Name: Espressione transiente di proteine da parte idrodinamica Gene Consegna in topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Impara l'espressione transitoria di geni nei topi mediante consegna idrodinamica di DNA plasmidico. Questa tecnica consente l'analisi della funzione genica con minima risposta infiammatoria in vivo.

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Ringraziamo Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) per averci insegnato inizialmente la tecnica HGD e il dottor Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) per la sua continua guida in vari aspetti della tecnologia. Questo lavoro è stato finanziato da Hunter College, CUNY start up fondi e premio NSF Pane IOS-1249166. Ringraziamo il NYULMC Istopatologia Nucleo NYUCI Support Center Grant, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 per l&#39;esame istologico sui fegati di topo.

Tutti gli esperimenti qui descritti sono stati approvati dal Comitato di Hunter College Institutional Animal Care ed uso, City University of New York. 1. Preparazione privo di endotossine plasmide DNA <ol><li> Scegliere una singola colonia di batteri contenenti il ​​gene di interesse in un vettore di espressione di mammifero da una piastra selettiva appena striato. </li><li> Seguire le indicazioni fornite nel manuale di un kit di purificazione plasmide privo di endotossine disponibile in commercio per la coltivazione e la raccolta dei batteri. </li><li> Purificare il privo di endotossine DNA plasmidico da cellule batteriche seguendo il protocollo di un kit di purificazione plasmide privo di endotossine disponibile in commercio. </li><li> Utilizzare privo di endotossine plastico e maneggiare DNA con cura per assicurare che endotossine non è re-introdotto nel campione di DNA dopo la fase di rimozione. </li><li> Misurare la concentrazione di endotossina senza plasmide DNA determinando la sua assorbanza a 260 nm utilizzando un micrspettrofotometro o volumi UV come descritto di seguito o uno standard, spettrofotometro basato cuvetta. <ol><li> Pulire le superfici ottiche inferiori e superiori del sistema di ritenzione del campione spettrofotometro micro come segue. Dispensare 1 ml di acqua deionizzata pulita sul sistema ottico inferiore. Chiudere il braccio di leva e toccare un paio di volte a fare il bagno al sistema ottico superiore, quindi leva di apertura e pulire con un panno. </li><li> Aprire il software del micro spettrofotometro e selezionare il modulo acidi nucleici. </li><li> Mettere 1 ml di acqua pulita deionizzata sul sistema ottico inferiore, abbassare il braccio di leva e selezionare &quot;inizializzare&quot; dal programma software. Una volta che l&#39;inizializzazione è superfici completi, puliti sia ottici con un tessuto .. </li><li> Eseguire la misurazione in bianco caricando 1 ml di privo di endotossine tampone TE (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA) e selezionando &quot;vuoto&quot; dal programma software. Una volta che la misurazione in bianco è fatto, superfici pulite sia ottiche contessuto. </li><li> Eseguire la misurazione del campione caricando 1 ml di privo di endotossine campione di DNA e selezionando &quot;misura&quot; dal programma software. Registrare la concentrazione di DNA. Valutare la purezza del DNA registrando il rapporto di assorbanza 260/280 nm che appare sullo schermo. Poiché l&#39;uso di DNA puro (260/280 rapporto di 1,8) per HGD è altamente auspicabile, evitare di utilizzare un campione di DNA con un rapporto 260/280 sotto 1.7. Una volta misurazione viene effettuata, pulire entrambe le superfici ottiche con un fazzoletto. </li></ol></li></ol> 2. Pesatura dei topi <ol><li> Mark topi in modo appropriato per il ceppo. Nota: la marcatura della coda non è raccomandato per questa procedura. <ol><li> Specie di topo Mark che hanno pelliccia bianca (es. Swiss Webster) sulla schiena con un pennarello nero. Riapplicare marchi nel tempo necessario. </li><li> Mark specie di topo che hanno pelliccia nera (ad es C57BL / 6) a orecchio punzonatura diversi giorni di anticipo. </li></ol></li><li> Pesare topi individually mettendoli delicatamente in un piatto animale o secchio posto su una bilancia da laboratorio digitale. Registrare il peso di ciascun topo utilizzato nell&#39;esperimento, il giorno dell&#39;esperimento. </li></ol> 3. Preparazione di siringhe <ol><li> Preparazione della miscela di iniezione <ol><li> Calcolare la quantità di DNA necessaria assumendo 5-50 ug privo di endotossine DNA plasmidico per l&#39;iniezione di ciascun topo. <ol><li> Determinare la quantità ottimale di DNA plasmidico sperimentalmente. </li><li> Nel determinare la quantità di DNA necessaria, assumere l&#39;iniezione di un mouse aggiuntivo per ogni gruppo, come il caricamento corretto delle siringhe richiederà un po &#39;di mix di iniezione supplementare. Per aiutare i calcoli, si consideri il seguente esempio: iniettare 4 topi sperimentali e 4 di controllo, ciascuno del peso di 25 g, con 50 microgrammi di plasmide DNA per mouse. Per determinare la quantità di DNA necessaria in questo caso, calcolare con 5 topi per gruppo: 5 x 50 mcg = 250 ug di DNA necessarie per ciascun gruppo. </li></ol></li><li> Determinare