Name: Analizzando il movimento del Nauplius Artemia salina Di monitoraggio ottico di nanoparticelle plasmoniche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Scopri come analizzare le frequenze di movimento di Artemia salina utilizzando nanoparticelle plasmoniche intrappolate otticamente. Questa tecnica di pinzette ottiche consente misurazioni precise della diffusione e del comportamento dei microrganismi acquatici.

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Il sostegno finanziario da parte del CER attraverso l&#39;Advanced Investigator Grant HYMEM, dalla DFG attraverso il Nanosystems Iniziativa Monaco di Baviera (NIM) e attraverso il Sonderforschungsbereich (SFB1032), progetto A8 Si ringrazia. Siamo grati al Dr. Alexander Ohlinger, Dr. Sol Carretero-Palacios e wellness Nedev per il supporto e discussioni fruttuose.

1. Setup sperimentale <ol><li> Utilizzare un microscopio in alto a destra e un campo condensatore olio scuro con una apertura numerica (NA) = 1.2 per l&#39;illuminazione a campo scuro. Utilizzare un obiettivo di immersione in acqua con ingrandimento 100X e NA = 1.0 per le osservazioni di particelle e trapping. Utilizzare un obiettivo aria con ingrandimento 10X e una NA = 0,2 per seguire il moto del Nauplius. </li><li> Utilizzare una configurazione pinzette ottiche con un nm laser ad onda continua 1.064 accoppiato nel microscopio in alto a destra. Impostare la potenza del laser della trappola ottica a 100 mW (misurata con un misuratore di potenza dopo l&#39;obiettivo). </li><li> Utilizzare una telecamera ad alta velocità CMOS o una reflex digitale a obiettivo singolo (DSLR) per rilevare e l&#39;immagine del movimento delle particelle d&#39;oro nella trappola ottica e il movimento del Nauplius. </li><li> Utilizzare un filtro notch per evitare il laser di entrare nella camera. </li><li> Utilizzare un misuratore di potenza per misurare la potenza del laser dopo l&#39;obiettivo. </li></ol> 2. Preparazione del campione </p&gt; <ol><li> Pipettare una goccia d&#39;acqua (180 mL) su un vetrino da microscopio e posizionare il campione sul microscopio a campo scuro. </li><li> Pipettare un Nauplius da un piccolo serbatoio di acqua alla goccia d&#39;acqua. </li><li> Utilizzare un obiettivo 10X aria per osservare il movimento del Nauplius nella soluzione e registrare un flusso video. </li><li> Utilizzare una nanoparticella di oro con un diametro di 60 nm come un rivelatore di osservare il moto del fluido generato dal Nauplius. Pertanto, aggiungere 5 ml di una soluzione di particella molto diluita nella goccia d&#39;acqua, in modo che circa una particella può essere visto nel campo visivo con un obiettivo 100X immersione in acqua. </li></ol> 3. Particle inseguimento Experiment <ol><li> Trappola una nanoparticella d&#39;oro con la pinzetta ottica. Pertanto, portare il 1.064 nm laser cattura vicino a una nanoparticella d&#39;oro che si sta diffondendo in soluzione spostando il palco microscopio. Le forze ottici attraenti tirare nanoparticelle d&#39;oro verso il punto focale del secoloraggio laser e. La particella intrappolata non si sta diffondendo più e invece mantiene la sua posizione. Prendete un flusso video della nanoparticella intrappolato con la fotocamera DSLR ad un frame rate di 50 Hz per 30 sec. </li><li> Spegnere il laser della pinzetta ottica e rilasciare il nanoparticelle d&#39;oro dalla trappola. </li><li> Utilizzare un programma di monitoraggio di particelle di leggere prima la posizione della particella oro otticamente intrappolati in ogni fotogramma del flusso video. Una trasformazione di Fourier veloce (FFT) di xy-posizione della particella nel tempo rivela uno spettro di frequenza. NOTA: Qui, un &#39;IGOR PRO&#39; codice informatico angolo scritta è stato utilizzato per analizzare la posizione centrale particella nel piano xy nel tempo e per l&#39;analisi FFT. </li><li> Come alternativa ad un codice IGOR auto-scritta usare il programma liberamente disponibile &#39;Video Spot Tracker&#39; per l&#39;inseguimento della particella nel video. Utilizzare il software commerciale &#39;Origin&#39; per eseguire la trasformazione di Fourier dei dati di monitoraggio: <ol&gt; <li> Trascinare il file video per il programma aperto &#39;Video Spot Tracker&#39;. </li><li> Clic del mouse sulla particella visto nella prima immagine del flusso video e una regione circolare appare di interesse. </li><li> Scegliere &quot;simmetrico&quot; e &quot;ottimizzare&quot; nella finestra del prompt dei comandi superiore per ottimizzare il monitoraggio della particella. </li><li> Clic del mouse &quot;logging&quot; nella finestra del prompt dei comandi in alto e scegli una cartella per salvare i dati. I dati di monitoraggio saranno salvati come un foglio di calcolo di dati. </li><li> Clic del mouse &quot;il video gioco&quot; sul prompt dei comandi finestra di sinistra del programma di monitoraggio e attendere che vengono analizzati tutti i fotogrammi del video. </li><li> Chiudere il programma e aprire il foglio dati salvati con &#39;Origin&#39;. Impostare i valori di colonna come &quot;y 1&quot; e &quot;y 2&quot;. </li><li> Impostare intervalli di tempo per ogni fotogramma video come &quot;x&quot; nel foglio dati &#39;Origin&#39;. </li><li> Mark x-Posizione della colonna ed eseguire una FFT scegliendo &quot;Analisi dei dati&quot; e &quot;FFT&quot; nella finestra del prompt dei comandi in alto. Ripetere il passaggio per la colonna posizione y. </li><li> Tracciare le ampiezze del segnale FFT calcolata in x-e y-direzione rispetto alla frequenza. </li></ol></li></ol> 4. Simulazione Numerica <ol><li> Calcolare i α polarizzabilità della particella oro 60 nm utilizzando il programma informatico &#39;Mathematica&#39;. <ol><li> Utilizzare l&#39;equazione (1) per calcolare la polarizzabilità secondo Kuwata et al 16.: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51502/51502eq1.jpg" width="300" /> (1) </li><li> Definire i seguenti tre parametri nel codice programma: il complesso funzione dielettrica dipendente dalla lunghezza d&#39;onda della particella d&#39;oro, il raggio nanoparticelle, e l&#39;indice di rifrazione del mezzo circostante. </li></ol></li><li> Utilizzare la descrizione delle eletdistribuzione di campo trica di un fascio gaussiano focalizzato secondo Agayan et al 17 per calcolare le forze ottici agiscono su una particella d&#39;oro 60 nm.: <img alt="Equazione 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51502/51502eq2.jpg" width="500" /> (2) <ol><li> . Utilizzare le equazioni (3) - (6) da Agayan et al 17 per calcolare sia, il gradiente e spargendo forze che agiscono sulla particella: <img alt="Equazione 3" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51502/51502eq3.jpg" width="350" /> (3) <img alt="Equazione 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51502/51502eq4.jpg" width="300" /> (4) <img alt="Equazione 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51502/51502eq5.jpg" width="500" /> (5) <img alt="Equazione 6" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51502/51502eq6.jpg" width="300" /> (6) </li><li> Nel codice di programma, definire i parametri per la potenza del laser, l&#39;apertura numerica della oggettivo, e il complesso polarizzabilità della nanoparticella. </li><li> Riassumere la forza di gradiente e la forza di scattering per calcolare la forza ottica totale agente sulla particella oro in una trappola ottica. </li></ol></li><li> Simula premendo contemporaneamente &quot;Control&quot; e &quot;Enter&quot;. </li></ol>

