Imaging non invasiva e analisi di ischemia cerebrale in ratti Living Utilizzando Positron Emission Tomography con

L'obiettivo generale di questo progetto collaborativo è quello di ottenere immagini delle modifiche nella distribuzione cerebrale di una sonda radioattiva a base di glucosio nei ratti prima e dopo un ictus. Questo obiettivo viene raggiunto inducendo un'ischemia cerebrale nei ratti mediante un intervento di occlusione dell'arteria cerebrale media. Il passo successivo consiste nell'iniettare il tracciante radioattivo Fluorodeossiglucosio e acquisire immagini mediante tomografia a emissione di positroni.

L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare i dati utilizzando un modello di volume cerebrale di interesse anatomicamente coregistrato con il cervello del ratto. In definitiva, l'imaging PET su ratti sottoposti a ischemia cerebrale può essere impiegato per misurare le differenze regionali nell'assorbimento cerebrale di radiofarmaci come il Fluorodeossiglucosio durante studi longitudinali sull'evoluzione della malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la necroscopia e l'istologia è che l'imaging PET è non invasivo e può essere utilizzato in modo longitudinale per studiare trattamenti e l'evoluzione lineare dell'ictus.

Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questo metodo avrà difficoltà a stabilire il modello animale di ictus. L'utilizzo di repere anatomici come le arterie carotide interna ed esterna semplificherà notevolmente la procedura. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per eseguire l'analisi della VOI, resa possibile attraverso la sovrapposizione dell'atlante cerebrale PMOD con i dati PET cerebrali del campione in esame.

Il chirurgo dovrebbe indossare guanti sterili puliti dopo la preparazione della zona e utilizzare strumenti sterili. Per questo studio, utilizzare ratti maschi Sprague-Dawley del peso compreso tra 220 e 270 grammi e iniziare eseguendo una scansione PET e TC preoperatoria. Per ottenere un valore basale dell'assorbimento di F 18 FDG, anestetizzare i ratti con isoflurano al 2,5% mediante un cono nasale.

Quindi posizionare l'animale in posizione recumbente dorsale su un tappetino riscaldante, assicurandosi che sia completamente anestetizzato mediante una leggera pressione sul padiglione plantare. Successivamente, fissare le zampe anteriori. Poi, rasare la superficie dorsale del collo dell'animale e preparare l'area rasata con etanolo al 70%, seguito da soluzione di povidone-iodio al 10%.

Ora, utilizzando le forbici, effettuare un'incisione lunga da due a 2,5 centimetri, posta a 0,5 centimetri a destra e parallela alla trachea. Successivamente, mediante dissezione ottusa, individuare l'arteria carotide e utilizzare dei retrattori per facilitarne la visualizzazione. Una volta identificata, posizionare una pinza microchirurgica sull'arteria carotide comune. In seguito, individuare il primo punto di biforcazione, che corrisponderà all'arteria carotide esterna (ECA) e all'arteria carotide interna (ICA); cauterizzare i rami più piccoli collegati alla carotide esterna, come l'arteria occipitale.

Quindi legare l'arteria carotide esterna vicino al ramo dell'arteria tiroidea con una sutura in seta 4-0, lasciando un'estremità sufficientemente lunga da permettere alle pinze emostatiche di trattenere saldamente la sutura. Per fissare le suture con le pinze emostatiche, tirare il tronco dell'arteria carotide esterna in modo che risulti parallelo alla carotide comune. A questo punto cauterizzare l'arteria carotide esterna al di sopra della sutura.

Successivamente, localizzare l'ICA e utilizzare una seconda microclips per occludere questa arteria. Quindi praticare un piccolo foro nell'ECA utilizzando forbici a molla di piccole dimensioni. Inserire l'occlusore e legare un punto di sutura intorno ad esso per impedire il flusso sanguigno.

Ora, rimuovere la pinza microvascolare dalla carotide interna e avanzare l'occlusore finché non si avverte una resistenza. Assicurarsi che l'occlusore proceda nella carotide interna e non nell'arteria tegopalatina. Successivamente, rimuovere la pinza microvascolare dalla carotide comune e tagliare qualsiasi eccesso di occlusore o di sutura.

Quindi utilizzare clip da nove millimetri per chiudere l'incisione cutanea. Rimuovere l'animale dall'anestesia e permettere all'animale di risvegliarsi. Successivamente eseguire una scansione PET-TAC 1,5 ore dopo la procedura di ictus, trascorse due ore.

Anestetizzare nuovamente completamente il ratto con isoflurano e rimuovere le clip della ferita. Quindi individuare l'estremità dell'occluditore e rimuoverlo dall'arteria cerebrale media tirando delicatamente fino a quando la punta bianca dell'occluditore entra in contatto con i punti di sutura. Tuttavia, non tirarlo completamente fuori, poiché ciò causerebbe sanguinamento.