la quantità di soluzione fisiologica (0,9% cloruro di sodio) necessari assumendo il 10% del peso corporeo per l&#39;iniezione di ciascun topo. <ol><li> Secondo l&#39;esempio di cui sopra, iniettare ogni 25 g mouse con 50 pg di DNA plasmidico in 2,5 ml di soluzione fisiologica (2,5 g di liquido). </li><li> Nel determinare la quantità di soluzione fisiologica necessaria per un intero gruppo di topi, assumere l&#39;iniezione di un mouse aggiuntivo per gruppo per consentire il caricamento corretto delle siringhe. Considerando l&#39;esperimento data, calcolare la quantità di soluzione fisiologica necessaria per 5 topi in ciascun gruppo: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml di soluzione fisiologica per ogni gruppo (o 25 ml totale). Nota: Se topi dello stesso gruppo non sono lo stesso peso (differenza superiore al 10% del peso corporeo), preparare iniezione mescola separatamente. </li></ol></li><li> Utilizzare conservanti e privo di endotossine, soluzione salina sterile che è stato approvato per uso umano, in 10 ml, più flaconi di utilizzo. </li><li> Utilizzando un ago calibro 20 (0,9 mm x 25 mm) attaccato ad una punta luer-lock di una siringa da 20 ml,prelevare il liquido da fiale saline e svuotare le siringhe in una provetta conica da 50 ml. Per aiutare pipettaggio accurata salina durante la preparazione delle miscele di iniezione di DNA-salina, soluzione salina raccogliere più del necessario per l&#39;iniezione di tutti i topi nell&#39;esperimento. Per l&#39;esperimento di cui sopra, ritirarsi salina da 3, 10 ml fiale (per un totale di circa 30 ml), anche se l&#39;importo calcolato di soluzione fisiologica necessari per l&#39;esperimento è solo 25 ml. </li><li> Pipettare la quantità calcolata di DNA in un tubo da 50 ml differente. Fate attenzione a non toccare il lato del tubo con il corpo pipetta per evitare l&#39;introduzione di endotossine. Secondo l&#39;esempio, pipettare 250 pg di controllo e 250 pg di DNA plasmidico sperimentale in provette coniche separati. </li><li> Aggiungere la quantità richiesta di soluzione salina al DNA usando una pipetta sierologica. Considerando l&#39;esperimento campione, pipettare 12,5 ml di soluzione salina a ciascuno dei Master Mix (sperimentale e di controllo). </li><li> Consentire tutte le soluzioni per raggiungeretemperatura ambiente prima dell&#39;iniezione. </li></ol></li><li> Preparazione di siringhe <ol><li> Per ciascun topo, riempire una sterile, 3 ml, siringa luer-lock con la miscela di DNA-salina sterile utilizzando una, ago 20 gauge (0,9 mm x 25 mm). Fare attenzione ad evitare bolle d&#39;aria. Evitare di utilizzare siringhe volumi elevati, la portata di iniezione non può essere controllato molto bene, ed è difficile da manipolare siringhe più grandi in una mano. Espellere qualsiasi mix di DNA-salina in eccesso nel tubo conico in quanto questo può essere riutilizzato. </li><li> Passare l&#39;ago di una sterile, ago 27-gauge. Riempire l&#39;ago con il liquido completamente senza introdurre bolle d&#39;aria. Regolare il volume della miscela di DNA-salina calcolato sulla base del peso del mouse. </li><li> Non permettere che l&#39;ago senza cappuccio di toccare qualsiasi superficie non sterile. Se necessario, gli aghi possono essere nuovamente presenze con la tecnica con una sola mano: mettere il tappo su una superficie piana, inserire l&#39;ago, senza trattenendo il tappo con l&#39;altra mano e premere l&#39;ago copertocontro un oggetto fermo per fissare il tappo sul dell&#39;ago. Le siringhe sono ora pronti per iniezioni vena della coda. </li></ol></li></ol> 4. Consegna del DNA idrodinamica <ol><li> Si noti che i topi anestetizzante può ridurre la vitalità. Evitare di eseguire HGD in una stanza che è troppo freddo, in quanto questo sarà anche ridurre la vitalità. Se la stanza ha una temperatura ambiente di 20 ° C o se si utilizza l&#39;anestesia, posizionare il mouse su una piastra elettrica a 37 ° C procedura di post per evitare la perdita di qualsiasi animale. Se si utilizza l&#39;anestesia, assicurarsi che la bocca e il muso del mouse mentre si libera sulla rampa di calore e osservare il mouse fino a che non si riprenda pienamente. Non trattenere cibo né acqua dai topi prima di HGD. </li><li> Riscaldare i topi di dilatare i vasi sanguigni. <ol><li> Posizionare la gabbia del mouse (con letti preparati) su un tappetino di calore per 5 minuti in modo che la temperatura della lettiera è di circa 38-39 ° C. La temperatura deve essere sufficientemente bassa per mantenere i topi sul tappetino calore per unperiodo prolungato. </li><li> In alternativa, posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione accesso dorsale con moderazione minima. Riscaldare la coda del topo per 1 min tenendolo delicatamente con una garza bagnata in acqua calda. Lasciare mouse per riposizionare, se necessario. Pulire la coda con un tessuto ad asciugare. </li><li> In alternativa, caldo mouse posizionando la gabbia sotto una lampada di calore per non più di 2 min. Se si utilizza una lampada di calore, cautela per evitare il surriscaldamento del mouse. </li></ol></li><li> Iniezione coda vena di grandi volumi <ol><li> Immobilizzare un accesso restrainer dorsale su una