<ol><li>Hellawell, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHellawell%2C+JM+%22Biological+indicators+of+freshwater+pollution+and+environmental+management%22">Biological indicators of freshwater pollution and environmental management</a>. , Elsevier Applied Science Publishers. (1986).</li>
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<li>Agayan, R. R., Gittes, F., Kopelman, R., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+near+resonance+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Optical trapping near resonance absorption.</a> Applied Optics. 41 (12), 2318-2327 (2002).</li>
<li>Klar, T., Perner, M., Grosse, S., von Plessen, G., Spirkl, W., Feldmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-Plasmon+Resonances+in+Single+Metallic+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Surface-Plasmon Resonances in Single Metallic Nanoparticles.</a> Physical Review Letters. 80, 4249-4252 (1998).</li>
<li>Ohlinger, A., Nedev, S., Lutich, A. A., Feldmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optothermal+Escape+of+Plasmonically+Coupled+Silver+Nanoparticles+from+a+Three-Dimensional+Optical+Trap%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Optothermal Escape of Plasmonically Coupled Silver Nanoparticles from a Three-Dimensional Optical Trap.</a> Nano Letters. 11 (4), 1770-1774 (2011).</li>
<li>Urban, A. S., Lutich, A. A., Stefani, F. D., Feldmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Printing+Single+Gold+Nanoparticles.+Nano+Letters%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Laser Printing Single Gold Nanoparticles. Nano Letters.</a> Nano Letters. 10 (12), 4794-4798 (2010).</li>
<li>Urban, A. S., Fedoru, K. M., Nedev, S., Lutich, A., Lohmueller, T., Feldmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrink-to-fit+Plasmonic+Nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Optical+Materials%22%5BJournal%5D)">Shrink-to-fit Plasmonic Nanostructures.</a> Advanced Optical Materials. 1 (2), 123-127 (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Microscopia a campo scuro è uno strumento potente per la visualizzazione nanoparticelle di oro con dimensioni inferiori al limite di diffrazione ottica, poiché la sezione trasversale dispersione delle nanoparticelle metalliche supera la loro sezione trasversale geometrica (cfr. Figura 2A) 18. In una configurazione pinzetta, questo approccio permette anche di distinguere se solo un singolo o multiplo nanoparticelle di oro sono intrappolati dal fascio laser perché plasmonica accoppiamento tra l...