Infine, sostituire le clip della ferita. Successivamente, rimuovere l'animale dall'anestesia e permettere all'animale di riprendere conoscenza. Quindi, eseguire nuovamente la scansione dell'animale, 24 ore dopo la riprfusione.

Per quantificare il danno del tessuto cerebrale dovuto all'ictus. Come precedentemente menzionato, l'animale deve essere sottoposto a scansione prima di indurre l'ictus, poi 1,5 ore dopo l'ictus e infine 26 ore dopo l'ictus.

Per quantificare il danno del tessuto cerebrale dovuto a lesione ischemica prima dell'imaging, anestetizzare il ratto sotto una miscela di gas di isoflurano al 2,5% in una camera per anestesia. Successivamente, iniettare circa 500 microcurie di fluordesossiglucosio nella vena della coda. Consentire al ratto di riprendersi dopo un'ora.

Quindi si procede nuovamente all'anestesia per l'acquisizione delle immagini. Posizionare il ratto anestetizzato su un lettino standard per ratto dotato di cono nasale per l'anestesia con fluoruro di ISO. Misurare in millimetri la distanza tra il muso del ratto e il bordo del lettino e registrare questo valore come scostamento orizzontale.

Successivamente, posizionare l'animale all'interno dello scanner e configurare lo studio, inclusi l'iniezione del peso dell'animale con offset orizzontale, la dose del composto, il tempo e la data. Quindi fare clic sul pulsante "inizia studio" per avviare la scansione e ricostruire i dati una volta acquisita la scansione. Eseguire l'analisi delle immagini descritta in questo documento utilizzando il software di analisi PMOD in combinazione con l'atlante cerebrale di W Schiffer.

Iniziare selezionando la scheda di co-registrazione manuale nella parte superiore dello schermo. Quindi scegliere la scheda di taglio. Successivamente, utilizzare il rettangolo bianco vuoto per ruotare le scansioni micro PET e il rettangolo bianco pieno.

Per spostare le scansioni micro PET, allineare le due scansioni individuando punti di riferimento come le ghiandole palatine e le caratteristiche cerebrali superiori e posteriori, che possono essere utilizzati per far corrispondere la scansione micro PET con il modello cerebrale. Successivamente, regolare la scansione micro PET finché non è allineata con l'atlante cerebrale. Se necessario, ruotare la scansione micro PET di 180 gradi nella vista coronale e sollevarla significativamente nella vista sagittale, insieme ad altri piccoli aggiustamenti di orientamento.

Successivamente, accedi alla scheda fusione a schermo intero. Seleziona la sorgente A nell'angolo in alto a destra dello schermo. Quindi passa all'atlante modello.

In fondo alla pagina, selezionare rat dal menu a discesa. Facoltativamente, tornare alla scheda di co-registrazione manuale, dove l'atlante dovrebbe apparire sovrapposto a un atlante cerebrale. L'atlante può essere utilizzato per aiutare allineare la scansione micro PET e l'atlante cerebrale dopo l'allineamento.

Ritorna alla scheda di fusione a schermo intero. Sul cervello apparirà un modello che indica quali sezioni del cervello verranno misurate per le statistiche delle VOI. Seleziona ora la sorgente B nell'angolo superiore destro dello schermo.

Quindi selezionare il pulsante delle statistiche VOI. Salvare il foglio elettronico che appare selezionando salva e poi salva nel sistema di file. Digitare il nome del file desiderato nel campo nome file.

Successivamente, è possibile eseguire l'analisi delle immagini utilizzando questi dati per visualizzare i risultati e creare sequenze di immagini mediante il software di imaging vol view. Per ulteriori dettagli sui passaggi di analisi e visualizzazione, consultare il manoscritto allegato a questo video. Di seguito sono mostrati dati rappresentativi di imaging per scansioni PET e TC a raggi X in un ratto nei tempi pre e post ripristino del flusso ematico a 24 ore: a 24 ore si osserva un marcato calo dell'assorbimento del glucosio nell'emisfero ipsilaterale, indicativo di un danno tissutale diffuso causato dall'ictus ischemico indotto.

Le frecce bianche indicano la posizione di una ridotta captazione di FDG dovuta al danno da ictus. Qui osserviamo i dati di PET con FDG di un ratto a 24 ore dalla perfusione, fusi con l'atlante template del VOI cerebrale. Per l'analisi, i colori a tratteggio incrociato indicano i singoli VOI dell'atlante template cerebrale.

Infine, qui osserviamo i rapporti tra il segnale PET con FDG dell'emisfero destro e sinistro e le unità standard di uptake provenienti da ciascuna regione dell'Atlante cerebrale del ratto di W. Schiffer, riportati per scansioni effettuate prima dell'evento ischemico, a 1,5 ore e a 24 ore dalla riperfusione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una solida comprensione di come stabilire un modello di ischemia cerebrale nel ratto, nonché di come eseguire l'immagine PET con FDG sugli animali e utilizzare un atlante cerebrale di riferimento per effettuare un'analisi rigorosa dei dati mediante volumi d'interesse (VOI).