Doppio strato lipidico delle vescicole Generation Uso Microfluidic getto
21 febbraio 2014
Getto microfluidica contro un doppio strato lipidico interfaccia gocciolina fornisce un modo affidabile per generare vescicole con controllo sulla asimmetria membrana, incorporazione di proteine transmembrana, e incapsulamento del materiale. Questa tecnica può essere applicata a studiare una varietà di sistemi biologici in cui sono determinanti biomolecole compartimenti.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare vescicole a doppio strato fosfolipidico con un maggiore controllo sulla membrana, l'unla, la molarità, la monodispersità e il contenuto interno. Utilizzando il cad, una camera è realizzata con fogli acrilici e gomma naturale. Un doppio strato lipidico sospeso viene prodotto caricando la camera con lipidi e soluzione.
Successivamente, un getto d'inchiostro contenente la soluzione da incapsulare viene impostato con l'apparato a getto. Una volta stabilite le impostazioni appropriate, gli impulsi di fluido a getto produrranno vescicole a doppio strato lipidico. In definitiva, il getto microfluidico produce vescicole a doppio strato monodisperse ripetibili.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'elettroformazione, l'emulsione o la generazione di goccioline, è l'aumento del livello di controllo che governa la membrana, la molarità unilaterale, la monodispersità e il contenuto interno. A dimostrare la procedura sarà Johanna Harrow, una studentessa laureata di un laboratorio e ad assistere sarà Kara Patel, una studentessa universitaria Utilizzando il software CAD, disegnare una forma per la camera che può essere realizzata in acrilico utilizzando un primo trapano da taglio laser, un foro passante da 16 pollici su entrambi i lati della camera acrilica assemblata. Questo drenerà nel pozzo a forma di infinito.
In secondo luogo, taglia un piccolo rettangolo con le forbici da un foglio acrilico di 0,2 millimetri per fungere da fondo a forma di infinito. Fissalo bene in posizione con l'adesivo ad asciugatura rapida, assicurandoti di non far entrare la colla nelle aree di visualizzazione. Il foglio acrilico deve essere lavato sulla parete della camera e fissato al fondo della camera.
In terzo luogo, utilizzare un adesivo ad asciugatura rapida per incollare un sottile pezzo di foglio di gomma naturale sui fori praticati. Premerli in posizione con una pinzetta. Verifica che tutte le cuciture incollate non presentino perdite.
Non dovrebbero essercene alcuno. Infine, utilizzando un ago calibro 23, praticare dei fori nella gomma attraverso i fori praticati, la punta del getto d'inchiostro piezoelettrico verrà inserita attraverso questi fori. I fosfolipidi di riserva devono essere disciolti in cloroformio e conservati a meno 20 gradi Celsius.
D-P-H-P-C o DOPC. In questa dimostrazione vengono utilizzati i lipidi. I lipidi disciolti nel cloroformio vengono trasferiti in una fiala di vetro tenendo la fiala inclinata, asciugando delicatamente i lipidi sotto argon o azoto gassoso.
Quindi posizionare il flaconcino con il tappo leggermente allentato sotto vuoto per una o due ore per rimuovere il solvente residuo. Per questa fase è possibile utilizzare anche un essiccante. Ora solubilizzare i lipidi in end decking per una concentrazione lipidica finale di 25 milligrammi per millilitro.
Vortex la soluzione. Sigillare brevemente il tappo con param e poi sonicare per 15 minuti. Conservare questa soluzione a meno 20 gradi Celsius.
Successivamente, preparare una soluzione stock di saccarosio con osmolarità fisiologica. Questa è la soluzione a getto. Prendi in considerazione l'aggiunta di una goccia di colorante alimentare scuro o perline fluorescenti alla soluzione per un maggiore contrasto o fluorescenza.
