Name: Electrospinning Growth Factor Releasing Microsfere in Fibrosi Ponteggi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-16T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Scopri come creare scaffold fibrosi allineati con elettrofilatura e microsfere PLGA per il rilascio controllato di fattori di crescita nervosi. Questo metodo supporta la crescita direzionale dei neuriti nei gangli delle radici dorsali di pollo.

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Questo lavoro è stato parzialmente finanziato attraverso la Richard Barber Foundation e una Thomas Rumble Fellowship (TJW).

1. Acqua / Olio / Acqua Doppia Emulsione microsfere di produzione <ol><li> Prima preparare 2% e 0,5% w / v soluzioni di alcoli polivinilici (PVA) in acqua deionizzata. Mescolare le soluzioni a 50 ° C fino a chiaro, questo può richiedere diverse ore. Preparare una soluzione al 2% v / v alcool isopropilico in acqua deionizzata. </li><li> Preparare una soluzione acquosa di proteine ​​idrofila desiderato. La tabella seguente fornisce esempi di formulazioni. </li></ol><img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/51517/51517table1highres.jpg" /> Tabella 1:. Esempio proteine ​​Solutions Le seguenti soluzioni di proteine ​​sono stati inseriti con successo e elettrofilate utilizzando questo protocollo. Altre soluzioni proteiche idrofili possono essere utilizzati come necessario. <ol start="3"><li> Mettere 40 ml di soluzione di PVA 0,5% in una provetta da centrifuga da 50 ml e mettere da parte. </li><li> In una provetta da centrifuga 15 ml sciogliere 300 mg di 65:35poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) in 3 ml di diclorometano. Un miscelatore a vortice può essere utilizzato per accelerare PLGA dissoluzione. </li><li> Unire 200 ml di soluzione proteica e 4 ml di soluzione di PVA 2%. Versare la miscela proteica nella soluzione PLGA (punto 1.4). Le soluzioni rimarranno per lo più separati. </li><li> Posizionare il tubo in un bicchiere di acqua ghiacciata. Utilizzando un sonicatore bacchetta a ~ 10 Watt (RMS), agitare la soluzione per alcuni secondi (5-10) fino a una crema uniforme emulsione bianco è creato. </li><li> Versare l&#39;emulsione nella provetta da 50 ml contenente 0,5% di PVA (passo 1.3). Mescolare la soluzione ad alta velocità su un vortex per ~ 20 sec. La soluzione svilupperà un aspetto torbido. </li><li> Trasferire l&#39;emulsione in un becher da 200 ml e posto su una piastra di agitazione a 350 rpm per 2 min. Aggiungere 50 ml di 2% di alcool isopropilico per il bicchiere sul piatto mescolare. Lasciare il composto per continuare a mescolare per un minimo di 1 ora per consentire al DCM evaporare e il PLGA per indurire. </li><li> Trasferimento tegli microsfere soluzione in provette da centrifuga. </li><li> Centrifugare a 425 xg per 3 min. Le microsfere si raccoglieranno nella parte inferiore del tubo e appaiono bianco. Rimuovere con attenzione il surnatante dal tubo, sopra le microsfere, e conservare in una bottiglia da 500 ml. </li><li> Sciacquare le microsfere con acqua deionizzata riempiendo il tubo di tre quarti pieno e scuotendola di ridistribuire le microsfere nel liquido. </li><li> Ripetere i punti 1.10 e 1.11 quattro volte. </li><li> Dopo l&#39;ultimo risciacquo, rimuovere il supernatante di nuovo e posto in bottiglia da 500 ml con altri campioni. Congelare le microsfere raccolti nella provetta da centrifuga, poi liofilizzare per almeno 24 ore. </li><li> Visualizza le microsfere al microscopio ottico o con un microscopio elettronico a scansione. Microsfere non più grandi di 60 micron sono per electrospinning efficaci. Se microsfere sono troppo grandi, sonicating o vortexare tempi più lunghi possono essere richiesti al punto 1.6 o 1.7. </li> &lt;li&gt; Conservare le microsfere secche in un -20 ° C freezer. </li><li> Opzionale: Utilizzare un saggio di proteine, per istruzioni del produttore, per testare la quantità di proteine ​​in bottiglia da 500 ml dal punto 1.10 30. Questo è utilizzato per calcolare la percentuale di proteine ​​incapsulato in microsfere, sottraendo la quantità di soluzione da ciò che è stato utilizzato nel processo di produzione. </li></ol> Nota: Per visualizzare la posizione proteina nel microsfere aggiungere Rodamina 2 mg / ml per la soluzione di PLGA 31 e incapsulare una proteina coniugato con FITC Figura 1 mostra un esempio.. 2 Electrospinning con microsfere <ol><li> Prima di preparare la soluzione elettrospinning, creare un 0,5% w / v soluzione di fotoiniziatore, in acqua deionizzata sciogliendo a 37 ° C. Questo processo può richiedere diverse ore. </li><li> Creare un 2% w / v metacrilato acido ialuronico (Meha) (vedi Burdick et al. Per la sintesi) il 29, 3%w / v 900 kD poli (ossido di etilene) (PEO) e 0.05% w / v soluzione fotoiniziatore in acqua deionizzata. <ol><li> Calcolare la quantità corretta di Meha e PEO per il volume desiderato. Per esempio, 10 ml di soluzione richiede elettrospinning 200 mg di Meha e 300 mg di PEO. </li><li> Sciogliere il PEO in acqua deionizzata al 90% del volume finale desiderato (9 ml per questo esempio). Questo può richiedere diverse ore, un piatto mescolare riscaldato o bagnomaria a 37 ° C possono essere