutare la tempistica e i meccanismi di recupero successivi alla lesione.
- Utilizzare la microscopia a immunofluorescenza per valutare le risposte neurali.
Metodi Utilizzati
- Accoppiamento di zebrafish adulti del genotipo appropriato.
- Selezione e allevamento degli embrioni fino a cinque giorni dopo la fecondazione.
- Tranciamento eseguito utilizzando una pipetta microiniettiva smussata.
- Ripristino dei pesci feriti in un mezzo trattato con antibiotici.
Risultati principali
- Recupero funzionale osservato entro sei settimane dal trauma.
- Il recupero sensoriale inizia a 2 giorni dal trauma.
- Il movimento a C è rilevato entro 3 giorni dal trauma.
- La microscopia a immunofluorescenza rivela la risposta dei progenitori neurali.
Conclusioni
- Il metodo consente una sezione trasversale efficace del midollo spinale nei zebrafish larvali.
- Il rapido recupero fornisce informazioni sulla rigenerazione del midollo spinale.
- I risultati potrebbero contribuire alla comprensione dei meccanismi di riparazione neurale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I pesci zebra larvali permettono una valutazione rapida e ad alto rendimento della rigenerazione del midollo spinale, offrendo un modello complementare ai sistemi adulti per la riduzione del rischio meccanicistico nelle fasi iniziali. Il metodo supporta la validazione degli obiettivi fornendo letture quantificabili del recupero funzionale e sensoriale entro pochi giorni, accelerando la valutazione preclinica di candidati neuro-riparatori. Questo approccio aumenta la sicurezza predittiva nell'interazione con l'obiettivo e nella modulazione del percorso prima dell'ottimizzazione del composto leader.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'interrogazione di ipotesi terapeutiche relative alla ricrescita assonale e all'avvio della neurogenesi.
- Valore operativo: Fornisce metriche riproducibili di taglio e recupero per una valutazione coerente dell'interazione con il bersaglio.
- Valore predittivo: I primi riscontri sensoriali e motori supportano la validazione funzionale del bersaglio e la riduzione dei rischi associati al percorso.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera modelli standardizzati di lesione adatti per lo screening di composti e l'analisi della risposta in funzione della dose.
- Parametri quantitativi: Consente la misurazione dell'insorgenza del recupero sensoriale (2 dpi), del movimento a C-bend (3 dpi) e della ripresa della nuotata (5 dpi) come endpoint funzionali.
- Scalabilità: Permette l'elaborazione di fino a 300 larve all'ora, facilitando campagne di screening a medio rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella meccanismi conservati di rigenerazione rilevanti per la fisiopatologia delle lesioni del midollo spinale umano.
- Continuità traslazionale: Collega le scoperte alla validazione preclinica attraverso letture condivise delle risposte dei progenitori neurali.
- Avanzamento ponderato sul rischio: Permette decisioni precoci di prosegui/non-prosegui basate sulla cinetica del recupero funzionale, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo un modello vertebrale per la validazione dell'obiettivo e lo screening meccanicistico prima dell'identificazione del capostipite.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su bersagli neuro- rigenerativi attraverso linee temporali osservabili di recupero sensoriale e motorio.
- Screening: Fornisce fenotipi standardizzati e quantificabili per valutare gli effetti dei composti sulla rigenerazione.
- Analisi: La microscopia a immunofluorescenza consente una quantificazione oggettiva della proliferazione e migrazione dei progenitori neurali come biomarcatori meccanicistici.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti nei larvi ai modelli di zebrafish adulti e mammiferi attraverso vie di rigenerazione conservate.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la validazione iterativa di bersagli in diversi programmi di neuro-rigenerazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi attraverso l'osservazione diretta della dinamica di rigenerazione.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità e standardizzazione mediante protocolli definiti di transezione e recupero.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo una valutazione funzionale precoce degli obiettivi.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione adeguata al rischio dei candidati neuroregenerativi in base alla cinetica di recupero.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche nella gestione del pesce zebra, microchirurgia e microscopia a fluorescenza.
- È dipendente dalla preparazione delle pipette per microiniezione e dall'infrastruttura per l'osservazione del comportamento.
- Necessita di protocolli standardizzati per anestesia e recupero, comuni a tutti i gruppi di lavoro.
- Le considerazioni per l'adattamento includono il background genetico e la compatibilità con i reporter transgenici.
- I limiti pratici comprendono le dimensioni ridotte delle larve e la necessità di una tecnica precisa di transezione dorso-laterale.
