Hot Catalisi biologica: Calorimetria isotermica di titolazione per caratterizzare reazioni enzimatiche

L'esperimento seguente descrive un metodo affidabile, veloce e privo di marcature che impiega la calorimetria di titolazione isotermica per determinare quantitativamente la termodinamica e la cinetica delle reazioni enzimatiche in soluzione utilizzando il calore rilasciato e assorbito nel tempo come sonda interna. Ciò si ottiene consentendo che la reazione enzimatica avvenga nella cella del campione dello strumento a una temperatura costante e monitorando la deviazione della traccia di calore dalla linea di base iniziale. In un primo esperimento chiamato Metodo uno o M1, il substrato viene iniettato nella soluzione enzimatica e viene misurato il calore per la conversione completa del substrato consentendo di determinare l'entalpia molare totale della reazione.

In un secondo esperimento chiamato metodo due o M due, vengono eseguite iniezioni multiple del substrato, consentendo di misurare il tasso di produzione di calore nel tempo a diverse concentrazioni del substrato. I risultati derivati dai due esperimenti di calor metrico hanno permesso di determinare i parametri cinetici, kcat e km, ipotizzando una catalisi enzimatica del meis mentone. Il vantaggio principale dell'utilizzo della calorimetria per attrito isotermico rispetto ad altri metodi, come i saggi fotometrici petrolometrici che monitorano la formazione del prodotto nel tempo, è che l'ITC non richiede alcuna modifica ed etichettatura del sistema in analisi e richiede pochissima quantità di materiale in quanto utilizza il calore intrinseco di reazione come sonda interna, dimostrando che la procedura sarà lusai.

Uno studente di dottorato del nostro laboratorio Per prima cosa diluire una soluzione concentrata dell'enzima con due millilitri di tampone per ottenere una concentrazione enzimatica finale nell'intervallo nano molare per l'esperimento M1. Quindi aggiungere 0,5 millilitri di tampone a una soluzione concentrata del substrato per ottenere una concentrazione del substrato di almeno tre ordini di grandezza superiore alla concentrazione dell'enzima e superiore al km. Per l'esperimento M two, preparare una soluzione enzimatica da due millilitri con una concentrazione finale nell'intervallo da picamolare a nanomolare.

Diluire il substrato con 0,5 millilitri di tampone per ottenere una concentrazione del substrato nell'intervallo millimolare. Dopo aver verificato che la cella del campione e la siringa per iniezione siano pulite secondo le istruzioni del produttore, riempire la siringa di caricamento con acqua distillata. Quindi inserire delicatamente l'ago nella cella del campione, riempire la cella e rimuovere il liquido utilizzando il metodo precedentemente descritto, lavare la cella del campione due volte con acqua distillata e due volte con tampone.

Iniettare lentamente la soluzione enzimatica nella cellula fino a quando non fuoriesce dalla parte superiore dello stelo cellulare. Per rimuovere le bolle d'aria intrappolate nella cella del campione, produrre uno spruzzo di circa 0,25 millilitri di soluzione nella cella. Dopo aver prodotto lo spruzzo altre due volte.

Posizionare l'ago della siringa di caricamento sulla sporgenza tra lo stelo cellulare e la porta cellulare e rimuovere la soluzione in eccesso. Avviare il programma di visualizzazione VP e bilanciare lo strumento ITC a una temperatura di tre gradi Celsius inferiore alla temperatura sperimentale desiderata. Dopo aver riempito la cella di riferimento con acqua distillata nello stesso modo di prima, collegare una siringa di plastica alla porta di riempimento della siringa per iniezione utilizzando un sottile tubo di silicone, immergere la punta della siringa per iniezione nell'acqua e riempire la siringa fino a quando l'acqua non fuoriesce dalla porta di riempimento superiore indicando che la siringa per iniezione è piena.

Quindi rimuovere la punta della siringa dall'acqua e aspirare aria per svuotare la siringa per iniezione. Utilizzando la stessa procedura, lavare la siringa per iniezione con il tampone e aspirare l'aria attraverso il sistema. Quindi, allacciare la soluzione di substrato in un tubo stretto e pulito.

Posizionarlo sotto la siringa e inserire completamente l'ago della siringa per iniezione. Riempire la siringa per iniezione, lasciando una piccola quantità di soluzione sul fondo del tubo dall'interfaccia del computer. Premere la porta di riempimento chiusa.

Una volta rimosso il tubo di caricamento in silicone, premere spurgo e riempire per rimuovere eventuali bolle d'aria dalla siringa per iniezione ed espellerle nuovamente nella soluzione sfusa. Successivamente, pulire i lati della siringa per iniezione con un tovagliolo di carta per rimuovere eventuali residui di soluzione e posizionarla nella cella del campione. Nell'esperimento M1, impostare almeno due aggiunte da cinque a 30 microlitri di substrato per verificarne la riproducibilità.

Quindi impostare il tempo di spaziatura tra ogni iniezione abbastanza grande da garantire che il segnale di calore ritorni alla linea di base prima dell'aggiunta successiva. Nell'esperimento M due, impostare iniezioni multiple da cinque a 10 microlitri. Impostare l'intervallo tra le iniezioni, consentendo al sistema di stabilizzare la potenza termica alla nuova linea di base dopo ogni iniezione.

