Caratterizzazione di G recettori accoppiati alla proteina da un calcio di Mobilitazione Assay Basato sulla fluorescenza

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di identificare ligandi funzionalmente attivanti di recettori accoppiati a proteine G orfane o G PCR. Ciò si ottiene mediante transsezione transitoria, A-G-P-C-R di interesse e transsezione cult di un costrutto G alfa 16 promiscuo in un sistema di espressione cellulare per ottenere un'espressione eterologa temporanea di entrambe le proteine. In una seconda fase, le cellule trasfettate vengono caricate con il colorante sensibile al calcio flu oh four, che rileva il rilascio di calcio dalle riserve intracellulari attraverso un aumento del segnale fluorescente in seguito all'interazione con il calcio.

Successivamente, il saggio di mobilizzazione del calcio basato sulla fluorescenza viene eseguito sfidando il recettore eterologo espresso con una libreria di composti di ligandi candidati per determinare i composti che attivano il recettore e suscitano una cascata di segnalazione intracellulare con conseguente rilascio di calcio dal reticolo endoplasmatico, che può essere misurato come segnale fluorescente. Si ottengono risultati che mostrano una curva concentrazione-risposta con la metà della concentrazione massima efficace di un ligando attivante, che si basa sulla rilevazione di diversi segnali fluorescenti a seconda delle concentrazioni di ligandi somministrati al sistema di espressione cellulare. Il vantaggio principale dell'esecuzione del transfect transitorio per ottenere l'espressione temporanea del GPCR rispetto all'uso di linee cellulari clonali stabili è che non richiede la creazione di tali linee cellulari trasfettate stabilmente.

La trasfezione della subunità promiscua G alfa 16 può reindirizzare la via di segnalazione intracellulare della maggior parte dei GPCR verso il rilascio di calcio, indipendentemente dalla via di segnalazione nativa in contesti endogeni. In quanto tale, questa configurazione consente lo screening a media produttività di centinaia di composti su GPCR di interesse in un breve lasso di tempo, dimostrando che la procedura sarà gas giallo, uno studente di dottorato e Nick Su, un tecnico del nostro laboratorio Coltivare le cellule T HEK 2 93 in fiasche T 75 tre giorni prima che abbia luogo l'effettivo test di mobilizzazione del calcio, passaggio delle celle quando si raggiunge una confluenza dell'80%. Preparare un pallone T 75 per la trasfezione con il costrutto del recettore e uno per la trasfezione con un vettore di espressione vuoto come controllo negativo.

Incubare i palloni a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per 20-24 ore fino a quando le colture cellulari non si avvicinano al 50-70% di confluenza, come mostrato qui. Successivamente, aggiungere 3,9 microgrammi del costrutto del recettore o vettore vuoto e 3,9 microgrammi del costrutto di espressione G alfa 16 a un tubo di microfuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di tampone jet prime.

Mescolare bene facendo vorticare il tubo seguito da un breve giro. Quindi aggiungere 37,5 microlitri di vortice di reagenti jet prime e far girare per un minuto alla massima velocità. Incubare la miscela di trasfezione per 10 minuti.

A temperatura ambiente, etichettare una popolazione di cellule come trasfettata con il vettore di espressione, codificando il GPCR di interesse e il costrutto G alfa 16 e il secondo pallone con il vettore vuoto e il costrutto G alfa 16. Dopo l'incubazione, aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia al terreno di coltura cellulare, assicurandosi di pipettare direttamente nel terreno ed evitare il contatto con le pareti del pallone di coltura. Incubare i palloni a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per 20-24 ore per il test di mobilizzazione del calcio.

Le cellule trasfettate vengono raccolte e seminate in 96. Piastre inferiori trasparenti con pareti nere. Per prima cosa rivestire le piastre con 60 microlitri per pozzetto a temperatura ambiente.

Soluzione salina tamponata con fosfato con fibronectina. Incubare le piastre a temperatura ambiente per un'ora con il coperchio. Togliere la soluzione dai pozzetti e incubare nuovamente le piastre per un'ora senza coperchio a temperatura ambiente.

Nel frattempo, togliete il vecchio terreno di coltura dalle cellule. Sciacquare le cellule morte con tre millilitri di PBS e rimuovere il PBS. Quindi aggiungere tre millilitri di PBS a temperatura ambiente provando EDTA incubare per un minuto prima di rimuovere la soluzione.

A questo punto, la morfologia delle cellule cambia da forma di stella a forma di sfera. Staccare le celle dal fondo del pallone picchiettando delicatamente e raccoglierle risciacquando più volte con 10 millilitri di temperatura ambiente. DM em mezzo di trasferimento.

Trasferire le cellule in una provetta da 50 millilitri. Per contare il numero di cellule per millilitro, aggiungere 100 microlitri di coltura cellulare a una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere 100 microlitri di tampone di lisi e mescolare picchiettando la provetta.

Infine, aggiungere 100 microlitri di tampone stabilizzante e mescolare picchiettando. Riempire una cassetta nucleo con la sospensione cellulare e contare le cellule con il contatore. Il software nucleo view moltiplica automaticamente il numero di celle per tre man mano che le celle sono state diluite di un fattore tre.

