Name: Sottotipo-selettivo elettroporazione della corticale interneuroni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Impara l'elettroporazione in utero per bersagliare sottotipi specifici di interneuroni corticali nel cervello in sviluppo del topo. Questo metodo consente l'espressione genica selettiva per studiare la funzione neuronale.

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Siamo grati a Lihong Yin per l&#39;assistenza tecnica. NVD è destinatario di un NARSAD Young Investigator Award ed è anche sostenuto da sovvenzioni dal NIH (5 K99 MH095825-02). La ricerca in laboratorio Fishell è sostenuto dal National Institute of Health, Istituto Nazionale di Salute Mentale (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Istituto nazionale dei disordini neurologici e Stroke (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) e la Fondazione Simons.

Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con i regolamenti e le linee guida del Care and Use Committee animali istituzionale della Scuola di Medicina di NYU. Mouse Ceppi Swiss Webster topi femmina forniti da TACONIC sono stati utilizzati per questi esperimenti. Al fine di indirizzare specificamente interneuroni superficiali di livello, sono stati utilizzati embrioni E15.5. Nota: Il plasmide utilizzato in questo lavoro (Dlx5 / 6.eGFP plasmide 3 mg / mL) è stato generato utilizzando tecniche di clonazione standard. Il eGFP cDNA è stato clonato in un Dlx5 / 6-Pmin-polyA plasmide. Questo plasmide è disponibile su richiesta (demarn02@nyumc.org). 1 Preparazione di Microiniezione Pipettes <ol><li> Impostare l&#39;estrattore di calore # 2-860. </li><li> Posizionare e fissare il capillare di vetro in prossimità del filamento. Controllare che il diametro esterno (OD) della pipetta è di circa 30 micron. </li><li> Premere il tasto &quot;tirare&quot;. </li><li> Rimuovere con cautela il capillare. La parte inferiore è l&#39;ago. Eliminare la parte superiore. </li></ol> 2 Anestesia Procedura <ol><li> Preparare una camera contenente isoflurano. Nota: isoflurano è l&#39;anestetico preferito per la sua rapidità d&#39;azione e la bassa incidenza di effetti collaterali. Pentobarbital è un&#39;altra opzione; Tuttavia, la tolleranza di questo farmaco è variabile e può portare ad un tasso di mortalità superiore rispetto isoflurano. </li><li> Impostare il flusso di isoflurano al 4-5% in 0,5-1 L / min O 2. </li><li> Assicurarsi che la valvola per la camera è aperta, mentre la valvola per l&#39;adattatore testa è chiusa. </li><li> Posizionare il mouse incinta in camera. </li><li> Lasciare il mouse per andare sotto l&#39;effetto dell&#39;anestesia. Questo richiederà circa 2-3 min. Controllare la frequenza respiratoria. Se il mouse ha inizio iperventilazione, ridurre la dose di isoflurano. </li><li> Dopo che il mouse è anestetizzato, prontamente alla rimozione dalla camera. Posizionarlo lato ventrale sul riscaldamento pad e insert la testa nella maschera che continuerà a fornire isoflurano durante l&#39;intervento chirurgico. Assicurarsi di cambiare il flusso di isoflurano dalla camera al tubo che collega il pezzo adattatore testa. Mettere una goccia di lubrificante occhio in ogni occhio e chiudere gli occhi. </li><li> Impostare il pad di riscaldamento a 36 ° C gradi per ridurre al minimo l&#39;ipotermia. </li><li> Verificare l&#39;assenza di piede e di coda riflessi pizzicando le zampe posteriori e la coda. </li></ol> 3. Chirurgia <ol><li> Detergere la pelle che ricopre l&#39;addome con il 70% di etanolo. </li><li> Usare pinze per tirare la pelle verso l&#39;alto. Dopo ogni intervento chirurgico, lavare tutti gli strumenti con acqua e detergente, e sterilizzata a 72 ° CO / N. </li><li> Fai una piccola incisione verticale (circa 2 cm) lungo la linea mediana iniziando a metà strada tra il terzo e quarto paia di ghiandole mammarie. Usare le forbici chirurgia sottili. Fare attenzione a non danneggiare la parete addominale. </li><li> Separare delicatamente la pelle dal peritoneo. </li><li> Visualizza le arteriee vene sulla parete addominale. Fare un altro due centimetri incisione verticale attraverso il peritoneo (evitando i vasi) per esporre la cavità addominale. </li><li> Fissare la pelle e la