4.12: Allevamento di zebrafish e gestione degli embrioni

I pesci zebra sono un sistema modello piccolo ma potente. Questi pesci prolifici possono generare centinaia di prole a settimana e molte migliaia nel corso della loro vita. Il rapido sviluppo esterno e i corpi trasparenti rendono gli embrioni ideali per diverse applicazioni. Questo video tratterà le basi della raccolta e della manipolazione degli embrioni prima di descrivere gli attuali metodi di ricerca che sfruttano gli embrioni di zebrafish.

Per generare embrioni, è utile conoscere un po' il comportamento di accoppiamento del pesce zebra.

Il pesce zebra subisce la riproduzione sessuale, quindi l'allevamento richiede sia pesci maschi che femmine. I maschi hanno corpi più snelli con una tonalità leggermente rossa, mentre le femmine hanno ventri più grandi, argentati e pieni di uova.

L'accoppiamento periodico mantiene le uova sane, ma fare tutte quelle uova richiede molto lavoro, quindi le singole femmine dovrebbero essere accoppiate solo una volta alla settimana.

Infine, come molti altri animali, i processi sensoriali guidano il comportamento di accoppiamento nei pesci.

Gli spunti olfattivi del maschio aiutano a preparare la sua amica a deporre le uova, mentre un po' di illuminazione d'atmosfera li mette entrambi in azione.

Dopo aver imparato a identificare i pesci maschi e femmine, è il momento di impostare un incrocio.

Per l'allevamento del pesce zebra, i ricercatori utilizzano vasche appositamente progettate per l'accoppiamento. Le vasche di riproduzione sono in genere dotate di un inserto rimovibile con fori che consentono alle uova di cadere. Questa caratteristica protegge le uova dall'essere mangiate dai pesci adulti affamati.

Per iniziare, combina i pesci adulti nelle vasche di riproduzione durante il pomeriggio o la sera. Per raccogliere gli embrioni in fase iniziale la mattina seguente, separa i pesci maschi e femmine con un divisorio, che impedisce loro di riprodursi prima di essere pronto per iniziare un esperimento. Per evitare che i pesci saltino fuori, assicurati di coprire la vasca di riproduzione con un coperchio. Quindi, lascia che i pesci si acclimatino l'uno all'altro durante la notte.

Dopo aver trascorso la notte insieme in una vasca di riproduzione, i pesci si accoppieranno la mattina seguente.

Il primo passo al mattino è rimuovere il divisore tra il pesce maschio e quello femmina per avviare la deposizione delle uova. Se non viene utilizzato un divisore, il pesce deporrà le uova poco dopo l'insorgenza della luce.

Mentre i maschi inseguono le femmine intorno alla vasca, stimolano la deposizione delle uova mentre rilasciano lo sperma nell'acqua per la fecondazione. Attendere circa 15-30 minuti dopo aver tirato un divisorio per dare al pesce il tempo di accoppiarsi. Quindi, rimuovere gli adulti dalla vasca utilizzando una rete o sollevando l'inserto della vasca e posizionando il pesce in un'altra vasca.

Quindi, versare l'acqua e gli embrioni attraverso un colino da tè a rete per la raccolta. Quindi, usando ?acqua d'uovo,? Lavate gli embrioni dal colino in una capsula di Petri. Potrebbe essere necessario trasferire gli embrioni tra le piastre per ottenere una densità ottimale di 50 - 100 per piatto. Per garantire che lo sviluppo proceda a un ritmo normale, metti le piastre in un'incubatrice a 28,5 ?C.

Una volta che hai i tuoi embrioni, maneggiali con cura. Sono importanti per i tuoi esperimenti! Esaminiamo alcuni suggerimenti.

Per mantenere gli embrioni sani, assicurati di mantenere l'acqua nelle piastre di Petri pulita e priva di detriti. Gli embrioni morti saranno opachi e dovrebbero essere rimossi quotidianamente. Inoltre, il blu di metilene può essere aggiunto all'acqua per prevenire la crescita di funghi.

Ogni volta che è necessario spostare gli embrioni da una piastra all'altra, utilizzare una pipetta di trasferimento. Facendo roteare la piastra, è possibile concentrare gli embrioni al centro della piastra, facilitando il pipettaggio.

Alcuni protocolli richiedono alcuni passaggi aggiuntivi per il mantenimento dell'embrione. Per i primi tre giorni di vita, gli embrioni di pesce zebra si sviluppano all'interno di un corion, che può impedire la manipolazione dell'embrione. Il corion può essere rimosso mediante trattamento con l'enzima proteolitico, la pronasi, o utilizzando una pinza per rimuoverlo manualmente. Inoltre, il pesce zebra inizia a sviluppare pigmento entro 24 ore, come mostrato qui in questa larva di pesce zebra, che può interferire con la microscopia. Per risolvere questo problema, gli scienziati integrano l'acqua dell'embrione con PTU, che inibisce la produzione del pigmento melanina.

Ora che sai come ottenere e prenderti cura degli embrioni di zebrafish, esploriamo alcuni dei modi in cui i ricercatori li usano per le scoperte scientifiche.

Lo sviluppo esterno degli embrioni di zebrafish consente la manipolazione genetica mediante microiniezione di DNA, RNA o reagenti di knockdown genico. Questo metodo porta a una distribuzione uniforme del materiale iniettato in tutto l'embrione e può produrre fenotipi visibili derivanti dalla sovraespressione o dalla perdita di una proteina. La stessa tecnica può essere utilizzata anche per realizzare pesci transgenici in cui strutture specifiche sono caratterizzate dall'espressione di proteine fluorescenti.

Inoltre, le piccole dimensioni degli embrioni e delle larve di zebrafish li rendono ideali per lo screening chimico fenotipico. Qui, gli embrioni vengono caricati in piastre da 96 pozzetti e poi trattati con librerie di piccole molecole aggiungendo le sostanze chimiche nell'acqua. Successivamente, queste placche di pesci vengono sottoposte a screening per difetti morfologici, come lo sviluppo anomalo mostrato qui.

Infine, la trasparenza degli embrioni di zebrafish li rende adatti alla microscopia. Gli embrioni vivi che esprimono proteine fluorescenti in specifici tipi di cellule possono essere montati e visualizzati con la microscopia confocale, consentendo ai ricercatori di esaminare i movimenti cellulari nei tessuti in via di sviluppo nel tempo.

Hai appena visto il video di JoVE sull'allevamento del pesce zebra e sulla gestione degli embrioni. In questo video, abbiamo discusso le basi dell'accoppiamento, la creazione di vasche di riproduzione e la gestione degli embrioni. Abbiamo anche discusso alcuni metodi di ricerca che sfruttano questo piccolo e potente embrione. Grazie per l'attenzione!