Valutazione della qualità delle acque sulla base di indicatori chimici e biologici è di fondamentale importanza per ottenere informazioni sulle condizioni di stato e ambientali di un ecosistema acquatico 1-3. Metodi classici per l&#39;analisi chimica dell&#39;acqua sono basati sulle proprietà organolettiche e la determinazione dei parametri fisico-chimici. Indicatori biologici, d&#39;altra parte, sono specie animali la cui presenza e vitalità fornire indicazioni sulle condizioni ambientali e l&#39;effetto di inquinanti per un ecosistema che si verificano trovi Esempi tipici di bioindicatori sono Copepods, un gruppo di piccoli crostacei acqua, che può essere trovato in quasi ogni habitat di acqua 4,5. Osservando l&#39;attività e la vitalità di queste specie da un campione di acqua può quindi essere utilizzato per ottenere informazioni sulle condizioni complessive di un ecosistema 5. Le larve di copepodi, che sono chiamati naupli, utilizzare colpi ritmici della loro antenne (ogni larva ha tre paia di appendages al loro regione della testa) per nuotare in acqua 6. La frequenza e l&#39;intensità di questi colpi è quindi un indicatore diretto di età, fitness, e le condizioni ambientali dell&#39;animale 7-10. Eventuali indagini su tali campioni sono di solito fatto con un microscopio osservando e contando i colpi antenna del naupli direttamente. A causa delle loro dimensioni (~ 100-500 micron) 11, questo spesso richiede di fare misurazioni sia uno per uno o per fissare un unico Nauplius ad un substrato. Qui, dimostriamo un nuovo approccio per osservare l&#39;attività di Copepodo larve in campioni di acqua utilizzando un nanoparticelle d&#39;oro otticamente intrappolati come un rilevatore ultrasensibile. Pinzette ottiche sono tipicamente utilizzati da molti gruppi come strumento sperimentale multa di applicare o misurare le forze tra le molecole fino alla gamma piconewton 12-14. Più recentemente, la gamma di applicazioni per pinzette ottiche è stata ampliata per osservare vibrazioni acustiche e risolverefluttuazioni nt in mezzi liquidi monitorando il movimento di nano e microparticelle che sono confinati in una trappola ottica 15. Particelle che vengono immersi in un liquido sono sottoposti a moto browniano. All&#39;interno di una trappola ottica, tuttavia, questo movimento è parzialmente attenuato da un laser indotto, forza forte pendenza. Pertanto, la rigidità della trappola ottica e la localizzazione della particella nel fuoco del fascio laser possono essere regolati tramite la potenza del laser. Allo stesso tempo, è possibile rivelare caratteristiche circa il potenziale di cattura e di analizzare le interazioni di molecole con la particella monitorando il moto delle particelle dipendente dal tempo nella trappola. Questo approccio rende possibile la presa la frequenza, l&#39;intensità e la direzione del movimento fluidico generato da un oggetto in movimento nel suo ambiente liquido. Si dimostra come questa idea generale può essere applicato per ottenere uno spettro di frequenza del moto di un individuo Nauplius senza il requisitointerferire direttamente con il campione. Questo approccio sperimentale introduce un nuovo concetto generale per l&#39;osservazione del comportamento mobili di esemplari acquatici in un modo molto sensibile. Per le osservazioni sulle specie bioindicatori, questo potrebbe espandere l&#39;attuale metodologia per l&#39;analisi delle acque e potrebbe essere applicata per ottenere informazioni sulla salute e l&#39;integrità degli ecosistemi acquatici.