utilizzati per accelerare il processo. </li><li> Successivamente aggiungere il Meha e utilizzare un miscelatore vortex per mescolare la soluzione fino a chiaro. Questo richiederà solo pochi minuti. </li><li> Infine aggiungere la soluzione fotoiniziatore 0,5% ad occupare il restante 10% del volume (1 ml per questo esempio). </li></ol></li><li> Aggiungere microsfere alla concentrazione desiderata fino a 400 mg / ml. Miscelare la soluzione su un vortex fino a quando le microsfere sono distribuiti uniformemente nella soluzione. </li><li> Trasferire la soluzione in una siringa e attaccare un 6 pollici bl 18 gaugeunt ago punta. </li><li> Posizionare la siringa in una pompa a siringa e impostarlo per dispensare a 1,2 ml / h. </li><li> Nastro uno strato di foglio di alluminio sul piatto di raccolta o mandrino. Questo permette una facile pulizia e conservazione del patibolo finito. Un mandrino rotante viene utilizzato per creare fibre allineate. Una lastra piana o mandrino fermo si tradurrà in fibre disposte in modo casuale. </li><li> Collegare il filo di terra da una fonte di alimentazione ad alta tensione per l&#39;apparato di raccolta. Collegare il conduttore positivo al ago. </li><li> Regolare la superficie della pompa siringa e la raccolta in modo che vi è di 15 cm tra la punta dell&#39;ago e la superficie di raccolta. </li><li> Avviare il pompaggio polimero, quando la soluzione è visibile alla fine della siringa, attivare il generatore di tensione e impostare la tensione di 24 kV. ATTENZIONE: Quando la tensione è acceso non toccare alcuna parte metallica del sistema. Carica può anche saltare brevi distanze dalle parti elettrificate per la pelle. </li><li> Eseguire la soluzione fino a dspessore impalcatura esired è raggiunto. Al termine spegnere fonte di tensione e pompa a siringa. </li><li> Rimuovere la pellicola con ponteggio allegato. Ponteggi completate contenenti proteine ​​vengono memorizzati in una -20 ° C freezer. </li></ol> 3. proteine ​​Bioattività Testing <ol><li> Preparare delle cellule di coltura. Aggiungere 10% v / v siero fetale bovino, 1% v / v L-glutammina, e 1% v / v penicillina-streptomicina per mezzo di Eagle modificato di Dulbecco. </li><li> Selezionare i vetrini che si adattano completamente in una piastra ben. </li><li> Utilizzare 3 (Trimethoxysilyl) propil metacrilato per trattare i coprioggetti come descritto dal produttore. Methacrylation migliora patibolo aderenza ai coprioggetti. </li><li> Fissare coprioggetti metacrilato alla zona di raccolta del electrospinner con nastro biadesivo rimovibile prima elettrospinning. Spinning sui coprioggetti facilita la gestione e la visualizzazione. </li><li> Electrospin di spessore desiderato come descritto sopra. </li><li> Laopo Electrospinning rimuovere con attenzione coprioggetto da mandrino. Posizionare il patibolo vetrini rivestiti in una camera di azoto chiaro e assicurarsi che tutto l&#39;ossigeno viene eliminato. </li><li> Posizionare la camera e il patibolo sotto di 10 mW / cm 2 365 nm luce per 15 min. Dopo la reticolazione posto in pozzetti di dimensioni appropriate. Assicurarsi che il lato impalcatura è rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Luogo ponteggi sotto una lampada germicida per 30 minuti per sterilizzare. Se fibronectina desiderato o altra proteina viene utilizzato come rivestimento per migliorare l&#39;adesione cellulare. Seguire le istruzioni del produttore per ponteggi cappotto. </li><li> Raccolta dei gangli dorsali (DRG) come precedentemente descritto da Hollenbeck 32. Sarà necessario One DRG per ogni ponteggio coperto coprioggetto testato. </li><li> Mettere 100-200 ml di media su ogni patibolo nella piastra ben. Posizionare con cura un DRG su ogni patibolo nel droplet media. Per ponteggio di spessore possono essere necessari più mezzi di comunicazione; DRG devono essere completamente sommerse e non FLOATing. </li><li> Incubare l&#39;impalcatura e DRG a 37 ° C per 4 ore per permettere alla cellula di aderire al ponteggio. </li><li> Riempire i media a livello appropriato per il bene e mettere di nuovo in incubatrice. Continuare l&#39;incubazione per 4-6 giorni. </li><li> Dopo il periodo di incubazione, rimuovere con attenzione i media di ogni bene e lavare delicatamente una volta con PBS. Fissare le cellule per 30 minuti con 4% w / v paraformaldeide. </li><li> Cellule macchia con una macchia anticorpo per neurofilamenti. Questo permetterà la visualizzazione di crescita dei neuriti per la quantificazione. DAPI può anche essere utilizzato per visualizzare nuclei delle cellule. Un esempio di protocollo di colorazione è stato descritto da Sundararaghavan e colleghi 14. </li><li> Visualizza le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza. <ol><li> Posizionare pozzetti sul palco del microscopio. </li><li> Individuare la massa cellulare utilizzando le impostazioni del filtro e di eccitazione per DAPI. </li><li> Una volta che la cellula è passare il filtro FITC per visualizzare le neuriti estesi. Ucantare la funzione di punto sul microscopio raccogliere e combinare le immagini che necessario per vedere l&#39;intera struttura. Ripetere l&#39;operazione per DAPI, FITC e campo chiaro. </li></ol></li></ol>