superficie piana nastro laboratorio. </li><li> Tenendo per la coda, posizionare il mouse delicatamente nel dispositivo di immobilizzazione e inserire la spina. Uso come poco fermo come necessario per mantenere la coda immobilizzato. Assicurarsi che il mouse respira liberamente. </li><li> Se il mouse è in grave crisi in qualsiasi momento durante la procedura, rimuovere il mouse dalla immobilizzazione immediatamente e lasciarlo riposare. </li><li> Posizionare il mouse in modouna delle vene caudale laterale è visibile. Individuare le vene caudali laterali da visto direttamente sul retro del mouse: la linea rossa scorre al centro della coda è un&#39;arteria, mentre le linee blu su entrambi i lati della coda sono le vene caudali laterali. </li><li> Pulire la coda del topo accuratamente con alcool. </li><li> Usando la mano non iniezione, tenere la coda stretta tra l&#39;indice e il medio in modo che la coda passa sotto l&#39;indice, il medio e l&#39;anulare e sotto il mignolo. Lasciare che il pollice di rimanere libero di muoversi. (Figura 1A) </li><li> Con l&#39;altra mano, pulire la zona da iniettare nuovamente con alcool. Lasciare asciugare zona. </li><li> Raccogliete la siringa caricata con il iniezione-mano e tenere per la canna tra il pollice e le altre quattro cifre. Non tenere su lo stantuffo. </li><li> Posizionare la siringa parallela alla coda con la punta dell&#39;ago verso il corpo del mouse ela smussatura (bordo inclinato) dell&#39;ago rivolta verso l&#39;alto. </li><li> Inserire l&#39;ago nella vena della coda. Procedere con l&#39;iniezione solo se la vena è posizionata correttamente, che è evidente dall&#39;ago scorrevole in senza resistenza. Si noti che la profondità di inserimento dell&#39;ago è una questione di preferenze personali però, pieno di inserimento non è raccomandato a causa di un aumentato rischio di taglio della vena. Evitare di spostare l&#39;ago. </li><li> Usando il pollice della mano-coda tenendo, chiudere sul mozzo dell&#39;ago e premere mozzo contro la coda di tenere l&#39;ago in posizione. Non applicare una pressione estrema e non tenere sull&#39;albero ago, in quanto questi saranno ostacolare il flusso di liquido nella vena. Tenere la coda con il dito indice liberamente a questo punto in modo da non ostacolare l&#39;iniezione (Figura 1A). </li><li> Riposizionare la mano-siringa che tiene in modo che il dito indice e medio stanno trattenendo la flangia e il pollice si trova all&#39;estremità dello stantuffo (Figure 1A). </li><li> Premere verso il basso sul pistone in un movimento continuo ed iniettare l&#39;intero volume del liquido in 6-8 sec. </li><li> Rimuovere l&#39;ago dalla vena e fermare l&#39;emorragia applicando una leggera pressione alla coda con un fazzoletto. </li><li> Rimuovere il mouse dal dispositivo di immobilizzazione e il luogo topo in una gabbia di recupero posta sulla cima di una piastra elettrica (biancheria da letto dovrebbe essere 37-38 ° C). Se la camera di iniezione è fredda, questo passaggio è fondamentale per la sopravvivenza del mouse. Tenere su la coda del topo fino sanguinamento si arresta completamente. </li><li> Osservare il mouse per 1 ora dopo la consegna del DNA idrodinamica. Un periodo iniziale di ansimare e di immobilità è normale a causa dell&#39;aritmia temporanea causata da HGD ma fare in modo che il mouse mostra segni di ripresa in circa 5 min. Se il respiro del mouse diventa estremamente superficiale, massaggiare delicatamente l&#39;addome del mouse per facilitare la respirazione. Si noti che il tasso di recupero può essere leggermente influenzata dal ceppo di topi utilizzato. </li><li> Topo di ritornoa gabbia alloggi e garantire che il mouse ha un abbondante approvvigionamento di cibo e acqua. </li></ol></li><li> Large-volume di iniezione coda vena con una posizione alternativa a mano <ol><li> Posizionare il mouse nel dispositivo di immobilizzazione e prepararsi per l&#39;iniezione seguendo i punti 4.3.1 tramite 4.3.5, come descritto in precedenza. </li><li> Appoggiare la mano non iniezione su una superficie piana con quattro dita piegate con un angolo di novanta gradi. Le dita (tutti tranne pollice) devono appoggiare su di loro, creando una piattaforma. Tenere la coda del topo tra il pollice e il dito di puntamento (Figura 1B). </li><li> Con l&#39;altra mano, pulire la zona da iniettare nuovamente con alcool. Lasciare asciugare zona. </li><li> Afferrare siringa con l&#39;iniezione mano tenendolo per la flangia e l&#39;estremità dello stantuffo, pronto per l&#39;iniezione. </li><li> Completare la procedura seguendo questo protocollo dal punto 4.3.9 fino al passo 4.3.17, come descritto in precedenza. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Quando eseguito correttamente, HGD è un mezzo straordinariamente efficace e sicuro di consegna transgene. I passaggi critici di successo HGD sono: 1) fornire la giusta quantità di DNA in un grande volume di soluzione salina veicolo 2) nella vena della coda del topo 3) in meno di 8 sec. Sebbene il processo di iniezione stesso richiede innegabilmente una certa destrezza manuale, il successo di questa procedura sei secondi si trova spesso in preparazione accurata dell&#39;esperimento. La quanti...

