In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire con successo la stimolazione optogenetica in vivo del sistema nervoso centrale dei roditori in un animale sveglio e in movimento libero. Ciò si ottiene impostando e configurando prima il sistema laser appropriato per l'esecuzione della stimolazione optogenetica. Successivamente, vengono configurate fibre ottiche compatibili con i test comportamentali per fornire luce laser a una fibra ottica impiantata e nella regione cerebrale di interesse che esprime l'opsina.

Quindi l'animale viene legato al sistema laser per la stimolazione optogenetica e viene inserito in un apparato di test comportamentale. Infine, i parametri definiti dallo sperimentatore della stimolazione luminosa per accendere o spegnere i neuroni vengono erogati mentre l'animale esegue un compito comportamentale. In definitiva, in vivo, la stimolazione optogenetica viene utilizzata per consentire il controllo in tempo reale di popolazioni definite di neuroni o circuiti neurali in animali svegli e comportanti per determinare il loro ruolo funzionale in un dato comportamento di interesse.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che consente il controllo in tempo reale di popolazioni di neuroni geneticamente e spazialmente definite in animali svegli e comportamentali con la risoluzione temporale necessaria per collegare i modelli di attività neurale a stati comportamentali complessi. Questo protocollo prevede l'uso di laser di classe tre B e richiede che vengano seguite un'adeguata formazione e linee guida di sicurezza. Gli occhiali di sicurezza devono essere indossati sempre quando si utilizzano laser con procedure di allineamento che presentano un rischio particolarmente elevato dopo l'installazione dell'apparato laser secondo il protocollo di testo, eseguire l'accoppiamento laser senza contatto del laser blu interno impostando prima gli interruttori sul retro del laser per la corrente e TTL per la modalità logica del transistor transistor per l'illuminazione costante sulla parte anteriore del driver, Assicurarsi che la manopola di alimentazione sia impostata su zero.

Quindi accendi il laser accendendo prima il driver, quindi il tasto laser. Per garantire la sicurezza degli occhi, regolare lentamente la manopola di alimentazione in modo che venga emesso circa un milliwatt di luce laser. Quindi attendere da 10 a 15 minuti affinché il laser si riscaldi.

Quindi, collegare il tester per cavi in fibra ottica direttamente all'estremità libera del cavo patch dell'accoppiatore e accendere il tester per cavi. Quindi regolare l'angolo dell'accoppiatore in modo che il raggio rosso viaggi dritto verso il centro dello specchio dicroico. Il percorso del raggio della luce rossa emessa dal tester per cavi è il percorso esatto che la luce laser in entrata dovrà seguire per essere accoppiata al laser.

Per eseguire un allineamento della rotta, utilizzare le manopole laterali e orizzontali sugli specchi cinematici per dirigere il raggio di luce laser nell'accoppiatore. Non preoccuparsi se in questo momento non viene emessa luce blu dal cavo patch collegato all'accoppiatore. Ora posiziona un singolo pezzo di carta semitraslucida direttamente davanti allo specchio dicroico tra il dicroico e l'accoppiatore.

Ci saranno sia un punto blu che uno rosso sullo stesso lato di questa carta rispettivamente dal laser e dal tester per cavi. Effettua regolazioni fini al primo specchietto di sterzo regolando attentamente le manopole laterali e orizzontali per allineare il centro del punto rosso con il punto blu. Spostare la carta indietro verso l'accoppiatore in modo che si trovi direttamente di fronte ad esso e regolare le manopole sul secondo specchio dicroico per allineare il raggio laser con il raggio rosso.

Continuare ad effettuare regolazioni fini ai due specchi fino a quando il centro dei raggi blu e rosso non è esattamente allineato. Coline, rimuovere il tester per cavi dal cavo di accoppiamento. La luce laser dovrebbe ora essere ammessa dall'estremità del cavo patch dell'accoppiatore.