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<li>Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+growth+factor+loaded+microspheres+into+polymeric+electrospun+nanofibers+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+proteins+in+poly%28L-lactide-co-caprolactone%29+fibers+by+emulsion+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).</li>
<li>Wang, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+aligned+core-shell+nanofibres+delivering+NGF+on+the+promotion+of+sciatic+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomater+Sci+Polym+Ed%22%5BJournal%5D)">The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).</li>
<li>Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+regeneration+using+composite+poly%28lactic+acid-caprolactone%29%2Fnerve+growth+factor+conduits+prepared+by+coaxial+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning.</a> J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Molti studi hanno dimostrato che le cellule nervose possono essere diretti da stimoli topografici (allineamento della fibra) e segnali chimici (fattori di crescita) 1,2,10,11,35. Electrospinning è un metodo facile per creare fibre allineate. I fattori di crescita favoriscono la crescita dei nervi, ma al fine di includerli in condotti nervose (NC), è necessario un metodo per rilascio prolungato. Per creare un sistema più robusto con entrambi i segnali, questi due segnali devono essere combinati. Diversi metodi...

Una delle sfide in corso in ingegneria dei tessuti neurali è la creazione di un condotto del nervo (NC) che imita la matrice extracellulare, dove i nervi crescono naturalmente. La ricerca ha dimostrato che le cellule rispondono a diversi fattori nel loro ambiente, tra cui meccanica, topografico, adesivi e segnali chimici 1-3. Una delle sfide principali in questo settore sta determinando la combinazione appropriata di segnali e fabbricando un sistema in grado di mantenere spunti per un lungo periodo per sostenere la crescita delle cellule 4. Neuroni periferici sono noti a preferire un substrato morbido, diretto da fibre allineate e rispondere agli fattore di crescita nervoso (NGF) 5-7. NC che può fornire segnali chimici per settimane hanno dimostrato di fornire una migliore recupero funzionale più vicina a quella di allotrapianti, il gold standard attuale per la riparazione dei nervi 8,9. Materiali e metodi di produzione Diversi possono essere utilizzati per produrre meccanica e topograficoAl spunti 10-13. Spunti meccanici sono inerenti al materiale scelto, rendendo la selezione del materiale appropriato per l&#39;applicazione critica 1,13. I metodi di produzione per il controllo spunti topografiche includono la separazione di fase, auto-assemblaggio e elettrospinning 1,13. Per le applicazioni microscala, microfluidica, photopatterning, incisione, liscivie sale, o schiume a gas può essere utilizzato anche 14-17. Electrospinning è emerso come il modo più popolare per progettare substrati fibrosi per coltura di tessuti grazie alla sua flessibilità e facilità di produzione 13,18-23. Nanofibre elettrofilate sono fabbricati applicando una tensione elevata ad una soluzione polimerica inducendolo a respingere se stessa e si estendono attraverso una breve distanza per scaricare 24. Un ponteggio allineato può essere creato raccogliendo le fibre su un mandrino rotante a terra e ponteggi non allineati sono raccolti su una piastra fissa 25. Segnalazione di adesione può essere ottenuto rivestendo il ponteggio spirito fibrosoh fibronectina o coniugare un peptide adesione, come RGD, per la prima HA elettrospinning 26. Segnali chimici, come i fattori di crescita, sono i più difficili da mantenere per lunghi periodi perché hanno bisogno di una fonte per il rilascio controllato. Molti sistemi sono stati tentato di aggiungere rilascio controllato a reti fibrosi elettrofilate con vari livelli di successo. Questi metodi comprendono miscela elettrofilatura, emulsione elettrofilatura, core shell elettrofilatura e proteine ​​coniugazione 27. Inoltre, elettrofilatura è tradizionalmente fatto in un solvente volatile, che può influenzare la vitalità della proteina 28, quindi mantenendo bioattività delle proteine ​​deve essere considerato. Questo approccio affronta specificamente che combina,, segnali chimici e adesivi topografici meccaniche per creare un&#39;impalcatura sintonizzabile per la crescita dei nervi periferici. Meccanica impalcatura è controllata proprio dalla sintesimetacrilato acido ialuronico (HA). I siti methacrylation vengono utilizzati per collegare foto reticolanti reattivi. Il materiale reticolato non è solubile in acqua ed è suddiviso esclusivamente dagli enzimi 29. La quantità di reticolazione cambia la velocità di degradazione, meccanica ed altre proprietà fisiche del materiale. Utilizzo di HA con il 30% methacrylation, che ha un modulo di elasticità di ~ 500 Pa, crea un substrato morbido che è vicino alla meccanica nativi