Fin dalla sua prima descrizione da Liu et al. Ed Zhang et al., Consegna del gene idrodinamico (HGD) è diventato uno strumento prezioso per studiare la funzione del gene in sistemi modello roditore 1, 2. La tecnica prevede l&#39;iniezione rapida (5-7 sec) di un grande volume (8-12% del peso corporeo) di soluzione nella vena caudale di topi per facilitare l&#39;assorbimento di DNA plasmidico da cellule di organi bersaglio 1, 2. Queste condizioni portano ad espressione genica robusta nel fegato e meno espressione genica nel rene, milza, polmone e cuore. Iniezione di 10 mg pCMV-LacZ plasmide può trasfettare fino al 40% degli epatociti, rendendo il HGD non virale in vivo metodo più efficiente, il trasferimento genico ad oggi 1. A differenza di vettori virali, pDNA è facile da preparare, non suscitare una risposta immunitaria nell&#39;ospite roditore 3 e non costituisce un rischio per la salute ricombinando con finevirus esogeni. Inoltre, poiché le molecole di DNA forniti da HGD non necessitano imballaggio, questo metodo è adatto per la consegna dei cromosomi batterici artificiali (BAC) grandi come 150 kb 4. Altri tipi di molecole che sono state fornite da un metodo idrodinamico includono RNA 5-10, Morpholinos 11, proteine ​​12, 13 e altre piccole molecole 12, 14. I vantaggi e gli svantaggi di HGD rispetto ad altri metodi di consegna sono stati discussi in eccellenti recensioni in letteratura 15-20 e un certo numero di autori hanno fornito una descrizione dettagliata della procedura 21-23. Introdurre transgeni in topi da HGD è sicuro ed efficace 1-3, 24 e il metodo è stato utilizzato in ratti con successo paragonabile 25. Con alcune modifiche, proof of concept esperimenti sono stati condotti in polli 26, rabi bit 27 e 28 suini, anche se, l&#39;applicazione in vivo di questa tecnica in animali più grandi rimane una sfida. Quando si utilizza questo metodo, un altro limite comune è che molti dei vettori di espressione di mammifero disponibili mancano i componenti per realizzare una persistente, elevato livello di espressione genica. Utilizzando un plasmide, espressione genica pCMV-Luc in organi bersaglio è evidente già dieci minuti dopo HGD, tuttavia, il livello di espressione iniziale elevato scende bruscamente nella prima settimana dopo l&#39;iniezione 1. Espressione del transgene a lungo termine è possibile a seconda del promotore e introni utilizzato nella progettazione plasmide 3, 24 iniezioni tuttavia, manutenzione di espressione genica di alto livello spesso richiede ripetuti. Per questo motivo, HGD potrebbe essere meno adatto per studiare le malattie croniche che sono il risultato di esposizione a lungo termine alle proteine ​​dannose o prodotti proteici. Con queste limitazioni, HGD è uno strumento estremamente potente per studiare il Poziale ruolo di un gene e l&#39;effetto di essa mutanti in vivo, così come gli effetti terapeutici e regolazione delle proteine ​​e per la creazione di modelli animali di malattia (per una rassegna, si veda 15). Ad esempio, HGD può essere utilizzato per assegnare funzioni ai domini e aminoacidi di proteine ​​introducendo singolarmente vari costrutti genici in topi che hanno i rispettivi geni messo fuori. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata in qualsiasi ceppo di topi. Questo protocollo descrive HGD in topi con un focus sugli aspetti tecnici necessari per raggiungere trasfezione di successo: corretto inserimento ago nella vena, volume di iniezione e la velocità di consegna. L&#39;applicazione di questo metodo è dimostrato in un modello murino di tripanosomiasi africana, una malattia fatale di esseri umani e animali 29, 30. Mentre diverse specie di trypanosomes causano malattie nel bestiame, la maggior parte non può causare malattie negli esseri umani a causa di complessi immuni innate in blood chiamate fattori litici tripanosoma (TLFs) 29, 31, 32. Questi, lipoproteine ​​ad alta densità formanti pori (HDL) contengono due uniche, specifiche primate-proteine:. HPR, il ligando, che facilita l&#39;assorbimento di TLFs in trypanosomes e APOL-I, la componente litica 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense è in grado di infettare gli esseri umani a causa di espressione di una resistenza associata proteine ​​del siero (SRA) che si lega e neutralizza umano APOL-I 34, 39. Baboon TLF non è neutralizzato da SRA grazie alla sua divergente APOL-I proteica 40. Come riportato in precedenza, utilizzando un vettore di espressione di mammifero (pRG977), espressione transgenica di babbuino componenti TLF nei topi conferisce protezione contro trypanosomes umane-infettivi 40. I dati rappresentativi presentati dimostrano come gene delivery idrodinamico può essere applicato per studiare gli effetti terapeutici di una proteina.