A questo punto impostare la potenza di riferimento su 20. Quindi definisci le concentrazioni dell'enzima sperimentale e del substrato e scegli un nome per l'esperimento. Imposta la temperatura a 25 gradi Celsius e inizia l'esperimento.

Una volta terminato l'esperimento, pulire la cella del campione e la siringa secondo le istruzioni del produttore. Dopo aver aperto il software origin 7.0, cliccare sul pulsante apri e selezionare il file corrispondente alla prima iniezione nella traccia di calore dell'esperimento M1. Per determinare il delta H della reazione, integrare il primo picco risultante dalla deviazione basale nel termogramma della singola iniezione.

Esperimento M1. Dividere quindi il valore dell'area ottenuta corrispondente al calore totale di reazione espresso in microcalorie per il substrato finale, la concentrazione nella cella campione espressa in micromolari e il volume della cella campione espresso in litri. Ripetere la stessa procedura per il secondo picco dell'esperimento M1 e calcolare la media dei valori ottenuti per le due misurazioni delta H, quindi determinare DQ su DT dall'esperimento M 2 misurando la differenza tra il valore di riferimento originale e il nuovo valore di riferimento dopo ogni iniezione.

Questo può essere fatto convertendo i dati sperimentali in velocità di reazione secondo la seguente equazione. Utilizzando il valore di entalpia ottenuto nell'esperimento M1. Quindi adattare i dati all'equazione menon di Michalis, in particolare dal programma di analisi.

Fare clic sul pulsante di lettura dei dati e accedere alla cartella in cui è stato individuato l'esperimento M two. Quindi fare clic sulla freccia di scorrimento verso il basso dei file di tipo e scegliere il test enzimatico. Successivamente, fai clic e apri il file.

Fai ITC dell'esperimento M due. Dopo l'apertura della finestra di dialogo del saggio enzimatico, selezionare solo il substrato del metodo due dalla finestra nella finestra delta H per indicare il valore del delta H ottenuto nell'esperimento M1. Quindi, fare clic sul pulsante dell'asse y zero e fare doppio clic appena prima del primo punto di iniezione.

Fare clic sul pulsante Calcola tasso per tracciare il tasso rispetto alla concentrazione del substrato. Infine, utilizzare la funzione di adattamento al modello per adattare la curva e ottenere la costanza cinetica. L'attività litica della cannavale e degli URI CMIS o JAK bean è stata scelta come reazione rappresentativa per dimostrare l'applicabilità dell'ITC nel determinare quantitativamente la catalisi enzimatica.

Nell'esperimento M1 è stato misurato un valore delta H di 10,5 chilocalorie per mole negativo, integrando la potenza termica derivante dall'iniezione del substrato di urea nella soluzione di ureasi e consentendo alla reazione di procedere al completamento. La potenza termica registrata nell'esperimento M 2 è stata convertita nella velocità di reazione utilizzando la seguente equazione. L'adattamento dei dati ottenuti all'equazione della cementina di McKayla ha fornito i parametri cinetici per l'ureasi del fagiolo JAK in cumuli di 20 millimolari.

pH sette come kcat equivale a 30, 200 al secondo e KM equivale a 3,45 millimolari in accordo con i dati precedentemente riportati. La variazione di calore totale misurata nell'esperimento M1 rappresenta la somma di tutti gli eventi che si verificano durante la reazione in analisi, e dipende dall'entalpia molare di tutti i processi coinvolti, e non solo dalla conversione del substrato in prodotto. In un processo generico in cui il sistema reagente acquisisce protoni in una soluzione tamponata, il tampone rilascia protoni producendo calore aggiuntivo all'interno della cella di reazione.

Pertanto, il delta H misurato è evidente e include il delta H intrinseco della reazione, nonché l'entalpia di ionizzazione del tampone e il numero di protoni di scambio secondo l'equazione evidenziata. Utilizzando questa equazione negli esperimenti M1, il numero di protoni di scambio e il delta H intrinseco possono essere determinati eseguendo lo stesso esperimento in tamponi con diversa entalpia di ionizzazione. La reazione complessiva di idrolisi dell'urea si traduce nell'acquisizione di un protone dal tampone.

Di conseguenza, come descritto sopra, il calore della reazione include il contributo della protonazione tampone d. Al fine di calcolare l'età delta intrinseca della reazione di idrolisi, sono stati eseguiti tre esperimenti M1 in diversi tamponi, caratterizzati da tre diverse entalpie di ionizzazione note. L'entalpia intrinseca e il numero di protoni rilasciati dal tampone possono essere calcolati dall'intercetta e dalla pendenza dell'adattamento lineare dei dati sperimentali.

Erano negativi, rispettivamente 14,7 chilocalorie per mole e 0,98, in pieno accordo con i dati precedentemente riportati. Le applicazioni di questa procedura si estendono dalla ricerca di base a quella applicata e allo screening di farmaci, una volta determinata la cinetica della reazione enzimatica. L'esperimento può essere ripetuto in presenza di diversi tipi e concentrazioni di inibitori enzimatici al fine di monitorare l'inibizione, le costanti.