<table><tbody><tr><td>Microscopio Zeiss Axio Scope.A1</td><td>Carl Zeiss</td><td>490035-0012-000</td><td>illuminazione in campo scuro</td></tr><tr><td>Obiettivo ad acqua Achroplan</td><td>Carl Zeiss</td><td>440087</td><td>ingrandimento 100X, NA = 1.0</td></tr><tr><td>Obiettivo ad aria Epiplan</td><td>Carl Zeiss</td><td>442934</td><td>ingrandimento 10X, NA = 0.2</td></tr><tr><td>Condensatore ad olio in campo scuro</td><td>Carl Zeiss</td><td>445323</td><td>NA = 1.2</td></tr><tr><td>Cobolt Rumba CW 1.064 nm DPSSL</td><td>Cobolt</td><td>1064-05-01-2000-500</td><td>1.064 nm, CW, &lambda; = 1.064 nm, 2 Watt, TEM00</td></tr><tr><td>Espansore di fascio</td><td>Edmund Optics</td><td></td><td>Codice 1064 2-8X 64414</td></tr><tr><td>Telecamera ad alta velocità Dimax HD</td><td>PCO. Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera a colori Canon EOS 500 D&nbsp;</td><td>Canon</td><td></td><td>FAQ-ID: 8201395700</td></tr><tr><td>Filtro notch StopLine 532/1064</td><td>Semrock</td><td>A11149-711265</td><td>Codice art. NF01-532U</td></tr><tr><td>Acqua&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nauplius Artemia salina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colloide d'oro</td><td>BBInternational</td><td>Batch 13741&nbsp;</td><td>Diametro 60 nm</td></tr><tr><td>MQMie Versione 3.2&nbsp;</td><td>Dr. Michael Quinten</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mathematica 8.0</td><td>Wolfram</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Comsol Multifisica 4.0&nbsp;</td><td>COMSOL, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analizzando il movimento del nauplius &#39;<em&gt; artemia salina</em&gt; &#39;di monitoraggio ottico di nanoparticelle plasmoniche

Analyzing the Movement of the Nauplius 'Artemia salina' by Optical Tracking of Plasmonic Nanoparticles

Mostriamo come pinzette ottiche possono fornire uno strumento sensibile per analizzare le vibrazioni fluidici generate dal movimento dei piccoli organismi acquatici. Una singola nanoparticella di oro tenuto da una pinzetta ottica viene utilizzato come sensore per quantificare il movimento ritmico di una larva Nauplius (Artemia salina) in un campione di acqua. Ciò si ottiene sorvegliando lo spostamento dipendente dal tempo della nanoparticella intrappolato in conseguenza dell&#39;attività Nauplius. Una analisi di Fourier della posizione della nanoparticella poi produce uno spettro di frequenza che è caratteristica per il movimento delle specie osservate. Questo esperimento dimostra la capacità di questo metodo per misurare e caratterizzare l&#39;attività di piccole larve acquatiche senza l&#39;obbligo di osservare direttamente e di ottenere informazioni sulla posizione delle larve rispetto alla particella intrappolata. Nel complesso, questo approccio potrebbe dare una panoramica sulla vitalità di alcune specie si trovano in una e acquaticaCoSystem e potrebbe ampliare la gamma di metodi convenzionali per l&#39;analisi di campioni d&#39;acqua.

Una illustrazione schematica della configurazione sperimentale è mostrato nella Figura 1A. Una configurazione di campo scuro è necessario rilevare otticamente lo spostamento di una particella d&#39;oro 60 nm in una trappola ottica 15. La lunghezza d&#39;onda di 1.064 nm per il laser trapping viene scelta per garantire un confinamento stabile del rivelatore di particelle d&#39;oro 12,14. Un divisore di fascio nel microscopio viene utilizzata per focalizzare il fascio cattura attrave...

Usiamo tracciamento ottico di nanoparticelle plasmoniche per sondare e caratterizzare i movimenti frequenza degli organismi acquatici.

Analizzando il movimento del Nauplius &#39;<em&gt; Artemia salina</em&gt; &#39;Di monitoraggio ottico di nanoparticelle plasmoniche

We demonstrate how optical tweezers may provide a sensitive tool to analyze the fluidic vibrations generated by the movement of small aquatic organisms. A ...