di tessuto neurale ed è in genere preferito dai neuroni 26,29. Electrospinning su un mandrino rotante viene utilizzato per creare fibre allineate per una stecca topografica. Utilizzando elettrofilatura con microsfere fornisce segnali chimici all&#39;interno del ponteggio per periodi prolungati. Per supportare microsfere di crescita dei neuriti contenenti NGF sono utilizzati per creare il segnale chimico. Diversamente dalla maggior parte dei materiali elettrofilate HA è solubile in acqua in modo che il NGF non incontra solventi aggressivi durante la produzione. Per aggiungere un segnale di adesivo, la scaffold è rivestito con fibronectina. Il sistema completo contiene tutti e quattro i tipi di segnali sopra descritti: morbide (meccanici) allineati (topografiche) fibre con NGF rilascio microsfere (chimica) rivestito con fibronectina (adesivo). Produzione e collaudo di questo sistema è descritto in questo protocollo. Il processo inizia con la produzione delle microsfere con acqua-in-olio-in-acqua doppia emulsione. L&#39;emulsione è stabilizzato con un tensioattivo, alcool polivinilico (PVA). La fase acquosa interna contiene la proteina. Come è aggiunto alla fase olio, contenente il materiale delle coperture PLGA disciolto in diclorometano (DCM), il tensioattivo crea una barriera tra le fasi che proteggono la proteina dal DCM. Questa emulsione è più dispersa in un&#39;altra fase acquosa contenente PVA per creare la superficie esterna delle microsfere. L&#39;emulsione stabile viene agitata per consentire al DCM evaporare. Dopo il risciacquo e liofilizzazione si sono lasciati con la microsfere cont seccoaining proteina. Dopo le microsfere sono completati sono pronti per essere elettrofilate in ponteggi. Per prima cosa preparate la soluzione electrospinning. La viscosità della soluzione è fondamentale per la formazione di fibre corretta. Soluzioni di puro HA non soddisfano questo requisito; PEO viene aggiunto come un polimero portante per consentire electrospinning. Le microsfere vengono aggiunti alla soluzione e elettrofilate conseguente un&#39;impalcatura fibrosa con microsfere distribuiti. Una volta che la produzione è completa, la proteina deve essere testato per verificarne la fattibilità. A tale scopo, una cellula primaria che risponde a NGF può essere utilizzato. Questo protocollo utilizza dei gangli dorsali (DRG) 8-10 giorni antichi embrioni di pollo. I fasci di cellule vengono seminate su scaffold contenenti microsfere riempite di NGF o quelli che sono vuoti. Se il NGF è ancora vitale si dovrebbe vedere una maggiore crescita dei neuriti sui ponteggi contenenti NGF. Se il NGF non è più praticabile lo faràNon promuovere neuriti per estendere e dovrebbe apparire simile al controllo. La procedura esatta qui descritta è focalizzata sul sostegno neurale, però, con semplici modifiche al materiale, metodo elettrospinning e proteine ​​del sistema può essere ottimizzato per i vari tipi di cellule e tessuti.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF</td><td>24650-42-8</td><td>Proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>PEO 900 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>189456</td><td></td></tr><tr><td>Metacrilossail tiocarbamil rodamina B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23591-100</td><td>Preparare la soluzione madre nella</td></tr><tr><td>pompa a siringa</td> DMSO <td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>Fonte di alimentazione</td><td>Gamma High Voltage</td><td>ES30P-5W</td><td></td></tr><tr><td>Motor</td><td>Triem Electric Motors, Inc</td><td>0132022-15</td><td>Deve essere collegato a un mandrino personalizzato</td></tr><tr><td>Tachimetro</td><td>Magazzino strumenti di rete</td><td>ESI-330</td><td>Utilizzare per monitorare la velocità</td></tr> <tr><td>del mandrinoOmnicure UV Spot Cure System con adattatore di collimazione</td><td>EXFO</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>Aghi</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-825-16H</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Alcool polivinilico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isoporopilico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>BSA-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>080M7400</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Fattore di crescita nervoso (NGF)</td><td>R& D Systems</td><td>1156-NG</td><td></td></tr><tr><td>65:35 Acido polilattico-glicolico (PLGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001554270</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34856-2L</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Dosaggio delle proteine</td><td>Thermo Scientific</td><td>1856209</td><td></td></tr><tr><td>3-(Trimetossisilil)metacrilato di propile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001558456</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Fisher Scientific</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