<table><tbody><tr><td>Salvietta imbevuta di alcol</td><td>Webcol</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>AST kit, Amplite Colorimetrico</td><td>AAT Bioquest</td><td>13801</td><td></td></tr><tr><td>Tubo conico, 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>KIMTECH</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Illuminatore per coda di topo</td><td>Braintree Scientific</td><td>Ago MTI RST</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>, 20 Gx 1 (0,9 mmx25 mm)</td><td>Ago</td><td>305175</td><td></td>BD</tr>, <tr><td>27 Gx 1/2 (0,9 mmx25 mm)</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>pRG977 (vettore di espressione dei mammiferi)</td><td>Contratto di trasferimento materiale</td> <td>Regeneron Pharmaceuticals</td><td></td> richiesto</tr><tr><td>Cloruro di sodio, 0,9% INJ USP 10 ml, Hospira&nbsp;</td>Siringa <td></td><td>Fisher NC9054335</td><td></td></tr><tr><td>, 3 ml, punta Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Luer Lock necessaria per resistere alla pressione dell'HGD</td></tr></tbody></table>

espressione transiente di proteine ​​da parte idrodinamica gene consegna in topi

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Espressione efficace dei transgeni in vivo è di fondamentale importanza nello studio funzione del gene e lo sviluppo di trattamenti per le malattie. Negli ultimi anni, la consegna del gene idrodinamico (HGD) è emersa come un metodo semplice, veloce, sicuro ed efficace per la consegna di transgeni in roditori. Questa tecnica si basa sulla forza generata dalla iniezione rapida di un gran volume di soluzione fisiologica per aumentare la permeabilità delle membrane cellulari di organi perfusi e quindi consegnare DNA nelle cellule. Uno dei principali vantaggi del HGD è la possibilità di introdurre transgeni in cellule di mammifero usando nuda DNA plasmidico (pDNA). L&#39;introduzione di un gene esogeno utilizzando un plasmide è minimamente laborioso, altamente efficiente e, contrariamente ai vettori virali, notevolmente sicuro. HGD è stato inizialmente utilizzato per trasportare i geni nei topi, è ora utilizzato per fornire una vasta gamma di sostanze, tra cui oligonucleotidi, cromosomi artificiali, RNA, proteine ​​e piccole molecole in topi, rattie, in misura limitata, altri animali. Questo protocollo descrive HGD nei topi e si concentra su tre aspetti fondamentali del metodo che sono fondamentali per eseguire la procedura correttamente: corretto inserimento dell&#39;ago nella vena, il volume di iniezione e la velocità di consegna. Esempi sono forniti per mostrare l&#39;applicazione di questo metodo per l&#39;espressione transiente dei due geni che codificano proteine ​​secrete, specifico primate-, apolipoproteina LI (APOL-I) e proteine ​​aptoglobina correlata (HPR).