Quando si aggiungono la lisi e il tampone stabilizzante, diluire le cellule fino a una concentrazione finale di 600.000 cellule per millilitro e seminare 150 microlitri di cellule per pozzetto nelle piastre rivestite. Per ottenere una densità cellulare di circa 90.000 celle per pozzetto, evitare bolle d'aria e picchiettare la piastra per distribuire le celle in modo uniforme. Per ottenere uno strato cellulare contiguo, incubare le piastre a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per 16-24 ore.

Scartare il mezzo dalle celle. Lavare le cellule con 200 microlitri di PBS per pozzetto e rimuovere il PBS. Si noti che tutti i passaggi seguenti che comportano operazioni con le celle devono essere eseguiti al buio perché da questo punto in poi le celle verranno caricate con il fluoro quattro.

Aggiungere 55 microlitri di tampone di carico per pozzetto, avvolgere la piastra in un foglio di alluminio per evitare l'esposizione della piastra alla luce e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, utilizzare il tampone di lavaggio per solubilizzare i peptidi essiccati in provette da microcentrifuga siliconate da 1,5 millilitri. Preparare una serie di diluizioni per eseguire un'analisi concentrazione-risposta e determinare il valore EC 50 di un ligando.

Tenere presente che 50 microlitri di un ligando dalla piastra del composto verranno trasferiti in un pozzetto con 100 microlitri di tampone di lavaggio sulla piastra cellulare durante il saggio, quindi preparare i composti a tre volte la concentrazione finale desiderata. Successivamente, aggiungere 70 microlitri di ligando nel pozzetto corrispondente della piastra composta in triplice copia. Includi controlli positivi e negativi su ogni piastra.

Eliminare il tampone di caricamento dalla piastra cellulare e aggiungere 100 microlitri di tampone di lavaggio a ciascun pozzetto evitando l'esposizione alla luce. Incubare la piastra per 15 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il tampone di lavaggio dalla piastra cellulare e aggiungere 100 microlitri di nuovo tampone di lavaggio a ciascuno.

Incubare bene la piastra cellulare, la piastra composta e un rack per puntali per 15 minuti. A 37 gradi Celsius, creare e caricare il file di protocollo desiderato con il software e attivare qui l'unità di controllo della temperatura per la camera di lettura. Le risposte del calcio vengono misurate a 37 gradi Celsius per due minuti, una riga alla volta con un intervallo di 1,52 secondi tra le letture successive a 525 nanometri.

Impostare l'eccitazione dell'influenza oh quattro a 488 nanometri e trasferire un volume totale di 50 microlitri di composto alla piastra cellulare. 18 secondi dopo la lettura. Iniziare con la velocità di erogazione impostata su 26 microlitri al secondo e un'altezza della pipetta di 135 microlitri.

Posizionare la piastra del composto e delle celle e il rack dei puntali negli appositi cassetti del dispositivo di stazione. Eseguire una singola lettura della piastra cellulare alla stessa lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione in modalità finale prima di avviare la schermata effettiva in modalità flex. Avviare il test e procedere all'analisi dei dati utilizzando il software illustrato.

Ecco i grafici corrispondenti a una delle tre repliche della serie di concentrazioni doofus short NPF one. Il controllo negativo non ha indotto un segnale fluorescente. Mentre il controllo positivo ha suscitato una forte attivazione del recettore endogeno attivato dalla proteasi uno, portando ad un alto segnale fluorescente.

Il software consente l'inserimento di formule per determinare la percentuale di attivazione o gli errori standard delle diverse concentrazioni, tra gli altri. I dati risultanti vengono utilizzati per comporre curve preliminari di concentrazione e risposta per stimare i valori di EC 50 come mostrato per i quattro peptidi NPF corti dell'esofago. Le curve includono anche i dati per il controllo negativo, dove le serie di concentrazione dei peptidi NPF corti di drosophila sono state testate su cellule trasfettate con un vettore vuoto.

I risultati indicano che l'aggiunta dei peptidi a queste cellule non ha alcun effetto sui recettori endogeni, ma attiva il recettore di interesse. Sono state eseguite le curve preliminari di concentrazione e risposta del saggio di mobilizzazione del calcio basato sulla fluorescenza e le concentrazioni testate sono state adattate per coprire l'intervallo dinamico della curva. I valori EC 50 di drosophila short npf 1, 2, 3 e four sono simili, indicando che sono ugualmente potenti per attivare il recettore Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come l'attività strutturale, gli studi sulle relazioni, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali amminoacidi del peptide sono cruciali per l'attivazione del recettore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una mobilizzazione del calcio basata sul senso della fluenza per identificare ligandi funzionalmente attivanti dei recettori accoppiati a proteine G. Ciò include il mantenimento dei sistemi di espressione solare seguiti dalla trasfezione transgender del sistema cellulare da parte del recettore di interesse.

Dopo la mobilizzazione rigida del calcio può essere effettuato il test.