electrospinning growth factor releasing microsfere in fibrosi ponteggi

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Questa procedura descrive un metodo per fabbricare un substrato multiforme per dirigere la crescita delle cellule nervose. Questo sistema incorpora segnali meccanici, topografici, adesivi e chimici. Le proprietà meccaniche sono controllate dal tipo di materiale utilizzato per fabbricare le fibre elettrofilate. In questo protocollo utilizziamo il 30% di acido ialuronico metacrilato (HA), che ha un modulo di trazione di ~500 Pa, per produrre un'impalcatura fibrosa morbida. L'elettrofilatura su un mandrino rotante produce fibre allineate per creare un segnale topografico. L'adesione si ottiene rivestendo l'impalcatura con fibronectina. La sfida principale qui affrontata è fornire un segnale chimico in tutta la profondità dell'impalcatura per periodi prolungati. Questa procedura descrive la fabbricazione di microsfere di acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA) che contengono il fattore di crescita nervoso (NGF) e l'impregnazione diretta dell'impalcatura con queste microsfere durante il processo di elettrofilatura. A causa dell'ambiente di produzione difficile, comprese le elevate forze e le cariche elettriche, la vitalità delle proteine viene misurata dopo la produzione. Il sistema fornisce il rilascio di proteine per oltre 60 giorni e ha dimostrato di promuovere la crescita delle cellule nervose primarie.

Microsfere 50 ± 14 micron di diametro, con un incapsulamento di proteine ​​oltre l&#39;85% sono stati costantemente prodotto e elettrofilate in ponteggi. Dimensione è stata determinata mediante l&#39;imaging campioni di microsfere da tre lotti di produzione separate. Le immagini catturate in cui su un microscopio ottico e lunghezze dove misurata utilizzando software laboratorio commerciale. Figura 1 mostra un istogramma della distribuzione dimensionale. Tasso di incapsulamento è stato testato anche da t...

Questo protocollo combina elettrofilatura e microsfere per sviluppare scaffold di ingegneria tissutale per dirigere i neuroni. Il fattore di crescita nervoso è stato incapsulato all'interno di microsfere di PLGA e elettrofilato in scaffold fibrosi di acido ialuronico (HA). La bioattività della proteina è stata testata seminando gli scaffold con i gangli della radice dorsale del pulcino primario e coltivandoli per 4-6 giorni.