Caricare la soluzione di saccarosio in una siringa da un millilitro per rimuovere l'aria intrappolata. Muovi la siringa in modo che eventuali bolle salgono all'apertura dell'esca e possano essere espulse. Quindi, collegare un filtro da 33 millimetri da 0,22 micron alla siringa e spingere fuori una goccia attraverso il filtro.
Ora svita l'adattatore per esca femmina del getto d'inchiostro e premilo sull'estremità del filtro. Espellere un po' di liquido per rimuovere l'aria intrappolata. Infine, collegare la siringa alla parte superiore del fluido a getto d'inchiostro.
Dovrebbe viaggiare fino alla punta del getto d'inchiostro se la siringa è stata collegata correttamente. Per prima cosa, montare il gruppo siringa sul tavolino del microscopio e collegare il controller a getto d'inchiostro per questo esperimento. Il tavolino e la siringa necessitano di un controllo indipendente con il tavolino e la siringa che si muovono entrambi in tre dimensioni per la visualizzazione.
Configura una telecamera ad alta velocità in grado di raggiungere almeno 1000 fotogrammi al secondo. Impostalo per utilizzare l'attivazione automatica basata su immagini per avviare le registrazioni. Ora, fissa la camera al tavolino con del nastro adesivo e allinea accuratamente la punta a getto d'inchiostro con il foro praticato nel foglio di gomma sul lato della camera.
Per prima cosa, regolare a occhio e poi effettuare regolazioni fini utilizzando il microscopio. Una volta allineata, estrarre la siringa lungo una dimensione per caricare la siringa a forma di infinito. Bene, quindi applica una leggera pressione sullo stantuffo, in modo che si formi una gocciolina sull'ugello.
Questo fornisce una certa contropressione iniziale. I parametri di getto devono essere impostati. Successivamente, i valori specifici per un'onda bipolare trapezoidale sono presentati sullo schermo, la tensione applicata e il numero di impulsi del getto per dimensione della vescicola di controllo del grilletto.
Ora caricare la camera con 25-30 microlitri di soluzione lipidica alla fine del decennio, coprendo l'intera superficie della forma all'infinito. Bene quindi a ciascuno, aggiungere bene 25 microlitri di soluzione di glucosio al bordo più esterno pipettando lentamente e senza intoppi, il glucosio non deve mescolarsi alla soluzione lipidica. Entro 10 minuti, si formerà un doppio strato lipidico al centro della camera.
L'impostazione del doppio strato è il passaggio più critico poiché il doppio strato è instabile e può rompersi a seconda della preparazione. Sii paziente. Funzionerà una volta che ti eserciterai a riempire la camera un paio di volte.
Ora, reinserire con cautela la punta a getto d'inchiostro nella camera quando la punta si trova entro 200 micron dall'interfaccia delle gocce. Il doppio strato, l'avvio del processo di getto e la registrazione dei dati utilizzando il getto d'inchiostro hanno fornito informazioni dettagliate sul processo di generazione delle vescicole. Ad esempio, la variazione della distanza tra l'ugello a getto d'inchiostro e il doppio strato lipidico ha influenzato la forza che deforma la membrana. Chiudere.
La vicinanza al doppio strato focalizzava la corrente a getto e impediva alla membrana di disperdere energia lontano dal punto di generazione delle vescicole. Inoltre, la corsa del vortice aumentava con la tensione applicata all'attuatore elettrico pizo. La formazione delle vescicole è stata visualizzata come una sequenza di eventi successivi alla loro formazione.
La stabilità delle vescicole tendeva a variare con il diametro delle vescicole, con le vescicole più piccole più stabili. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare vescicole violatrici lipidiche usando il getto microfluidico.
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Panoramica
Questo articolo discute un metodo per generare vescicole di bilayer fosfolipidico utilizzando il jetting microfluidico contro un'interfaccia di goccioline di bilayer lipidico. La tecnica permette un controllo preciso sull'asimmetria della membrana, l'incorporazione di proteine transmembrana e l'incapsulamento di materiali.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Biofisica
- Biotecnologia
Sfondo
- Le vescicole di bilayer fosfolipidico sono essenziali per studiare le biomolecole compartimentate.