Il corretto posizionamento dell&#39;ago nella vena della coda del topo (come illustrato nella Figura 1) è un prerequisito per ottenere con successo un transgene mediante trasfezione basato idrodinamica. Spesso la parte più impegnativa della tecnica, tuttavia, è il mantenimento dell&#39;ago all&#39;interno della vena caudale senza movimento in modo che l&#39;intero volume di iniezione può essere formulato entro 6-8 s. Piccoli errori durante il processo di iniezione possono causare notevolmente ridotta ef...

In trasfezione in vivo di DNA nudo dal gene delivery idrodinamico introduce geni nel tessuto di un animale con risposta infiammatoria minima. Quantità sufficiente di prodotto genico sono generate in modo tale che la funzione del gene e la regolazione così come la struttura e la funzione della proteina possono essere analizzati.

Espressione transiente di proteine ​​da parte idrodinamica Gene Consegna in topi

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

L'obiettivo generale di questa procedura è esprimere in modo transitorio geni nei topi utilizzando la somministrazione idrodinamica di geni, o HGD, a tale scopo. I topi vengono pesati e viene preparato un volume appropriato di soluzione salina contenente DNA plasmidico, che viene caricato in una siringa.Il topo viene quindi riscaldato per dilatare i vasi sanguigni della coda e posizionato in un contenitore di fissazione utilizzando l'arteria dorsale. Come riferimento, vengono individuate le vene laterali della coda e la miscela di DNA in soluzione salina viene iniettata in una di queste vene. Infine, il topo viene rimosso dal contenitore di fissazione e posizionato su un tappetino riscaldato per il recupero.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'espressione del transgene attraverso il monitoraggio dei livelli proteici nel sangue mediante Western blot. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come l'espressione mediante trasfusione virale, è che il trasferimento genico idrodinamico permette l'uso di DNA plasmidico nudo, che è facile da produrre, sicuro da utilizzare e presenta minori limitazioni di dimensione. Sono Daniela Kovacic.Sono un ricercatore postdottorato nel laboratorio della dottoressa Jane Raper e mostrerò questo metodo. Iniziare la procedura utilizzando un pennarello per segnare il dorso dei topi bianchi al fine di indicare il loro gruppo sperimentale, riapplicando i segni nel tempo secondo necessità. Nel giorno dell'esperimento, pesare ogni singolo topo in un contenitore per animali posizionato su una bilancia elettronica da laboratorio.Registrare il peso di ciascun topo seguendo le istruzioni riportate nel documento allegato. Preparare una quantità sufficiente di miscela per iniezione per ogni topo da trattare, aggiungendone uno in più poiché un corretto caricamento delle siringhe richiederà una certa quantità aggiuntiva di miscela. Utilizzare soluzione salina sterile, priva di conservanti e endotossine, approvata per uso umano.Dopo aver lasciato raggiungere a tutte le soluzioni la temperatura ambiente, applicare un ago sterile da 20 gauge a una siringa da tre millilitri con bloccaggio inferiore ed aspirare la miscela di DNA in soluzione salina x. Preparare una siringa per ogni iniezione. Accertarsi di non generare bolle d'aria.Evitare l'uso di siringhe con volume maggiore poiché la fluorite di iniezione non può essere controllata in modo preciso ed è difficile manovrare siringhe più grandi con una sola mano. Successivamente, passare a un ago sterile da 27 gauge. Regolare il volume della miscela di DNA e soluzione salina in base al calcolo effettuato.Espellere qualsiasi soluzione in eccesso nel tubo conico per un uso successivo. Questo riempirà l'ago, senza introdurre bolle d'aria.Non permettere che l'ago scoperto entri in contatto con superfici non sterili, al fine di proteggere l'ago prima delle iniezioni. Rimetti il cappuccio utilizzando una tecnica a una mano. Appoggia il cappuccio su una superficie piana e, senza afferrarlo con l'altra mano, inserisci l'ago e premi l'ago con il cappuccio contro un oggetto rigido.Per fissare il tappo, preparare tutte le siringhe necessarie nello stesso modo. Eseguire questa operazione prima di iniziare le iniezioni. Posizionare la gabbia del topo con la lettiera su un tappetino riscaldante per cinque minuti, in modo che la temperatura della lettiera raggiunga circa 38-39 gradi Celsius.Questo dilaterà i vasi sanguigni dei topi. Si noti che l'anestesia non è raccomandata per questa procedura mentre i topi si stanno riscaldando; utilizzare del nastro da laboratorio per fissare un contenitore di restrizione dorsale su una superficie piana. Trascorsi cinque minuti, togliere il cappuccio dalla siringa da utilizzare per la prima iniezione nei topi.Posizionare la siringa sul tappo per evitare che l'ago scoperto entri in contatto con superfici non pulite. Per motivi di sicurezza e igiene. Mantenere scoperto un solo ago alla volta.Successivamente, prendere un topo per la coda. Posizionarlo delicatamente nel dispositivo di contenimento e inserire il tappo. Utilizzare il minimo contenimento necessario per mantenere la coda immobilizzata.Assicurarsi che il topo respiri liberamente. Successivamente, individuare le vene laterali della coda osservando direttamente la parte posteriore del topo. La linea rossa che corre al centro della coda è un'arteria.Mentre le linee blu su entrambi i lati della coda sono le vene caudali laterali, posizionare il topo in modo che una delle vene caudali laterali sia visibile. Quindi pulire accuratamente la coda del topo con un batuffolo di alcol. Utilizzando la mano non impiegata per l'iniezione, tenere saldamente la coda tra l'indice e il medio in modo che la coda passi sotto l'indice, sopra il medio e l'anulare e sotto il mignolo.Lasciare il pollice libero di muoversi. Utilizzando l'altra mano, usare un tampone alcolico per detergere l'area di