Sottotipo-selettivo elettroporazione della corticale interneuroni
18 agosto 2014
Questa procedura mostra come indirizzare gli interneuroni nel prosencefalo del topo in via di sviluppo per mezzo dell'elettroporazione in utero. Questa tecnica è stata particolarmente efficace per ottenere l'espressione genica selettiva nei sottotipi di interneuroni destinati agli strati superficiali della corteccia.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indirizzare i neuroni interni nel cervello del topo in via di sviluppo mediante elettroporazione in utero. Questo viene realizzato innanzitutto preparando gli aghi per l'iniezione. Il secondo passaggio consiste nel rimuovere la catena embrionale dall'animale anestetizzato.
Successivamente, viene effettuata l'iniezione di DNA ed elettroporazione nel cervello. L'ultimo passaggio consiste nel permettere all'animale di riprendersi dall'intervento chirurgico. In definitiva, l'elettroporazione in utero viene utilizzata per consentire il targeting selettivo di sottotipi di interneuroni.
Il vantaggio di questi metodi rispetto alle tecniche esistenti, come l'elettroporazione in utero non specifica, è che forniscono i mezzi per eseguire un'analisi autonoma cellulare di un sottoinsieme di interneuroni corticali. I livelli elevati di espressione di GFP permettono la visualizzazione e l'analisi di singoli interneuroni. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo neurologico, ad esempio quali sono le regole che governano l'integrazione degli interneuroni in maturazione.
Per iniziare questa procedura, preparare la pipetta per microiniezione tirando una capillare di vetro con un estrattore di pipette. Successivamente, rimuovere con attenzione la capillare e raccogliere l'ago inferiore per la microiniezione. Ora, posizionare un topo gravido anestetizzato con il lato ventrale rivolto verso l'alto sul tappetino riscaldante.
Coprire le vie aeree con una maschera che continuerà a fornire isoflurano durante l'intervento chirurgico. Applicare quindi un lubrificante oculare su entrambi gli occhi. Impostare il tappetino riscaldante a 36 gradi Celsius per prevenire l'ipotermia successivamente.
Verificare l'assenza di riflessi plantari e caudali pizzicando le zampe posteriori o la coda. Successivamente, detergere la cute dell'addome con etanolo al 70%. Utilizzare una pinza per sollevare la cute verso l'alto.
Quindi effettuare un piccolo incisione verticale di due centimetri lungo la linea mediana, a partire dal punto intermedio tra la terza e la quarta coppia di ghiandole mammarie. Avere cura di non danneggiare la parete addominale utilizzando pinze rotonde. Tirare delicatamente la catena embrionale lontano dalla cavità.
Lasciare la catena appoggiata sulle salviette umidificate. Iniziare esponendo una metà dell'utero, quindi procedere all'elettroporazione degli embrioni prima di passare all'altra metà.
In questo procedimento, preparare una soluzione di DNA sciogliendo il pellet ottenuto da un protocollo standard di purificazione con maxi prep in acqua distillata. Successivamente, aggiungere il fast green alla soluzione di DNA in un rapporto di uno a venti per consentire la visualizzazione durante l'iniezione. Quindi, tagliare la punta di una micropipetta pre-trazionata con pinzette fini, lasciando sei millimetri dalla fine della spalla all'estremità della punta.
Successivamente, caricare la micropipetta con un microlitro di soluzione di DNA contenente verde brillante per l'iniezione. Trattenere la testa dell'embrione con pinzette rotonde. Inserire la pipetta nel cervello con un angolo di 45 gradi, puntando verso il ventricolo laterale situato vicino alla linea mediana.
Se l'ago penetra attraverso il ventricolo, ritirare lentamente la pipetta. Il ventricolo dovrebbe diventare verde quando la soluzione inizia a riempirlo. A questo punto, fermare il movimento della pipetta ed iniettare un microlitro di DNA.
Quindi ritirare delicatamente la pipetta. Impostare l'ECM eight 30 ator su impulsi di 5 45 volt della durata di 50 millisecondi, intervallati da un intervallo inter-impulso di 950 millisecondi. Immergere gli elettrodi a paletta da cinque millimetri in PBS per garantire una trasmissione efficiente della corrente.
Quindi posizionare le palette dell'elettrodo attorno alla testa dell'embrione con una paletta positiva sul ventricolo contenente la soluzione di DNA. Posizionare la paletta positiva leggermente più in basso rispetto a quella negativa per creare una corrente ventrale attraverso le eminenze gangliari. Questo ridurrà al minimo l'espressione ectopica nelle cellule parametali.
Ora erogare un impulso premendo una volta il pedale, quindi rimuovere gli elettrodi e pulirli. Ripetere i passaggi per ciascuno degli embrioni. Dopo aver elettroporato tutti gli embrioni.
Versare tre millilitri di PBS nella cavità addominale e reinserire gli embrioni nella cavità addominale. Successivamente, suturare la parete addominale con un ago curvo e sutura di seta 5-0, quindi suturare la cute. Applicare lidocaina sulla ferita e somministrare inizialmente 120 milligrammi per chilogrammo di aspirina per l'analgesia.
Rimuovere l'animale dal tubo dell'anestesia e lasciarlo riprendere su un asciugatore di carta posto sul tappetino riscaldante. Successivamente, restituire l'animale alla gabbia. Mantenerlo sul tappetino riscaldante a 37 gradi Celsius e monitorare lo stato di salute.
