Electrospinning Growth Factor Releasing Microsfere in Fibrosi Ponteggi

Questo protocollo combina elettrofilatura e microsfere per sviluppare scaffold di ingegneria tissutale per dirigere i neuroni. Il fattore di crescita nervoso è stato incapsulato all'interno di microsfere di PLGA e elettrofilato in scaffold fibrosi di acido ialuronico (HA). La bioattività della proteina è stata testata seminando gli scaffold con i gangli della radice dorsale del pulcino primario e coltivandoli per 4-6 giorni.

L'obiettivo generale di questa procedura è creare un ambiente multiforme per supportare la crescita e la riparazione dei nervi. Ciò si ottiene incapsulando prima i fattori di crescita all'interno di microsfere degradabili. Il secondo passo è preparare il materiale di supporto per la maggior parte dell'ambiente.

Successivamente, le microsfere e il materiale di supporto vengono combinati ed elettrofilati in un'impalcatura fibrosa allineata. Il passo finale consiste nel testare l'impalcatura con i neuroni dei gangli della radice dorsale del pulcino. In definitiva, la microscopia a immunofluorescenza viene utilizzata per dimostrare che la crescita e la direzione dei neuriti sono accelerate rispetto ai controlli.

Sebbene questo sistema sia progettato per il tessuto neurale con lievi modifiche alle proteine e ai materiali utilizzati, potrebbe anche essere applicato a vari tipi di tessuto, tra cui cuore, polmoni e ossa. Prima di iniziare questa procedura, preparare i reagenti necessari, soluzioni al 2% e allo 0,5% in peso per volume di alcol polivinilico o PVA in acqua deionizzata, una soluzione al 2% in volume per volume, alcol isopropilico e acqua deionizzata e una soluzione acquosa della proteina idrofila desiderata. Luogo. 40 millilitri della soluzione di PVA allo 0,5% in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e mettere da parte in una piccola fiala sciolta 300 milligrammi di acido polilattico co glicolico da 65 a 35 o PLGA e tre millilitri di clorometano.

Un miscelatore a vortice può essere utilizzato per accelerare la dissoluzione del PLGA, combinando 200 microlitri di soluzione proteica e quattro microlitri di soluzione di PVA al 2%. Versare la miscela di proteine PVA nella soluzione di PLGA. Le soluzioni rimarranno per lo più separate.

Mettere la fiala in un becher di acqua ghiacciata utilizzando un W ator a circa 10 watt, agitare la soluzione per cinque-10 secondi fino a creare un'emulsione bianca cremosa uniforme. Versare l'emulsione nel tubo da 50 millilitri precedentemente preparato contenente lo 0,5% di PVA. Mescolare la soluzione ad alta velocità su un miscelatore a vortice per circa 20 secondi.

La soluzione svilupperà un aspetto torbido. Trasferire l'emulsione in un becher da 200 millilitri e metterla su una piastra di cottura a 350 giri/min per due minuti. Aggiungere 50 millilitri di alcol isopropilico al 2% nel becher sulla piastra di agitazione.

Lasciare che la miscela continui a mescolare per almeno un'ora per consentire al clorometano di evaporare e al PLGA di indurirsi. Quindi, trasferire la soluzione di microsfere in provette da centrifuga, centrifugare a 425 volte G per tre minuti. Le microsfere si raccoglieranno sul fondo della provetta e appariranno bianche Rimuovere con cautela il surnatante dalla provetta sopra le microsfere e conservare in un flacone da 500 millilitri.

Sciacquare le microsfere con acqua deionizzata riempiendo ogni provetta per tre quarti e agitandola per ridistribuire le microsfere nel liquido. Ripetere la centrifugazione, la rimozione del surnatante e il risciacquo delle microsfere con acqua deionizzata quattro volte dopo il risciacquo finale. Rimuovere il surnatante e metterlo nel flacone da 500 millilitri con gli altri campioni.

Congelare le microsfere raccolte nelle provette da centrifuga a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per una notte, quindi liofilizzare per almeno 24 ore. La seguente soluzione di elettrofilatura deve essere preparata in anticipo in acqua deionizzata, 2% in peso per volume, acido ialuronico correlato alla metanfetamina o miha con il 3% in peso per volume, 900 kilodalton di ossido di polietilene o PEO e 0,05% in peso per volume. Soluzione di fotoiniziatore.

Dopo aver realizzato il volume desiderato di soluzione di elettrofilatura, aggiungere microsfere alla concentrazione desiderata fino a 400 milligrammi per millilitro. Mescolare la soluzione su un miscelatore a vortice fino a quando le microsfere non saranno distribuite uniformemente nella soluzione. Trasferire la soluzione in una siringa e collegare un ago a punta smussata calibro 18 da sei pollici.

