Completa lesioni del midollo spinale e del cervello dissezione Protocollo per Wholemount successiva In Situ Ibridazione in larvale Sea Lamprey
14 ottobre 2014
Lamprede recuperare locomozione dopo una lesione completa del midollo spinale. Tuttavia, alcuni neuroni spinali-proiezione sono buoni recuperatori e altri non lo sono. Questo documento illustra le tecniche per la lampreda di mare abitazioni larve (e adulti recentemente trasformati), producendo completi transezioni midollo spinale e la preparazione di cervelli wholemount e midolli spinali per l'ibridazione in situ.
L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire una dissezione completa del midollo spinale, una transezione e una dissezione cerebrale per lo studio della guida degli assoni dopo la lesione. Ciò si ottiene con il primo transetto, un midollo spinale di lampra a livello della quinta branca. Quindi il cervello viene sezionato e fissato alla silca.
Dopo aver fissato il cervello, può essere immagazzinato in metanolo o immediatamente utilizzato per l'ibridazione in situ che alla fine cambia l'espressione dell'assonale. I recettori guida possono essere osservati in una vertebra rigenerante dopo una lesione del midollo spinale. Il vantaggio della tecnica che dimostreremo oggi rispetto alla più convenzionale sezione in paraffina o sezionamento criostato, è che consente di vedere l'intero cervello, compresi i neuroni che proiettano verso il midollo spinale che sono grandi e identificati.
A dimostrare la procedura è la dottoressa Kathy Zang, ricercatrice nel nostro laboratorio Dai torrenti che alimentano gli affluenti del lago Michigan al fiume Delaware in Pennsylvania, o ai corsi d'acqua nel Maine. Lampione di mare larvale di tipo selvatico della specie. Sono stati ottenuti Pet mize su Marus.
Le larve di età compresa tra quattro e 7 anni sono lunghe da 10 a 14 centimetri e abbastanza grandi per la ferita e la dissezione. Mantienili in gruppi di 52, cento. In serbatoi di acqua dolce da 50 galloni a 16 gradi Celsius.
Il serbatoio richiede un substrato di ghiaia di un pollice in modo che la lampreda possa prendere in prestito Tutta l'acqua aggiunta al serbatoio deve essere condizionata con filtraggio a carbone e aerazione per almeno 48 ore prima di essere aggiunta al serbatoio. A condizione che gli animali vengano utilizzati entro un anno, non è necessario nutrirli per questa procedura. Tieni a portata di mano la soluzione di suoneria appena preparata.
Per prima cosa trasferire una lampada in una soluzione acquosa di benzocaina satura. Una volta anestetizzato, trasferirlo in una pirofila riempita a metà con sil guard. Mettere il piatto sul ghiaccio e guarnire il piatto con ghiaccio.
Suonerie fredde. Fissare l'animale con tre spilli per insetti di 0,15 diametri, uno al muso e due alla quinta branca. Quindi posizionarlo sotto uno stereomicroscopio per l'intervento chirurgico.
Inizia usando un bisturi numero 11 per praticare un'incisione longitudinale lungo la linea mediana dorsale a livello della quinta branchie. Questo rivelerà il midollo spinale mentre si esegue questa incisione. Usa due ganci ricavati da spilli di insetti per fissare le pareti del corpo usando la rivelazione di Castro numero otto, le forbici.
Praticare un taglio perpendicolare attraverso il midollo spinale esposto. Ispezionare le estremità tagliate del midollo spinale per assicurarsi che la transezione sia completa. Quindi, usando una pinza, riallineare le estremità tagliate e chiudere la ferita.
Trasferire la lava lampre su un foglio di carta da filtro imbevuto di soluzione di ringer. Spostare il preparato su un letto di ghiaccio per un'ora in modo che la ferita possa asciugarsi dopo un'ora. Trasferisci la lava nella sua piccola vasca di acqua ghiacciata.
Lascialo guarire lì per 24 ore. Dopo 24 ore, verificare la presenza di movimenti lungo la sezione. Se ci sono movimenti, la trassezione era incompleta.
Se non ci sono, allora il transetto era buono e l'animale può essere spostato in una vasca a temperatura ambiente per il recupero mentre l'animale si riprende. Cambia l'acqua ogni due o tre giorni. Una volta che l'animale sezionato si è sufficientemente ripreso, anestetizzarlo e prepararlo per la dissezione come descritto in precedenza.