iniezione. Lasciare nuovamente asciugare l'area.Ora, con la mano che effettua l'iniezione, prendere la siringa caricata e tenerla per il corpo tra il pollice e le altre quattro dita. Non toccare lo stantuffo. Posizionare la siringa parallelamente alla coda, con l'ago rivolto verso il corpo del topo e il bisello o il bordo inclinato dell'ago rivolto verso l'alto.Inserire l'ago nella vena della coda. Se la vena è stata individuata correttamente, l'ago scivolerà all'interno senza resistenza; mantenendo fermo l'ago, utilizzare il pollice della mano che tiene la coda per premere sul connettore dell'ago e spingerlo contro la coda, in modo da mantenerlo in posizione. Non applicare pressione eccessiva e non afferrare il fusto dell'ago, poiché ciò ostacolerebbe il flusso del liquido all'interno della vena.Successivamente, riposizionare la mano che tiene la siringa in modo che l'indice e il medio afferrino la flangia e il pollice si trovi all'estremità dello stantuffo. Premere lo stantuffo con un movimento continuo e iniettare l'intero volume di liquido in sei-otto secondi. Rimuovere l'ago dalla vena e, con un fazzoletto, esercitare una leggera pressione sulla coda per arrestare eventuali sanguinamenti.Qui il processo di iniezione viene mostrato in tempo reale. Si noti che l'inserimento completo dell'ago non è raccomandato a causa del maggiore rischio di lesione della vena. Dopo l'iniezione, rimuovere il topo dal dispositivo di contenimento e posizionarlo in una gabbia di recupero posta sopra un tappetino riscaldante. Se la stanza in cui si effettua l'iniezione è fredda, questo passaggio è fondamentale per la sopravvivenza del topo.Tenere la coda del topo fino a quando l'emorragia non si ferma completamente. Osservare il topo per un'ora dopo la somministrazione idrodinamica del DNA.Un periodo iniziale di affanno e immobilit&agrave; &egrave; normale, ma assicurarsi che il topo mostri segni di ripresa. Circa cinque minuti dopo che il topo si &egrave; ripreso, riporlo nella gabbia di alloggio e assicurarsi che abbia una abbondante disponibilit&agrave; di cibo e acqua. Successivamente, illustreremo l'iniezione caudale utilizzando una posizione alternativa della mano.Questo metodo è particolarmente utile quando è necessario iniettare i topi più vicino alla base della coda. Ad esempio, quando si corregge un'iniezione fallita nello stesso giorno o quando si iniettano topi con code più corte, preparare il topo per l'iniezione e posizionarlo in un contenitore restrittivo. Come in precedenza, appoggiare la mano non utilizzata per l'iniezione su una superficie piana con quattro dita piegate ad un angolo di 90 gradi; le dita devono essere appoggiate l'una sull'altra.Per creare una piattaforma, tenere la coda del mouse tra il pollice e l'indice. Con l'altra mano, pulire la zona da iniettare con un batuffolo di alcol. Lasciare asciugare la zona.Prendere la siringa per iniezione con la mano che effettua l'iniezione e tenerla per la flangia e per l'estremità dello stantuffo, pronta per l'iniezione. Posizionare quindi la siringa parallelamente alla coda, con l'ago rivolto verso il corpo del topo e il bisellino dell'ago rivolto verso l'alto. Iniettare come in precedenza per valutare se l'aggiunta di un marcatore hiss in specifiche posizioni della sequenza interferisca con l'elaborazione e la secrezione corretta dell'APO di babbuino.Il topo è stato iniettato con un plasmide portante uno dei tre geni di APO L uno di babbuino con diversi marcatori istidinici, e un altro plasmide portante HPR di babbuino. L'esito delle iniezioni è stato valutato mediante analisi ematica occidentale dei livelli circolanti di HPR nel sangue del topo due giorni dopo l'iniezione. Come mostrato qui, HPR di babbuino è stato altamente espresso nel plasma di tutti i topi tranne uno, indicando che la trasfezione era riuscita.Leggere riduzioni nei livelli di espressione, come osservato in uno dei due topi in B APO L uno, gruppo con tag uno, sono generalmente attribuibili a una riduzione molto lieve della velocità di iniezione, pari a uno o due secondi. Qui, la corsia del campione plasmatico uno mostra un'assenza totale di espressione proteica. Ciò indica un fallimento di HGD, molto probabilmente dovuto all'iniezione incompleta del volume totale del veicolo di somministrazione. Per valutare l'effetto del tag hiss sulla secrezione ed espressione di B APO L uno, è stata inoltre analizzata l'espressione del tag hiss, come mostrato qui.Non è stato rilevato alcun livello di proteina con tag istidina nei gruppi uno e due. L'unico gruppo di topi in cui sono stati rilevati livelli della proteina nel plasma è stato il gruppo tre. Nel complesso, questi dati indicano che l'assenza della proteina con tag istidina nei gruppi uno e due è il risultato di differenze nell'espressione genica o nell'elaborazione della proteina, piuttosto che un fallimento delle iniezioni.Evidenzia inoltre l'importanza di includere una proteina tracciante nella miscela di iniezione per monitorare il successo della HGD. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare i topi e le siringhe e di come inserire l'ago nella vena della coda per l'iniezione rapida di DNA plasmidico al fine di esprimere geni nei topi mediante consegna genica idrodinamica. L'aspetto più difficile di questa procedura consiste nel mantenere l'ago in posizione per tutta la durata dell'iniezione.L'ago inserito correttamente potrebbe spostarsi dalla posizione a causa di movimenti accidentali da parte dell'operatore o del topo non anestetizzato, riducendo così la probabilità di successo. Evitiamo di iniettare topi con un peso superiore ai 27 grammi, poiché la manipolazione di una siringa caricata fino a una capacità di tre ml risulta più difficile.Abbiamo constatato che i topi del peso di 23-27 grammi sono i più agevoli da iniettare. Le vene dei topi con peso inferiore a 20 grammi potrebbero essere troppo piccole per l'iniezione.