parete addominale su ogni lato evitando il bloccaggio delle arterie. Nota: Se le arterie vengono accidentalmente perforati, sacrificare l&#39;animale immediatamente eseguendo dislocazione cervicale o overdose isoflurano. </li><li> Pre riscaldare la sterile PBS a 37 ° C. Coprire i morsetti con PBS umide Kim salviette. </li><li> Idratare la cavità addominale esposta con PBS. Ripetere questa operazione più volte durante l&#39;esecuzione della chirurgia. </li><li> Utilizzando pinze rotonde, tirare delicatamente la catena embrionale (E15.5) lontano dalla cavità. Lasciare riposare catena sulle salviettine umidificate. Inizia esponendo una metà dell&#39;utero prima. Una volta che gli embrioni in esso sono elettroporati, riportarlo dentro, poi lavorare sulla seconda metà. </li></ol> 4. elettroporazione <ol><li> Continuare a utilizzare pinze rotonde per manipolare gli embrioni. </li><li> Visualize ventricoli laterali. I ventricoli laterali corrono lungo la linea mediana (Figura 1b). </li><li> Aggiungi Veloce Verde (magazzino: 10% w / v) per la soluzione di DNA per una miscela 01:20 di visualizzare durante l&#39;iniezione. Preparare la soluzione di DNA sciogliendo il pellet ottenuto da un protocollo di purificazione maxi-prep serie in acqua distillata. </li><li> Utilizzare micropipette pre tirati con uno stantuffo per iniettare 1 ml di soluzione di DNA (Dlx5 / 6-eGFP, 3 mg / mL) con Fast verde. Tagliare la punta della micropipetta con un bel forcep # 5 (Dumont) lasciare 6 mm di lunghezza dall&#39;inizio della spalla alla fine della punta dell&#39;ago prima di caricare la pipetta. Tenere la testa di un embrione con una pinzetta rotonde. Immettere il cervello con la pipetta ad un angolo di 45 ° puntando il ventricolo laterale si trova vicino alla linea mediana. Se l&#39;ago penetra attraverso il ventricolo, ritirare lentamente la pipetta come si usa lo stantuffo per iniettare il DNA. Il ventricolo dovrebbe diventare verde quando ilsoluzione comincia a riempirlo. A questo punto, fermano la pipetta e iniettare 1 ml di DNA. Delicatamente, ritirare la pipetta. </li><li> Impostare il elettroporatore CUY21 a cinque 45V impulsi di 50 msec intervallate da 950 msec. </li><li> Utilizzare 5 millimetri elettrodi pagaia per gli embrioni E15.5. Immergere gli elettrodi in PBS per assicurare la trasmissione di corrente efficace. </li><li> Posizionare le piastre degli elettrodi intorno alla testa dell&#39;embrione con la pagaia positivo sul ventricolo contenente la soluzione di DNA. Leggermente abbassare la paletta positivo rispetto del negativo per creare una corrente ventrale attraverso eminenze gangliari. Questa manipolazione ridurrà espressione ectopica in cellule piramidali. </li><li> Dopo aver posizionato gli elettrodi, fornire un impulso premendo il pedale una volta. </li><li> Rimuovere gli elettrodi e pulire puliti. Ripetere i passaggi 4,6-4,9 con ogni embrione. </li><li> Dopo electroporating tutti gli embrioni, versare 3 ml di PBS nella cavità addominale e restituirli alla cavità addominale. </li><li>Prima sutura della parete addominale con un ago curvo e 5-0 sutura di seta e poi la pelle. Applicare lidocaina (4%) sulla ferita. Somministrare 120 mg / kg di Aspirina intra peritoneo per l&#39;analgesia. Nota: L&#39;intera procedura deve essere eseguita in 20 minuti o meno. E &#39;consigliabile che i principianti elettroporazione solo pochi embrioni per mantenere il tempo di funzionamento breve. Interventi chirurgici prolungati diminuirà il tasso di sopravvivenza degli embrioni. </li><li> Rimuovere l&#39;animale dal tubo dell&#39;anestesia e consentire il recupero sul pad di riscaldamento su una carta pulire. </li><li> Animale Ritorna alla gabbia, tenerlo sulla rampa di riscaldamento a 37 ° C e monitorare lo stato di salute. Gli animali in genere tollerano l&#39;intervento chirurgico bene e cominciano a muoversi lentamente subito dopo vengono rimossi dal tubo dell&#39;anestesia. Se si osserva un eccessivo sanguinamento o letargia, sacrificare immediatamente l&#39;animale eseguendo IACUC approvato le procedure di eutanasia come la dislocazione cervicale o overdose anestesia. </li><li> Gabbia Ritorna alla vivarium. Le femmine saranno partorire naturalmente. </li></ol>

