Doppio strato lipidico delle vescicole Generation Uso Microfluidic getto
21 febbraio 2014
Getto microfluidica contro un doppio strato lipidico interfaccia gocciolina fornisce un modo affidabile per generare vescicole con controllo sulla asimmetria membrana, incorporazione di proteine transmembrana, e incapsulamento del materiale. Questa tecnica può essere applicata a studiare una varietà di sistemi biologici in cui sono determinanti biomolecole compartimenti.
L'obiettivo generale di questa procedura è generare vescicole a doppio strato fosfolipidico con un maggiore controllo su membrana, unla, molarità, monodisperseità e contenuti interni. Utilizzando cad, una camera viene realizzata a partire da fogli di acrilico e gomma naturale. Un doppio strato lipidico sospeso viene prodotto caricando la camera con lipidi e soluzione.
Successivamente, si prepara un getto a inchiostro contenente la soluzione da incapsulare, collegandolo all'apparato di jetting. Una volta stabiliti i parametri appropriati, gli impulsi di fluido emessi genereranno vescicole a doppio strato lipidico. In definitiva, il jetting microfluidico produce vescicole a doppio strato mono-disperse e riproducibili.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'elettroformazione, l'emulsione o la generazione di gocce è il maggiore livello di controllo sulle membrane, sulla molarità unilaterale, sulla monodisperseità e sui contenuti interni. A dimostrare la procedura sarà Johanna Harrow, studentessa laureanda di un laboratorio, assistita da Kara Patel, studentessa universitaria. Utilizzando un software CAD, disegnare una forma per la camera che possa essere realizzata in acrilico mediante un taglio laser; praticare prima dei fori passanti di un sedicesimo di pollice su entrambi i lati della camera assemblata in acrilico. Questi si collegheranno alla pozzetta a forma di infinito.
In secondo luogo, ritagliare con le forbici un piccolo rettangolo da un foglio di acrilico da 0,2 millimetri da utilizzare come fondo della camera a forma di infinito. Fissare saldamente questo elemento con un adesivo a rapida essiccazione, avendo cura di non far penetrare la colla nelle aree di osservazione. Il foglio di acrilico deve essere allineato con la parete della camera e fissato saldamente alla sua base.
In terzo luogo, utilizzare un adesivo a rapida essiccazione per incollare un sottile pezzo di gomma naturale sulle forature. Premere bene in posizione con pinzette. Verificare tutte le giunzioni incollate per rilevare eventuali perdite.
Non dovrebbe essercene alcuno. Infine, utilizzando un ago da 23 gauge, praticare dei fori nel materiale gommoso attraverso i fori già realizzati; la punta piezoelettrica per jet d'inchiostro verrà inserita attraverso questi fori. I fosfolipidi di riserva devono essere sciolti nel cloroformio e conservati a meno 20 gradi Celsius.
D-P-H-P-C o DOPC. I lipidi vengono utilizzati in questa dimostrazione. I lipidi sciolti in cloroformio vengono trasferiti in un vial di vetro tenendo il vial inclinato, quindi i lipidi vengono essiccati delicatamente sotto gas argon o azoto.
Quindi posizionare la provetta con il tappo leggermente allentato sotto vuoto per uno o due ore per rimuovere il solvente residuo. Per questo passaggio si può utilizzare anche un essiccatore. Ora solubilizzare i lipidi in end decking per ottenere una concentrazione finale di lipidi di 25 milligrammi per millilitro.
Vortexare la soluzione. Sigillare brevemente il tappo con del paraffina e quindi sottoporre a sonicazione per 15 minuti. Conservare questa soluzione a meno 20 gradi Celsius.
Successivamente, preparare una soluzione madre di saccarosio con un'osmolarità fisiologica. Questa è la soluzione di jetting. Si può prendere in considerazione l'aggiunta di una goccia di colorante alimentare scuro o di microsfere fluorescenti alla soluzione per aumentare il contrasto o la fluorescenza.
Caricare la soluzione di saccarosio in una siringa da un millilitro per rimuovere l'aria intrappolata. Dare dei colpetti alla siringa in modo che eventuali bolle d'aria risalgano verso l'apertura del lure e possano essere espulse. Successivamente, fissare un filtro da 33 millimetri e 0,22 micron alla siringa ed espellere una goccia attraverso il filtro.