In questo esperimento, i neuroni intercalati elettroporati sono delineati dall'espressione di marcatori del sottotipo derivati dal CGE. Questa immagine mostra che i neuroni intercalati derivati dal CGE sono stati elettroporati con un plasmide DLX5/6-EGFP. Questa immagine mostra un neurone intercalato che esprime VIP a P8.
L'espressione di EGFP delinea l'intero albero dendritico e l'arborizzazione assonica di singoli neuroni, e qui è mostrato un interneurone esprimente NPY a P8. L'espressione di NP y delinea le cellule di forma neurogliale. Infine, qui è mostrato un interneurone esprimente NPY a P15.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20 minuti se effettuata correttamente. Combinando l'uso di plasmidi specifici e linee di topi geneticamente modificati, è possibile ottenere un controllo temporale e spaziale nell'espressione dei geni di interesse. In alcuni esperimenti, utilizziamo il plasmide A-D-L-X-T-T-A per indurre l'espressione di transgeni dipendenti da AU.
In questi esperimenti, silenziamo l'espressione del transgene somministrando doxiciclina.
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Panoramica
Questa procedura illustra come indirizzare gli interneuroni nel proencefalo di topo in via di sviluppo mediante elettroporazione in utero. Questa tecnica consente un'espressione genica selettiva nei sottotipi di interneuroni destinati ai livelli superficiali della corteccia.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Espressione genica
Sfondo
- I neuroni intercalari svolgono un ruolo fondamentale nella funzione corticale.
- Indirizzare sottotipi specifici di neuroni intercalari può migliorare la comprensione delle loro funzioni.
- L'elettroporazione in utero è una tecnica potente per la manipolazione genica.
- Questo metodo consente un controllo preciso dell'espressione genica nei cervelli in via di sviluppo.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo per indirizzare gli interneuroni nella parte anteriore del cervello del topo.
- Raggiungere un'espressione genica selettiva in specifici sottotipi di interneuroni.
- Fornire un protocollo che possa essere replicato in altri studi.
Metodi Utilizzati
- Preparazione degli aghi per iniezione.
- Rimozione della catena embrionale dall'animale anestetizzato.
- Iniezione di DNA nel cervello.
- Elettroporazione per facilitare l'espressione genica.
Risultati principali
- Indirizzamento mirato riuscito verso sottotipi di interneuroni nel proencefalo in via di sviluppo.
- Espressione genica efficiente ottenuta mediante il protocollo descritto.
- Potenzialità dimostrata per ulteriori studi sugli interneuroni corticali.
- Metodo affidabile fornito per ricerche future in neuroscienze dello sviluppo.
Conclusioni
- L'elettroporazione in utero è un metodo efficace per indirizzare gli interneuroni.
- Questa tecnica può essere utilizzata per studiare la funzione genica in popolazioni neuronali specifiche.
- Il protocollo può essere adattato per diverse progettazioni sperimentali nelle neuroscienze.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'indirizzamento selettivo per sottotipo degli interneuroni corticali consente una riduzione del rischio di natura meccanicistica nella validazione di bersagli neurosviluppali. Questo approccio sostiene la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, collegando la manipolazione genetica a popolazioni neuronali definite. Affronta un punto critico nella selezione del portafoglio, in cui la specificità biologica riduce il rischio di abbandono nelle fasi avanzate.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche in sottotipi definiti di interneuroni GABAergici.
- Valore operativo: Offre una riduzione del rischio biologico mediante la validazione funzionale specifica per sottotipo.
- Valore strategico: Favorisce la fiducia predittiva e il triage del portafoglio isolando i meccanismi causali in sistemi rilevanti per la malattia.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi con risoluzione per sottotipo.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi mediante espressione del reporter indotta da elettroporazione.
- Valore strategico: Consente una valutazione affidabile dei composti in contesti neuronali rilevanti per la malattia.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la rilevanza per la malattia attraverso l'allineamento dei sottotipi di interneuroni corticali con la patofisiologia umana.
- Valore operativo: Garantisce la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica mediante una strategia di targeting coerente.
- Valore strategico: Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio collegando l'interazione con il bersaglio a esiti fenotipici in circuiti definiti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione fino alla valutazione preclinica, consentendo un affinamento iterativo dei modelli meccanicistici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nei sottotipi di interneuroni corticali.
- Screening: Fornisce prontezza del saggio e output quantitativi mediante l'espressione di un reporter fluorescente in cellule elettroporate.
- Analisi: Offre letture misurabili (ad esempio, intensità di GFP, localizzazione subcellulare) per confrontare condizioni genetiche o farmacologiche.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso marcatori di interneuroni conservati tra specie diverse.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per il controllo genico temporale e spaziale su più bersagli e modelli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi terapeutici, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei percorsi neurosviluppati.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della somministrazione genica specifica per sottotipo.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi per il sistema nervoso centrale.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio basate sull'interazione con l'obiettivo specifico per sottotipo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chirurgia embrionale, microchirurgia e tecniche di elettroporazione in utero.
- È dipendente da strumentazione specializzata, inclusi estrattori di pipette, elettroporatori e sistemi di imaging fluorescente.
- Necessita di standardizzazione condivisa tra gruppi che si occupano di chirurgia animale, biologia molecolare e imaging.
- Comporta considerazioni di adattamento tra diverse linee di topi, tempistiche gestazionali e costrutti plasmidici.
- I limiti pratici includono la vitalità degli embrioni dopo l'intervento chirurgico e la variabilità dell'efficienza di elettroporazione tra diverse nidiate.