Electrospinning Growth Factor Releasing Microsfere in Fibrosi Ponteggi

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare un ambiente multifunzionale atto a sostenere la crescita e la riparazione del nervo. Ciò viene ottenuto innanzitutto incapsulando fattori di crescita all'interno di microsfere degradabili. Il secondo passaggio consiste nel preparare il materiale di sostegno per la maggior parte dell'ambiente.Successivamente, le microsfere e il materiale di supporto vengono combinati ed elettrofilati in un impalcatura fibrosa allineata. L'ultimo passaggio consiste nel testare l'impalcatura con neuroni del ganglio radicolare dorsale di pollo. Infine, la microscopia a immunofluorescenza viene utilizzata per dimostrare che la crescita e la direzione dei neuriti sono accelerate rispetto ai controlli.Sebbene questo sistema sia progettato per il tessuto nervoso, con lievi modifiche alle proteine e ai materiali utilizzati, potrebbe essere applicato anche a diversi tipi di tessuto, tra cui cuore, polmoni e osso. Prima di iniziare questa procedura, preparare i reagenti necessari: soluzioni al 2% e allo 0,5% peso per volume di alcol polivinilico o PVA in acqua deionizzata, una soluzione al 2% volume per volume di alcol isopropilico e acqua deionizzata, e una soluzione acquosa della proteina idrofila desiderata. Versare 40 millilitri della soluzione allo 0,5% di PVA in un tubo da centrifuga da 50 millilitri e metterlo da parte. In un piccolo vial, sciogliere 300 milligrammi di acido polilattico-co-glicolico 65 a 35 o PLGA e tre millilitri di diclorometano.Un agitatore vortex può essere utilizzato per accelerare la dissoluzione del PLGA combinando 200 microlitri di soluzione proteica e quattro microlitri di soluzione di PVA al 2%. Versare la miscela proteica di PVA nella soluzione di PLGA. Le soluzioni rimarranno per lo più separate.Posizionare il vial in un becher contenente acqua ghiacciata utilizzando un W ator a circa 10 watt, agitare la soluzione per cinque-dieci secondi fino a ottenere un'emulsione uniforme di colore bianco crema. Versare l'emulsione nel tubo da 50 millilitri precedentemente preparato contenente PVA 0,5%. Mescolare la soluzione a velocità elevata con un agitatore vortex per circa 20 secondi.La soluzione assumerà un aspetto torbido. Trasferire l'emulsione in un becher da 200 millilitri e posizionarlo su un agitatore magnetico a 350 giri al minuto per due minuti. Aggiungere 50 millilitri di alcol isopropilico al 2% nel becher posto sull'agitatore magnetico.Lasciare mescolare la miscela per almeno un'ora, in modo che il clorometano evapori e il PLGA si indurisca. Successivamente, trasferire la soluzione di microsfere in provette da centrifuga e centrifugare a 425 volte G per tre minuti. Le microsfere si raccoglieranno sul fondo della provetta e appariranno bianche. Rimuovere con attenzione il soprannatante presente sopra le microsfere e conservarlo in una bottiglia da 500 millilitri.Risciacquare le microsfere con acqua deionizzata riempiendo ogni provetta per tre quarti e agitandola per ridistribuire le microsfere nel liquido. Ripetere la centrifugazione, la rimozione del soprannatante e il risciacquo delle microsfere con acqua deionizzata quattro volte dopo l'ultimo risciacquo. Rimuovere il soprannatante e collocarlo nella bottiglia da 500 millilitri insieme agli altri campioni.Congelare le microsfere raccolte nei tubi da centrifuga a meno 20 gradi Celsius durante la notte, quindi liofilizzare per almeno 24 ore. La seguente soluzione per elettrofilatura deve essere preparata in anticipo in acqua deionizzata: 2% in peso su volume di acido ialuronico metilato o miha, 3% in peso su volume di poliossido di etilene o PEO da 900 chilodalton e 0,05% in peso su volume di soluzione di iniziatori fotochimici.Dopo aver preparato il volume desiderato di soluzione per l'elettrofilatura, aggiungere microsfere alla concentrazione desiderata fino a 400 milligrammi per millilitro. Mescolare la soluzione con un agitatore vortex fino a quando le microsfere non sono distribuite uniformemente nella soluzione. Trasferire la soluzione in una siringa e fissare un ago da 18 gauge a punta smussata lungo sei pollici.Posizionare la siringa in una pompa per siringhe e impostarla in modo da erogare 1,2 millilitri all'ora. Applicare un strato di carta d'alluminio sul mandrino. Questo permette una facile pulizia e conservazione dell'impalcatura finita.Un mandrino rotante viene utilizzato per creare fibre allineate. Collegare il cavo di messa a terra di una fonte di alimentazione ad alta tensione all'apparato di raccolta. Collegare il cavo positivo all'ago per garantire un'elettrofilatura riuscita.