Ora svitare l'adattatore femmina del dispenser dell'inchiostro e premere l'estremità del filtro. Espellere un po' di liquido per rimuovere l'aria intrappolata. Infine, collegare la siringa alla sommità del liquido del dispenser dell'inchiostro.
Dovrebbe spostarsi verso la punta dell'inkjet se la siringa è stata correttamente collegata. Montare innanzitutto l'insieme della siringa sul palchetto del microscopio e collegare il controller dell'inkjet per questo esperimento. Il palchetto e la siringa richiedono un controllo indipendente, con entrambi che si muovono in tre dimensioni per la visualizzazione.
Impostare una telecamera ad alta velocità in grado di raggiungere almeno 1000 fotogrammi al secondo. Configurarla per utilizzare l'avvio automatico basato sull'immagine per iniziare le registrazioni. A questo punto, fissare la camera al supporto con del nastro adesivo e allineare con attenzione la punta dell'inkjet con il foro praticato nel foglio di gomma sul lato della camera.
Prima regolare ad occhio, quindi effettuare regolazioni fini utilizzando il microscopio. Una volta allineato, ritirare lentamente la siringa lungo una dimensione per caricare la forma ad infinito. Successivamente applicare una leggera pressione sullo stantuffo, in modo che si formi una goccia sulla punta.
Questo fornisce una pressione di ritorno iniziale. È necessario impostare i parametri di jetting. Successivamente, vengono mostrati a schermo valori specifici per un'onda bipolare trapezoidale: tensione applicata e numero di impulsi di jet per ogni impulso di attivazione, che controllano la dimensione delle vescicole.
Ora caricare la camera con 25-30 microlitri della soluzione lipidica in end decade, coprendo l'intera superficie della forma ad infinito. Successivamente, aggiungere 25 microlitri di soluzione di glucosio al bordo esterno, pipettando lentamente e con movimenti uniformi; il glucosio non deve mescolarsi alla soluzione lipidica. Entro 10 minuti, un doppio strato lipidico si formerà al centro della camera.
La preparazione del bilayer è il passaggio più critico poiché il bilayer è instabile e può rompersi a seconda della preparazione. Siate pazienti. Funzionerà una volta che avrete praticato il riempimento della camera per alcune volte.
Ora, inserire con attenzione la punta dell'inkjet nuovamente nella camera quando la punta si trova entro 200 micrometri dall'interfaccia della goccia. Bilayer, avviare il processo di jetting e registrare i dati utilizzando l'inkjet, che ha fornito informazioni sul processo di generazione delle vescicole. Ad esempio, variare la distanza tra la bocchetta dell'inkjet e il bilayer lipidico ha influenzato la forza che deforma la membrana. Chiudi.
La vicinanza al bicchierino ha focalizzato il getto e impedito alla membrana di disperdere l'energia lontano dal punto di generazione della vescicola. Inoltre, la velocità del vortice è aumentata con la tensione applicata all'attuatore piezoelettrico. La formazione delle vescicole è stata visualizzata come una sequenza di eventi successivi alla loro formazione.
La stabilità delle vescicole tendeva a variare in base al diametro, con le vescicole più piccole che risultavano più stabili. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare vescicole lipidiche utilizzando il jetting microfluidico.
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Panoramica
In questo articolo viene descritto un metodo per la generazione di vescicole a doppio strato fosfolipidico mediante microfluidica a getto su un doppio strato lipidico all'interfaccia di una goccia. La tecnica consente un controllo preciso sull'asimmetria della membrana, sull'incorporazione di proteine transmembrana e sul confinamento di materiali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biophysica
- Biotecnologia
Sfondo
- Le vescicole a doppio strato di fosfolipidi sono essenziali per lo studio di biomolecole compartimentalizzate.
- Le tecniche microfluidiche migliorano la riproducibilità e il controllo della formazione delle vescicole.
- Comprendere le proprietà della membrana è fondamentale per numerose applicazioni biologiche.
- La tecnologia jetting può semplificare il processo di generazione delle vescicole.
Scopo dello studio
- Generare vescicole con caratteristiche della membrana controllate.
- Facilitare l'incorporazione di proteine specifiche nel doppio strato lipidico.
- Permettere l'incapsulamento di vari materiali a fini di ricerca.
Metodi Utilizzati
- Realizzazione di una camera utilizzando fogli di acrilico e gomma naturale.
- Formazione di un bilayer lipidico sospeso caricando la camera con lipidi e soluzione.