- Le tecniche microfluidiche migliorano la riproducibilità e il controllo della formazione delle vescicole.
- Comprendere le proprietà della membrana è cruciale per varie applicazioni biologiche.
- La tecnologia del jetting può semplificare il processo di generazione delle vescicole.
Obiettivo dello studio
- Generare vescicole con caratteristiche della membrana controllate.
- Facilitare l'incorporazione di proteine specifiche nel bilayer.
- Consentire l'incapsulamento di vari materiali per scopi di ricerca.
Metodi utilizzati
- Produzione di una camera da fogli di acrilico e gomma naturale.
- Produzione di un bilayer lipidico sospeso caricando la camera con lipidi e soluzione.
- Configurazione di un apparato inkjet per l'incapsulamento delle soluzioni.
- Stabilire impostazioni appropriate per gli impulsi di fluido jettati per creare vescicole.
Risultati principali
- Il jetting microfluidico produce vescicole di bilayer ripetibili e monodisperse.
- Il metodo permette un controllo preciso sulle proprietà delle vescicole.
- L'incapsulamento dei materiali viene ottenuto efficacemente.
- Le vescicole possono essere adattate per vari studi biologici.
Conclusioni
- Il jetting microfluidico è una tecnica affidabile per la generazione di vescicole.
- Il controllo sull'asimmetria della membrana e l'incorporazione di proteine è migliorato.
- Questo metodo ha implicazioni significative per lo studio delle biomolecole compartimentate.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Microfluidic jetting enables precise control over lipid bilayer vesicle generation, supporting reproducible production of giant unilamellar vesicles (GUVs) with defined membrane composition and encapsulation capacity. This capability addresses a key challenge in synthetic biology and drug delivery research by providing a tunable platform for modeling cellular systems and testing bioactive compounds. The method enhances predictive confidence in early-stage target validation by allowing systematic interrogation of membrane-dependent processes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled membrane asymmetry and transmembrane protein incorporation.
- Operational Value: Supports functional target validation by generating reproducible vesicle systems for pathway clarification.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative readouts on lipid-protein interactions and encapsulation efficiency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by producing mono-dispersed vesicles with tunable size and internal content.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through precise jetting parameters that control vesicle formation.
- Screening Readiness: Highlights platform scalability and reuse for reliable compound evaluation across multiple conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through the use of physiological-like osmolarity solutions and fluorescent tracking for vesicle monitoring.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling encapsulation of therapeutic candidates for stability and release studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decision-making by providing measurable outputs on vesicle stability and diameter-dependent performance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to lead identification, particularly in assays requiring controlled membrane environments and encapsulated compound delivery.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by enabling systematic variation of lipid composition and transmembrane protein incorporation to clarify pathway dependencies.
- Screening: Describes assay readiness through the generation of mono-dispersed vesicles that ensure consistent compound exposure and reproducible readouts.
- Analytics: Highlights quantitative measurements such as vesicle size, formation rate, and encapsulation efficiency that help teams compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling encapsulation of drugs or biomolecules for stability testing and release profiling.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, adaptable across multiple projects requiring synthetic vesicle platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in membrane-related mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of vesicle production for high-throughput applications.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early de-risking of delivery mechanisms.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on vesicle performance data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, lipid handling, and microscopy for chamber assembly and bilayer formation.
- Depends on instrumentation including piezo-actuated inkjet devices, high-speed cameras, and vacuum drying systems.
- Necessitates cross-team standardization of lipid solutions, jetting parameters, and chamber alignment procedures.
- Involves adaptation considerations for different lipid types, transmembrane proteins, and encapsulation agents across model systems.
- Includes practical limitations such as bilayer instability during setup and sensitivity to environmental vibrations during jetting.