Per sezionare il cervello, inizia con un'incisione trasversale tra la narice e l'organo pineale. Poi, con il vitello Castro, le forbici tagliano il tessuto che circonda il cervello mentre fissano l'animale. Con il forcipe.
Le strutture ovali bianche su entrambi i lati del tronco encefalico sono le capsule otiche. Una volta che il cervello è esposto, usa una pinza per rimuovere il plesso coroideo. Quindi, usa i ganci a spillo modificati per allargare la testa dell'animale ed esporre i nervi cranici.
Quindi tagliare il midollo spinale trasversalmente con le forbici fissando il midollo spinale con una pinza. Taglia i nervi cranici per sezionare il cervello. Quindi trasferisci il cervello in un piccolo pezzo di silicone e fissalo lì.
Utilizzando uno spillo per insetti nel midollo spinale e uno spillo attraverso uno dei bulbi olfattivi. Quindi, utilizzando le forbici, tagliare la commessura del bulbo interolfattivo, la commessura del protettore cerebrale e l'esex del tronco encefalico lungo la linea mediana dorsale. Una volta tagliate le commessure e l'esasto, deviare lateralmente le placche A LR e fissarle in piano al silicone con un totale di sette spilli per insetti, due nei bulbi olfattivi, due nei bordi del taglio, nella commessura del protettore cerebrale, due nell'esagono esteso e uno nella linea mediana del midollo spinale.
Ora utilizzando reagenti privi di RNA, fissare il preparato in para formaldeide al 4% a temperatura ambiente per tre ore con una leggera agitazione. I cervelli possono quindi essere analizzati mediante ibridazione in situ utilizzando il metodo descritto L'espressione di neogen in trascrizioni è stata identificata nel midollo spinale, proiettando neuroni di controllo, animali e negli animali. Due settimane dopo la lesione vista qui è un controllo rappresentativo illeso.
Dopo la transezione completa del midollo spinale, ci sono stati cambiamenti nell'espressione del recettore neogen. Dopo due settimane, il recettore neogeno nel non-controllo era preferenzialmente espresso in cattivi rigeneratori come i neuroni M1 I uno I due I quattro, o MTH. Lo sviluppo di questa tecnica ha aperto la strada alla nostra capacità di esplorare l'espressione dei recettori di guida, dei recettori per il solfato di condroitina, del prozio, dei glicani e dell'attivazione delle basi fuse nello stesso cervello.
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Panoramica
Questo studio illustra le tecniche per eseguire sezioni complete del midollo spinale e dissezioni cerebrali nei lampredini marini. Mette in evidenza il recupero della locomozione dopo una lesione del midollo spinale e le capacità rigenerative di specifici neuroni con proiezioni spinali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia Rigenerativa
- Risposta alla Lesione
Sfondo
- Le lamprede marine possono recuperare la locomozione dopo una lesione completa del midollo spinale.
- Alcuni neuroni con proiezioni spinali mostrano buone proprietà rigenerative.
- Comprendere l'orientamento degli assoni dopo la lesione è fondamentale per ottenere informazioni sulla rigenerazione del midollo spinale.
- Questo studio utilizza tecniche di ibridazione in situ per l'analisi.
Scopo dello studio
- Studiare i meccanismi di guida degli assoni dopo una lesione del midollo spinale.
- Illustrare le tecniche di transezione del midollo spinale e di dissezione cerebrale.
- Analizzare i cambiamenti nell'espressione dei recettori per la guida assonale.
Metodi Utilizzati
- Transezione completa del midollo spinale al livello della quinta branchia.
- Dissezione del cervello e fissazione per l'analisi.
- Conservazione dei campioni cerebrali in metanolo o utilizzo immediato per ibridazione in situ.
- Preparazione di interi preparati per visualizzare i grandi neuroni identificati che si proiettano al midollo spinale.
Risultati principali
- Dimostrato il recupero della locomozione nei lampreda dopo lesioni.
- Individuate differenze nelle capacità rigenerative tra neuroni con proiezioni spinali.
- Osservate variazioni nell'espressione dei recettori per la guida assonale nei vertebrati in rigenerazione.