È molto importante verificare che tutte le connessioni e le impostazioni siano corrette. Avviare la pompa del polimero e, quando la soluzione è visibile all'estremità della siringa, accendere la sorgente di tensione e impostare la tensione a 24 kilovolt. Far scorrere la soluzione fino al raggiungimento dello spessore desiderato dello scaffold.Una volta completato, spegnere la fonte di tensione e la pompa per siringa. Per iniziare questa procedura, fissare i coperchi di vetro all'area di raccolta dell'elettrofilatore utilizzando nastro adesivo doppio e rimovibile prima dell'elettrofilatura. Filare direttamente sui coperchi di vetro facilita la manipolazione e l'osservazione successiva all'elettrofilatura fino allo spessore desiderato.Come dimostrato nel segmento video precedente, rimuovere con attenzione le lamelle dal mandrino. Posizionare le lamelle rivestite con l'impalcatura (scaffold) in una camera trasparente di azoto e assicurarsi che tutto l'ossigeno sia rimosso. Sottoporre la camera e l'impalcatura a una luce di 10 milliwatt per centimetro quadrato a 365 nanometri per 15 minuti.Dopo il cross-linking, posizionare i coverslip in una piastra a pozzetti di dimensioni adeguate. Assicurarsi che il lato della struttura portante sia rivolto verso l'alto. Aggiungere da 100 a 200 microlitri di mezzo su ciascuna struttura portante nella piastra a pozzetti. Con attenzione.Posizionare un ganglio della radice dorsale o DRG su ciascun scaffold nella goccia di mezzo. Per uno scaffold spesso, potrebbe essere necessario più mezzo. Il DRG deve essere completamente immerso e non galleggiare.Incubare l'impalcatura e il ganglio della radice dorsale a 37 gradi Celsius per quattro ore per consentire alle cellule di aderire all'impalcatura. Successivamente, aggiungere il mezzo fino al livello appropriato per la pozzetta. Reintrodurre la piastra nell'incubatore e incubare per quattro-sei giorni successivamente al periodo di incubazione.Rimuovere con attenzione il mezzo da ogni pozzetto e lavare delicatamente una volta con PBS. Fissare le cellule per 30 minuti utilizzando paraformaldeide al 4% peso per volume. Successivamente, colorare le cellule per i neurofilamenti e i nuclei seguendo un protocollo stabilito.Per visualizzare le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza, posizionare la piastra a pozzetti sul portapreparati del microscopio e individuare la massa cellulare utilizzando i parametri del filtro e di eccitazione per dpi. Una volta identificata la cellula, passare al filtro zi. Per visualizzare i neuriti estesi, utilizzare la funzione di assemblaggio (stitch) del microscopio per acquisire e combinare tutte le immagini necessarie per osservare l'intera struttura.Ripetere per dpi, fite e microsfere in campo chiaro. Questo protocollo ha prodotto in modo costante microsfere di diametro pari a 50 più o meno 14 micrometri con un'incapsulamento proteico superiore all'85% e le ha elettrofilate in impalcature. Questa immagine fluorescente mostra microsfere rappresentative con Rodamina nella guaina di PLGA e BSA incapsulata all'interno.Per valutare l'incapsulamento, le microsfere sono state riempite con BSA e sottoposte a test per il rilascio di proteine per oltre 60 giorni mediante saggio proteico di Bradford. Il rilascio inizia con un picco iniziale e prosegue poi con la degradazione delle microsfere dopo l'elettrofilatura. Le microsfere sono visibili in tutta la struttura fibrosa tridimensionale.In questa immagine al microscopio elettronico a scansione (SEM) dell'intero scaffold. Le sfere possono essere osservate in più strati, indicati dalle frecce. Questa immagine ad alta magnificazione mostra una microsfera con le nano-fibre dello scaffold sovrastante.I gangli della radice dorsale o DRG sono stati utilizzati per verificare la vitalità del fattore di crescita nervoso o NGF all'interno delle microsfere presenti nello scaffold. Qui si osservano dei DRG posizionati su uno scaffold contenente microsfere. Quelle caricate con NGF sono affiancate a microsfere prive di proteina; le estensioni di neuriti più lunghe che si sviluppano dal DRG sullo scaffold con NGF indicano che l'NGF è vitale e in grado di promuovere la crescita.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come incapsulare le proteine in microsfere e incorporarle in impalcature fibrose.