- Preparazione di un apparato a getto d'inchiostro per l'incapsulamento di soluzioni.
- Definizione delle condizioni ottimali per gli impulsi di fluido erogati tramite getto al fine di generare vescicole.
Risultati principali
- La microfluidica a getto produce vescicole bicamerali mono-disperse riproducibili.
- Il metodo consente un controllo preciso sulle proprietà delle vescicole.
- L'incapsulamento dei materiali viene effettuato in modo efficace.
- Le vescicole possono essere modulate per diversi studi biologici.
Conclusioni
- La microfluidica a getto è una tecnica affidabile per la generazione di vescicole.
- Il controllo sull'asimmetria della membrana e sull'incorporazione di proteine è potenziato.
- Questo metodo ha implicazioni significative per lo studio di biomolecole compartimentalizzate.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'uso del microjetting consente un controllo preciso sulla generazione di vescicole a doppio strato lipidico, favorendo la produzione riproducibile di vescicole unilamellari giganti (GUVs) con composizione della membrana definita e capacità di incapsulamento. Questa capacità risolve una sfida fondamentale nella ricerca in biologia sintetica e nel rilascio di farmaci, fornendo una piattaforma regolabile per la modellizzazione di sistemi cellulari e la sperimentazione di composti bioattivi. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nella validazione precoce dei bersagli, consentendo un'analisi sistematica di processi dipendenti dalla membrana.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante il controllo dell'asimmetria della membrana e l'incorporazione di proteine transmembrana.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale di bersagli generando sistemi di vescicole riproducibili per la chiarificazione dei percorsi biologici.
- Valore predittivo: Facilita la selezione di portafogli fornendo letture quantitative sulle interazioni lipide-proteina e sull'efficienza di incapsulamento.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi producendo vescicole mono-disperse con dimensioni e contenuto interno regolabili.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità dei saggi attraverso parametri di jetting precisi che controllano la formazione delle vescicole.
- Prontezza per lo screening: Mette in evidenza la scalabilità e la riutilizzabilità della piattaforma per la valutazione affidabile di composti in diverse condizioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Discute la rilevanza per le malattie attraverso l'uso di soluzioni con osmolarità fisiologica e il tracciamento fluorescente per il monitoraggio delle vescicole.
- Allineamento Preclinico: Descrive la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, consentendo l'incapsulamento di candidati terapeutici per studi sulla stabilità e sul rilascio.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Supporta il processo decisionale fornendo risultati misurabili sulla stabilità delle vescicole e sulle prestazioni dipendenti dal diametro.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dal test iniziale delle ipotesi all'identificazione del composto guida, in particolare nei saggi che richiedono ambienti di membrana controllati e il rilascio di composti incapsulati.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica delle ipotesi permettendo una variazione sistematica della composizione lipidica e l'incorporazione di proteine transmembrana per chiarire le dipendenze dei percorsi.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso la generazione di vescicole mono-disperse che garantiscono un'esposizione costante ai composti e letture riproducibili.
- Analisi: Mette in evidenza misurazioni quantitative come la dimensione delle vescicole, la velocità di formazione e l'efficienza di incapsulamento, che aiutano i gruppi a confrontare le condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica consentendo l'incapsulamento di farmaci o biomolecole per test di stabilità e profili di rilascio.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile piuttosto che una tecnica monouso, adattabile a diversi progetti che richiedono piattaforme di vescicole sintetiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei meccanismi legati alle membrane.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della produzione di vescicole per applicazioni ad alto rendimento.
- Valore strategico: Migliori decisioni di avanzamento o interruzione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate grazie alla riduzione precoce dei rischi associati ai meccanismi di somministrazione.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio basate sui dati di prestazione delle vescicole.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microfluidica, manipolazione dei lipidi e microscopia per il montaggio della camera e la formazione del doppio strato lipidico.
- Richiede strumentazione specifica, tra cui dispositivi inkjet azionati da piezoelettrici, telecamere ad alta velocità e sistemi di essiccazione sotto vuoto.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alle soluzioni lipidiche, ai parametri di jetting e alle procedure di allineamento della camera.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi tipi di lipidi, proteine transmembrana e agenti di incapsulamento nei vari sistemi modello.
- Comprende limitazioni pratiche, come l'instabilità del doppio strato lipidico durante l'allestimento e la sensibilità alle vibrazioni ambientali durante il jetting.