Posizionare la siringa in una pompa a siringa e impostarla in modo che eroga a 1,2 millilitri all'ora. Fissare uno strato di foglio di alluminio sul mandrino. Ciò consente una facile pulizia e stoccaggio dell'impalcatura finita.

Un mandrino rotante viene utilizzato per creare fibre allineate. Collegare il filo di terra da un alto volumetage fonte di alimentazione all'apparato di raccolta. Collegare il cavo positivo all'ago per garantire il successo dell'elettrofilatura.

È molto importante verificare che tutte le connessioni e le impostazioni siano corrette. Avviare il pompaggio del polimero e quando la soluzione è visibile all'estremità della siringa, accendere la sorgente di tensione e impostare la tensione a 24 kilovolt. Eseguire la soluzione fino a raggiungere lo spessore dell'impalcatura desiderato.

Al termine, spegnere la fonte di tensione e la pompa a siringa. Per iniziare questa procedura, attaccare i relativi vetrini coprioggetto all'area di raccolta dell'elettrofilatore con nastro biadesivo rimovibile prima dell'elettrofilatura. La rotazione sui vetrini di copertura, facilita la manipolazione e la visualizzazione dopo l'elettrofilatura allo spessore desiderato.

Come dimostrato nel segmento video precedente, rimuovere con cautela i vetrini coprioggetto dal mandrino. Posizionare i vetrini di copertura rivestiti dell'impalcatura in una camera di azoto trasparente e assicurarsi che tutto l'ossigeno sia spurgato. Posizionare la camera e l'impalcatura sotto una luce quadrata a 365 nanometri da 10 milliwatt centimetri per 15 minuti.

Dopo la reticolazione, il coperchio scivola in una piastra a pozzetti di dimensioni adeguate. Assicurarsi che il lato dell'impalcatura sia rivolto verso l'alto. Posizionare da 100 a 200 microlitri di terreno su ogni impalcatura nella piastra a pozzetti. Attentamente.

Posizionare un ganglio radicolare dorsale o DRG su ciascuna impalcatura nella gocciolina del terreno. Per un'impalcatura spessa, potrebbero essere necessari più supporti. Il DRG deve essere completamente sommerso e non galleggiare.

Incubare l'impalcatura e il DRG a 37 gradi Celsius per quattro ore per consentire alla cellula di aderire all'impalcatura. Quindi, riempire il terreno fino al livello appropriato per il pozzo. Rimettere la piastra nell'incubatrice e incubare per quattro-sei giorni dopo il periodo di incubazione.

Rimuovere con cura il supporto da ciascun pozzetto e lavare delicatamente una volta con PBS. Fissare le celle per 30 minuti utilizzando il 4% di peso per volume. La para formaldeide successivamente colora le cellule per i neurofilamenti e i nuclei seguendo un protocollo stabilito.

Per visualizzare le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza, posizionare la piastra a pozzetti sul tavolino del microscopio e individuare la massa cellulare utilizzando il filtro e le impostazioni di eccitazione per dpi. Una volta identificata la cella, passare il filtro su zi. Per visualizzare i neuriti estesi, utilizzare la funzione di cucitura sul microscopio per raccogliere e combinare tutte le immagini necessarie per vedere l'intera struttura.

Ripetere per microsfere dpi, fite e in campo chiaro. 50 più o meno 14 micrometri di diametro con oltre l'85% di incapsulamento proteico sono stati prodotti in modo coerente e gli elettroni sono stati filati in scaffold con questo protocollo. Questa immagine fluorescente mostra microsfere rappresentative con Rod Domine nel guscio del PLGA e BSA incapsulato all'interno.

Per valutare l'incapsulamento, le microsfere sono state riempite con BSA e testate per il rilascio di proteine per oltre 60 giorni con un test proteico Bradford. Il rilascio inizia con una raffica iniziale e poi continua quando le microsfere si rompono dopo l'elettrorotazione. Le microsfere possono essere viste in tutta la struttura fibrosa 3D.

In questa immagine SEM dell'impalcatura completa. Le sfere possono essere viste in più strati indicati da frecce. Questa immagine ad alto ingrandimento è di una microsfera con le nano fibre dell'impalcatura sopra di essa.

I gangli della radice dorsale o DRG sono stati utilizzati per testare la vitalità del fattore di crescita nervoso o NGF nelle microsfere all'interno dell'impalcatura. Qui ci sono DRG seduti su un'impalcatura contenente microsfere. Caricato con NGF è mostrato accanto a una microsfere senza proteine all'interno del neurite più lungo Le estensioni che si estendono dal DRG sull'impalcatura NGF indicano che l'NGF è vitale e può promuovere la crescita.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come incapsulare le proteine in microsfere e incorporarle in scaffold fibrosi.