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Iniezione idrodinamica pelvi renale per Non virali espressione delle proteine nel rene

Iniezione della vena della coda idrodinamica di vettori di integrazione basata su trasposone consente trasfezione stabile di epatociti murini in vivo. Qui, presentiamo un protocollo pratico per sistemi di transfezione che consente l'espressione costitutiva a lungo termine di un transgene singolo o combinato espressione costitutiva e doxiciclina-viscoelastico di un transgene o miR-shRNA nel fegato.

Sistemi costitutive e inducibile per la modificazione genetica In Vivo degli epatociti Mouse usando l'iniezione della vena della coda idrodinamica

Qui, presentiamo un protocollo per promuovere l'integrazione del transgene e produzione di topi transgenici fondatore con alta efficacia mediante una semplice iniezione di un vettore lentivirale nello spazio perivitellino di un ovocita fecondato.

Produzione di topi transgenici mediata lentivirali: un metodo semplice ed altamente efficiente per uno studio diretto dei fondatori

In questo articolo, forniamo che un protocollo dettagliato per l'espressione di proteine di fusione fluorescenti nel midollo osseo murino derivate macrofagi e cellule dendritiche. Il metodo si basa sulla trasduzione del midollo osseo progenitrici con retrovirali seguite da differenziazione in macrofagi e dendritiche cellule in vitro.

Espressione di proteine di fusione fluorescenti in macrofagi e cellule dendritiche derivate da midollo osseo Murine

Questo protocollo presenta un quadro metodologico dettagliato per la transgenesi basata sull'elettroporazione di cellule cardiache in cuori di topo in via di sviluppo. Le risorse video fornite qui faciliteranno l'apprendimento di questa tecnica versatile.

Un approccio efficiente alla transgenesi per la consegna genica nel cuore embrionale di topo

Impara l'espressione transitoria di geni nei topi mediante consegna idrodinamica di DNA plasmidico. Questa tecnica consente l'analisi della funzione genica con minima risposta infiammatoria in vivo.

Espressione transiente di proteine ​​da parte idrodinamica Gene Consegna in topi

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Espressione transiente di proteine da parte idrodinamica Gene Consegna in topi