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Il processo di electrospinning polimeri per l'ingegneria tissutale e colture cellulari è affrontato in questo articolo. In particolare, il electrospinning di macromers fotoreattivo con capacità di elaborazione aggiuntive di photopatterning e multi-polimero electrospinning è descritto.

Electrospinning Ponteggi polimeri fibrosi per l&#39;ingegneria tissutale e colture cellulari

Allineati fibre elettrofilate diretta la crescita dei neuroni in vitro e sono una componente potenziale di ponteggi rigenerazione nervosa. Abbiamo descritto una procedura per la preparazione di substrati di fibre elettrofilate e il siero senza cultura di primaria ratto E15 sensoriali (DRG) e neuroni motori. Visualizzazione dei neuroni mediante immunocitochimica è anche incluso.

La cultura del motore principale e neuroni sensoriali in Media definiti in elettrofilate Poli-L-lactide Ponteggi nanofibre

Ponteggi elettrofilate possono essere trattati post-produzione per applicazioni di ingegneria tissutale. Qui si descrivono i metodi per la filatura ponteggi complessi (da spinning consecutivi), per rendere più spessi (da ponteggi multi-layering che utilizza il calore o vapore ricottura), per ottenere la sterilità (produzione asettica o di post produzione la sterilizzazione) e per il raggiungimento di adeguate proprietà biomeccaniche.

Elaborazione Postproduzione di fibre elettrofilate per l&#39;ingegneria tissutale

Biocompatibili pH reattivo nanosensori sol-gel possono essere incorporati in poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) ponteggi elettrofilate. Le impalcature self-reporting prodotti possono essere utilizzati per il monitoraggio in situ delle condizioni microambientali mentre coltura di cellule sul patibolo. Questo è vantaggioso in quanto il costrutto cellulare 3D può essere monitorato in tempo reale senza disturbare l'esperimento.

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Un metodo per ottenere nanofibre e nanostrutture complesse da proteine ​​singole o multiple della matrice extracellulare è descritto. Questo metodo utilizza interazioni proteina-superficie per creare materiali a base di proteine-free-standing con la composizione sintonizzabile e l'architettura per l'uso in una vasta gamma di applicazioni di ingegneria tissutale e delle biotecnologie.

Nanofibre ECM proteine ​​e Nanostrutture Engineered Uso Assembly-Surface avviato

È stata riportata la sintesi e la fabbricazione di fibre lunghe elettrofilate coprono un'area più grande deposito tramite un collettore di nuova concezione da un polimero biodegradabile romanzo chiamato poli (glicerolo-dodecanoato) (PGD). Le fibre sono in grado di sostenere la crescita di cellule derivate da cellule staminali pluripotenti di topo.

Elettrofilate Fibrosa Ponteggi di Poli (glicerolo-dodecanedioate) per l&#39;ingegneria neurale tessuti da cellule staminali embrionali di topo

Qui, vi presentiamo un protocollo per fabbricare scaffold elettrofilate nanofibre con organizzazione sfumati di fibre e di esplorare le loro applicazioni nella regolazione della morfologia delle cellule / orientamento. Gradienti per quanto riguarda le proprietà fisiche e chimiche dei ponteggi nanofibre offrono un'ampia varietà di applicazioni in campo biomedico.

Elettrofilate nanofibre Ponteggi con gradazioni Organizzazione Fiber

I progressi nelle tecnologie dei biomateriali consentono lo sviluppo di costrutti tridimensionali di tipo multicellulare. Abbiamo sviluppato protocolli di elettrofilatura per produrre tre scaffold individuali per coltivare le principali cellule strutturali delle vie aeree per fornire un modello 3D in vitro della parete dei bronchioli delle vie aeree.

Adattamento del processo Electrospinning per fornire tre ambienti unici per un Tri-livello<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello della parete delle vie aeree

Questo protocollo serve come una guida di riferimento completa per fabbricare impalcature tramite elettrofilatura con il polimero si scioglie in una modalità di scrittura diretta. Abbiamo sistematicamente delineare il processo e definire le impostazioni di parametro appropriato per la realizzazione di architetture di impalcatura mirati.

Sciogliere elettrofilatura scrittura di scaffold tridimensionale Poly(ε-caprolactone) con morfologie controllabile per applicazioni di ingegneria del tessuto

In questo articolo viene illustrata la tecnica di espansione una stuoia di nanofibra tradizionale, due dimensioni (2D) elettrofilate in un'impalcatura di tre dimensioni (3D) attraverso la depressurizzazione del sottocritico CO2 fluido. Queste impalcature aumentate 3D, strettamente mimica cellulare nanotopographic spunti e preservare le funzioni delle molecole biologiche incapsulati all'interno delle nanofibre.

Espansione del due-dimensione elettrofilate nanofibre in tre dimensioni ponteggi

Scopri come creare scaffold fibrosi allineati con elettrofilatura e microsfere PLGA per il rilascio controllato di fattori di crescita nervosi. Questo metodo supporta la crescita direzionale dei neuriti nei gangli delle radici dorsali di pollo.

Electrospinning Growth Factor Releasing Microsfere in Fibrosi Ponteggi

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