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare le frequenze del movimento di un microorganismo acquatico utilizzando una nanoparticella plasmonica intrappolata otticamente. Questo viene realizzato innanzitutto osservando le larve di OPIS in acqua al microscopio, dotato di pinzetta ottica e telecamera. Il secondo passaggio consiste nell'aggiungere nanoparticelle d'oro di diametro pari a 16 nanometri nell'ambiente delle larve OPIS.Successivamente, la pinza ottica viene utilizzata per intrappolare una singola nanoparticella d'oro vicino alle NOIs. L'ultimo passaggio consiste nell'osservare la diffusione della nanoparticella intrappolata mentre è influenzata dal movimento delle Nous. I dati video vengono acquisiti e analizzati mediante un software di tracciamento delle particelle.Infine, la posizione dipendente dal tempo della nanoparticella viene trasformata nello spazio di Fourier per estrarre le frequenze di movimento del nous. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia comune, è che vengono analizzate le vibrazioni fluide; pertanto, questo metodo non è limitato da alcuna risoluzione ottica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nell'ambito dell'ambientalismo, come l'analisi dell'acqua negli ecosistemi socratici.Cominciare preparando un microscopio eretto dotato di illuminazione in campo oscuro. Fornire al microscopio sia un obiettivo a immersione in acqua sia un obiettivo ad aria. Inoltre, accoppiare al microscopio un trappola ottica a onda continua di 1064 nanometri.Successivamente, montare una telecamera con un filtro a intaglio a 1064 nanometri per rilevare e immaginare il movimento delle particelle d'oro e dell'opus. Utilizzare un misuratore di potenza dopo l'obiettivo per impostare la potenza del laser a 1000 milliwatt. Spegnere il laser fino a quando non è necessario.La preparazione del campione inizia con il pipettare una goccia d'acqua di 180 microlitri su un vetrino da microscopio. A questo punto, posizionare il campione sul microscopio a campo scuro, pipettare l'OPIS da un serbatoio d'acqua e trasferirlo nella goccia d'acqua.Selezionare l'obiettivo aereo 10x. Osservare il movimento dell'OPIS in soluzione e registrare un flusso video di dieci secondi a 25 fotogrammi al secondo. Al termine, prepararsi per il passaggio successivo.Diluire una parte di soluzione madre di nanoparticelle d'oro con diametro di 60 nanometri in 100 parti di acqua. Tornare al microscopio e misurare cinque microlitri della soluzione. Aggiungere questo alla goccia d'acqua con opus.Quando pronto, passare a un obiettivo ad immersione in acqua da 100x. Per visualizzare la goccia d'acqua, procedere quando circa una nanoparticella d'oro è visibile nel campo visivo. Per intrappolare una particella, accendere il laser della trappola ottica e osservare la goccia.Spostare la piastra del microscopio per avvicinare il fascio laser a una nanoparticella d'oro. La particella verrà attratta verso il punto focale del fascio laser e smetterà di diffondere. Registrare un video della nanoparticella intrappolata a 50 fotogrammi al secondo per 30 secondi, quindi spegnere il laser del tweezers ottico per rilasciare la particella dalla trappola.Il passo successivo consiste nell'analizzare il video su un computer. Utilizzare un software di tracciamento delle particelle per determinare la posizione XY della particella in funzione del tempo e trovare lo spettro di frequenza mediante una trasformata di Fourier veloce (FFT) di questi dati. Questo grafico mostra lo spostamento XY di una nanoparticella d'oro intrappolata, che è soggetta esclusivamente a moto browniano.La distribuzione è gaussiana. Dopo l'aggiunta di un OIS all'acqua, lo spostamento XY della particella cambia a causa di vibrazioni fluide. Il flusso microfluidico generato dall'animale provoca una distorsione dipendente dalla frequenza nella direzione Y.Questi grafici mostrano gli spettri di frequenza nelle direzioni x e y in nero, ovvero uno spettro di riferimento per una particella otticamente intrappolata che non è in presenza di opis. Le curve rosse mostrano gli spettri di una particella intrappolata con un opis in movimento. Lo spettro nella direzione X non mostra un segnale intenso a causa della posizione dell'OPIS rispetto alla particella intrappolata.Il flusso è principalmente nella direzione Y, come indicato nell'insetto. Lo spettro nella direzione Y, registrato con le manopole di nuoto, mostra una risposta. La risposta in frequenza ampia nella misurazione è coerente con la motilità dell'organismo, ad esempio il movimento dell'antenna principale o di altre parti del corpo.Massimi di frequenza. In tutte le misurazioni, i valori si sono attestati tra 3,0 e 7,2 hertz, in buon accordo con le frequenze osservate direttamente. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 30 minuti se realizzata correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di mantenere un confinamento tridimensionale stabile della nanoparticella d'oro mediante forze ottiche.

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