- Evidenziati i vantaggi delle tecniche su preparati interi rispetto ai metodi tradizionali di sezione.
Conclusioni
- Le tecniche presentate forniscono informazioni preziose sulla rigenerazione del midollo spinale.
- Comprendere la rigenerazione dei neuroni può orientare future strategie terapeutiche.
- Le preparazioni in toto permettono un'analisi completa delle connessioni neuronali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente la riduzione del rischio meccanicistico dei bersagli della rigenerazione assonale fornendo un sistema rilevante per la patologia, utile allo studio delle risposte neuronali intrinseche alla lesione del midollo spinale. La preparazione in toto permette la validazione dei bersagli mediante la visualizzazione diretta di grandi neuroni identificabili che proiettano al midollo spinale, facilitando l'analisi comparativa dell'espressione genica tra buoni e cattivi rigeneratori. Questo approccio migliora la fiducia predittiva nella fase iniziale della scoperta, collegando i fenotipi molecolari agli esiti funzionali della rigenerazione in un modello del sistema nervoso centrale di vertebrati.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche confrontando i profili di espressione genica tra popolazioni neuronali funzionalmente distinte.
- Valore operativo: Fornisce un metodo riproducibile per isolare e analizzare specifici sottotipi neuronali implicati nel fallimento o successo della rigenerazione.
- Valore strategico: Supporta la priorizzazione di bersagli identificando firme molecolari associate alla capacità rigenerativa.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per la valutazione quantitativa delle variazioni nell'espressione dei recettori della guida assonale dopo una lesione.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione in toto del sistema nervoso centrale per ottenere risultati riproducibili di ibridazione in situ in diverse condizioni sperimentali.
- Valore strategico: Permette lo screening su larga scala di recettori della guida, recettori del solfato di condroitina e altri bersagli correlati all'interno di una singola piattaforma.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Stabilisce la rilevanza per le malattie modellando la dinamica di lesione e rigenerazione del sistema nervoso centrale nei vertebrati, utilizzando il lampetra marino.
- Valore operativo: Garantisce una continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica mediante una preparazione uniforme in toto.
- Valore strategico: Supporta decisioni di avanzamento con rischio calibrato, consentendo l'eliminazione dei rischi meccanicistici nelle vie di guida degli assoni.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione, fornendo letture molecolari che informano le strategie di modulazione delle vie metaboliche.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante il confronto diretto dell'espressione genica in neuroni rigeneranti e non rigeneranti identificati.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio grazie a una preparazione standardizzata di interi preparati compatibile con ibridazione in situ multiplex per recettori della guida assonale.
- Analisi: Produce letture spaziali quantitative delle variazioni nell'espressione dei recettori che consentono ai gruppi di lavoro di correlare i cambiamenti molecolari con gli esiti fenotipici della rigenerazione.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso un modello di lesione del sistema nervoso centrale di vertebrati che mostra recupero funzionale e rigenerazione assonale prossimale.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo studio di diverse famiglie di recettori di guida (ad esempio, Neogen, solfato di condroitina, proteoglicani) nello stesso contesto neuronale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi di rigenerazione degli assoni grazie alla risoluzione diretta dei neuroni.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità della dissezione e fissazione neuronale per analisi molecolari successive.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento o interruzione fornendo precoci evidenze di biomarcatori dell'interazione con il bersaglio in neuroni capaci di rigenerazione.
- Impatto sul portafoglio: Guida la priorizzazione corretta rispetto al rischio dei bersagli di guida degli assoni in base alla dinamica di espressione in popolazioni neuronali validate.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in tecniche microchirurgiche per la transezione del midollo spinale e la dissezione cerebrale in avannotti di lampreda marina.
- È subordinato all'accesso a microscopia stereoscopica, spilli per insetti, substrati in silicone e reagenti privi di RNasi per la preparazione e la fissazione in toto.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda i protocolli di anestesia, recupero e fissazione, al fine di garantire una qualità del tessuto costante.
- Richiede adattamenti quando si trasferiscono i protocolli tra stadi di sviluppo diversi o tra specie diverse, a causa delle variazioni nell'anatomia e nelle dimensioni del sistema nervoso centrale.
- È limitato dalla finestra temporale di 24 ore post-lesione necessaria per confermare la completa transezione prima di procedere con il recupero e la dissezione.
