Due metodi per stabilire primarie cellule umane endometriale stromali da isterectomia campioni

L'obiettivo generale di questa procedura è stabilire colture primarie di cellule stromali endometriali da isterectomie resecate. Ciò si ottiene distinguendo e separando prima gli strati uterini per isolare una sezione di tessuto endometriale. Il secondo passo consiste nello scegliere una tecnica di isolamento cellulare tra i metodi di raschiatura e tryin quando si utilizza il metodo di raschiatura.

La forza meccanica e la raschiatura vengono utilizzate per separare e dissociare le cellule stromali endometriali. In alternativa, quando si utilizza il metodo della tripsina, l'attività enzimatica della tripsina viene utilizzata per separare e dissociare le cellule stromali endometriali. In definitiva, la microscopia viene utilizzata per osservare la crescita e la morfologia cellulare, mentre altre tecniche discusse nel manoscritto vengono utilizzate per verificare le colture stromali endometriali.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave di fisiologia nel campo riproduttivo: fenomeni come il ciclo riproduttivo e le mestruazioni, i campioni di isterectomia utilizzati in questo manoscritto sono stati raccolti in conformità con un protocollo etico approvato dall'IRB universitario, numerato I-R-B-H-S-R, numero 1, 4, 4, 2, 4. Conservare il tessuto derivato dal paziente in una provetta da 50 millilitri contenente RPMI o DMEM con glucosio elevato a quattro gradi Celsius per non più di 24 ore prima che il campione venga elaborato. Quando è pronto per iniziare, lavare il campione di tessuto tre volte con un XPBS ed eliminare la soluzione tra un lavaggio e l'altro.

Quindi aggiungere da quattro a 10 millilitri di terreno di coltura integrati con il 10% di FBS e l'1% di penicillina streptomicina al campione di tessuto. Inoltre, aggiungere una zona di funghi a una concentrazione finale di 0,25 microgrammi per millilitro e incubare per 30 minuti. Quindi, scartare il terreno di coltura e lavare il fazzoletto due volte con un XPBS.

Posiziona il tessuto su una piastra di coltura cellulare di sei centimetri e identifica lo strato di endometrio utilizzando queste immagini come guida. Quindi separare l'endometrio e conservare gli altri strati di tessuto per un uso futuro. Usa un bisturi o una lama di rasoio per sezionare il tessuto in piccoli pezzi mentre graffi sul piatto di coltura cellulare.

I graffi facilitano l'attacco delle cellule stromali endometriali primarie emergenti. Quindi, aggiungi delicatamente due millilitri di terreno di coltura al piatto graffiato. In questa fase, i frammenti di tessuto saranno visibili e immobilizzati dal movimento di graffio.

Collocare la piastra in un incubatore per colture cellulari designato, separato dalle altre linee cellulari per evitare contaminazioni. Monitora le cellule quotidianamente utilizzando un microscopio ottico. Cerca piccole popolazioni di cellule che emergono dal tessuto affettato entro il secondo o il terzo giorno ogni tre giorni.

Rimuovere delicatamente le vecchie colture di lavaggio con un XPBS e quindi aggiungere due millilitri di terreno di coltura fresco. Inizia ad aggiungere quattro millilitri di terreno di coltura. Una volta che il tasso di proliferazione aumenta durante le fasi di lavaggio, aspirare i pezzi di tessuto rimanenti.

È improbabile che emergano nuove colonie dal tessuto. Dopo una settimana di passaggio di crescita, le cellule utilizzano lo 0,05% di tripsina. Quando le cellule raggiungono tra il 75 e l'80% di fluenza, congelare una piastra di cellule.

Una volta mantenute due o tre piastre, le celle primarie non possono essere fatte passare all'infinito. Per iniziare l'isolamento mediato da tripsina, posizionare un piccolo pezzo di tessuto endometriale in un tubo conico con due millilitri di tripsina allo 0,25% integrati con 0,03 milligrammi per millilitro. La micina può quindi incubare il tessuto su una piattaforma rotante a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Quindi, agitare brevemente il fazzoletto e poi centrifugare da 200 a 400 volte G per due minuti, scartare il surnatante e aggiungere tripsina fresca. E la micina può quindi incubare il tessuto a 37 gradi Celsius per un'ora durante la rotazione. Dopo l'incubazione, agitare il tessuto per cinque-10 secondi.

Quindi aggiungere due millilitri di terreno di coltura contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina streptomicina. Per disattivare la tripsina, centrifugare le cellule a 200-400 volte G per due o tre minuti. Quindi scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare.

In due millilitri di terreno di coltura, la piastra la sospensione cellulare su una piastra di coltura cellulare di sei centimetri e raschia la piastra per migliorare l'adesione delle cellule primarie. Monitora quotidianamente la crescita cellulare con un microscopio ottico e cambia i mezzi di crescita ogni due o tre giorni. Una volta che le cellule hanno raggiunto una cofluenza compresa tra il 75 e l'80%, utilizzare lo 0,05% o lo 0,25% di tripsina per farle passare, isolando le cellule stromali endometriali.

L'uso del metodo raschiante genera gruppi di cellule emergenti precoci. Lungo i graffi indotti dal bisturi, le cellule stromali endometriali possono essere identificate dalla loro morfologia fibroblastica. Il metodo della tripsina ha un tempo di preparazione più lungo rispetto al metodo di raschiatura, ma le cellule vitali si osservano prima.

Il metodo della tryin genera anche cellule con modelli di crescita sia raggruppati che dispersi. Non è stato ancora scoperto un marcatore tessuto-specifico per le cellule stromali endometriali. Un modo in cui le cellule stromali endometriali vengono identificate è misurando la perdita di un marcatore.

Per le cellule epiteliali come la citocheratina. La mancanza di citocheratina dimostra l'assenza di cellule epiteliali endometriali. La perdita di colorazione delle citocheratine osservata nel passaggio cinque rispetto al passaggio due, conferma l'assenza di cellule epiteliali.

L'evidenza funzionale della presenza di cellule stromali endometriali può essere fornita utilizzando un test di decellularizzazione. L'aumento della prolattina e della proteina legante il fattore di crescita insulino-simile in risposta al trattamento con CAMP e idrossiprogesterone acetato indica il successo dell'instaurazione di una coltura stromale endometriale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire colture primarie di cellule stromali endometriali da isterectomie resecate.