Per determinare l'efficienza dell'accoppiamento, utilizzare un misuratore di potenza luminosa per confrontare la potenza luminosa che entra nell'accoppiatore con la potenza luminosa emessa dall'estremità della fibra. Un'efficienza di accoppiamento superiore all'80% è considerata molto buona pur mantenendo la posizione dello specchio dicroico. Utilizzare i due specchi di sterzo per il laser giallo esterno e seguire la procedura di allineamento appena dimostrata per l'accoppiamento del laser giallo per impostare una fibra ottica per stimolare un singolo topo.

Inizia utilizzando l'adattatore della staffa F-C-F-C-L collegato direttamente alla breadboard per collegare il cavo patch dell'accoppiatore a un cavo patch con guaina spessa. Collegare un giunto rotante del commutatore alle estremità libere del cavo patch con guaina spessa. Quindi collegare il cavo di cerotto per animali al commutatore.

Attacca un manicotto diviso di collegamento all'estremità metallica libera del cavo del cerotto per animali senza forzare il manicotto fino in fondo. Il selvatico lascia esposti circa 0,5 centimetri di manicotto in quanto questo è ciò che si collega alla fibra ottica fissata all'animale con un cavo BNC. Collegare il driver laser blu al generatore di impulsi e accendere il generatore di impulsi.

Ora indossa gli occhiali di sicurezza adeguati. Quindi, dopo essersi assicurati che la manopola di accensione sulla parte anteriore del driver sia impostata su zero, accendere il laser accendendo prima il driver, quindi il tasto laser con il laser impostato sulla modalità positiva TT L. Regolare lentamente la manopola sulla parte anteriore del laser e utilizzare un misuratore di potenza della luce per impostare un'emissione di luce da cinque a 10 milliwatt dalla punta del cavo del cerotto animale.

Per ulteriori dettagli su questa impostazione, fare riferimento al protocollo di testo. Passa il laser blu alla modalità analogica per la stimolazione in vivo e attendi da 10 a 15 minuti affinché il laser si riscaldi. Quindi, trattenere delicatamente il mouse e collegare il manicotto diviso sul cavo del cerotto animale alla fibra impiantabile cronica.

Assicurarsi che le estremità di entrambe le fibre entrino in contatto fisico l'una con l'altra utilizzando la fessura sul manicotto di collegamento come finestra per visualizzare il contatto diretto tra le due. Lasciare che il mouse si riprenda per alcuni minuti prima dell'inizio dei test comportamentali. Quindi posizionare l'animale nell'apparecchio per i test comportamentali, assicurandosi che il cavo del connettore sia privo di strappi.

Usa il generatore di impulsi per pulsare un laser blu a una frequenza predeterminata che attiverà l'opzione di scelta. Dopo aver completato l'esperimento, confermare istologicamente il posizionamento virale e delle fibre come indicato nel protocollo di testo allegato per un'interpretazione accurata dei risultati comportamentali. Al microscopio, controllare il sito di espressione dell'opsina e l'impianto di fibre e confermare visivamente il posizionamento appropriato dell'iniezione e dell'impianto del virus in base alle coordinate scelte.

In questo esempio di risultati comportamentali ottenuti attraverso la stimolazione optogenetica in vivo, i neuroni dopaminergici nell'area ventrale o VTA di topi crema di tirosina idrossilasi sono stati trasdotti con una funzione di passo stabile OPSIN o EYFP come virus controllato e un impianto di fibre è stato impiantato cronicamente. Gruppi di topi sono stati stimolati simultaneamente e il comportamento della locomotiva è stato registrato per un'ora, come dimostrato qui. La stimolazione ripetuta dell'ops e del topo trasdotto a sinistra ha portato a un fenotipo iperattivo che persisteva per tutta la durata della stimolazione.

Sebbene non sia stato osservato alcun cambiamento nel comportamento della locomotiva nel topo di controllo a destra dopo il test comportamentale, è stata eseguita l'immunoistochimica per verificare l'accuratezza del targeting virale sui neuroni dopamina VTA e il posizionamento delle fibre è stato confermato visivamente, come mostrato in questa figura Una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere utilizzata per manipolare l'attività neurale in una data regione del cervello di interesse in combinazione con una varietà di test comportamentali come lettura funzionale della modulazione del circuito neurale.