<ol><li>Fishell, G., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+inhibition+within+the+telencephalon%3A+%26%2334%3Bwhere+the+wild+things+are%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of inhibition within the telencephalon: &#34;where the wild things are&#34;.</a> Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).</li>
<li>Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+distinct+progenitor+populations+in+the+lateral+ganglionic+eminence%3A+implications+for+striatal+and+olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis.</a> J Neurosci. 23, 167-174 (2003).</li>
<li>Eisenstat, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DLX-1%2C+DLX-2%2C+and+DLX-5+expression+define+distinct+stages+of+basal+forebrain+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation.</a> J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).</li>
<li>Batista-Brito, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+integration+of+cortical+interneurons+into+a+functional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The developmental integration of cortical interneurons into a functional network.</a> Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).</li>
<li>Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologically+distinct+temporal+cohorts+of+cortical+interneurons+arise+from+telencephalic+Olig2-expressing+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors.</a> J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).</li>
<li>Miyoshi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate+mapping+reveals+that+the+caudal+ganglionic+eminence+produces+a+large+and+diverse+population+of+superficial+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons.</a> J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Dlx-2+%28Tes-1%29+gene+is+expressed+in+spatially+restricted+domains+of+the+forebrain%2C+face+and+limbs+in+midgestation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos.</a> Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+Dlx-1%2C+Dlx-2+%28Tes-1%29%2C+Gbx-2%2C+and+Wnt-3+in+the+embryonic+day+12.5+mouse+forebrain+defines+potential+transverse+and+longitudinal+segmental+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries.</a> J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).</li>
<li>Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+a+member+of+a+new+family+of+murine+Distal-less+homeobox+genes+in+the+developing+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+biologist%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain.</a> The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).</li>
<li>Close, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb1+is+an+activity-modulated+transcription+factor+required+for+the+terminal+differentiation+and+connectivity+of+medial+ganglionic+eminence-derived+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons.</a> J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472, 351-355 (2011).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239(2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

LIMITI DELLA TECNICA Mentre questa tecnica permette di cella di analisi autonoma di processi cellulari, non è adatto per l&#39;analisi di popolazione. I electroporations sono molto scarse, con meno di un migliaio di cellule elettroporate al cervello. Di conseguenza, la tecnica non può essere utilizzata per valutare conseguenze comportamentali dovute alla manipolazione genetica degli interneuroni CGE-derivati. Mentre electroporations effettuate ai sottotipi bersag...

La maggior parte delle corticali interneuroni GABAergici provengono da due strutture embrionali transitori denominate le eminenze gangliari mediale e caudale (MGE e CGE, rispettivamente) 4. Parvalbumina e somatostatina esprimere interneuroni sono originari del MGE, mentre Calretinin (Cr), Vasointestinal peptide (VIP) e Reelin (Re) che esprime interneuroni provengono dalla CGE. Questi sottotipi di interneuroni possono essere distinte dalle loro date di nascita. MGE sottotipi derivati ​​sono nati tra il giorno embrionale 9.5 (E9.5) e e16.5 5,6. Al contrario, gli interneuroni CGE derivati ​​nascono da E12.5 attraverso e18.5 con il loro picco produttivo di E15.5 6. L&#39;orientamento genetico di questa popolazione tardi nato, tuttavia, rimane sfuggente. Le distale-meno (Dlx) geni murini sono espressi esclusivamente in via di sviluppo proencefalo ventrale 3. Interneuroni GABAergici e neuroni striatali di proiezione, ma cellule piramidali corticali non esprimono Dlx1, 2,5, e 6 geni nelle prime fasi di sviluppo 3. Infatti, i geni Dlx sono espressi in zona MGE e CGE subventricolare (SVZ) in tutti i progenitori GABAergici. L&#39;espressione di questi geni si restringe per selezionare sottotipi nelle fasi post-mitotici 7-9. Evidenza sperimentale precedente ha mostrato che l&#39;elemento Dlx5 / 6 enhancer permette di targeting selettivo di lignaggi GABAergici in modelli di topi transgenici 2. Abbiamo testato l&#39;uso di uno di questi elementi enhancer nel contesto di espressione episomiale nel cervello di topo in via di sviluppo. Abbiamo sub clonato l&#39;elemento Dlx5 / 6 enhancer insieme ad un promotore minimo e la proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) in un Bluescript (BS) backbone plasmide (Figura 1). Abbiamo introdotto il plasmide mediante elettroporazione in utero a E15.5 di mirare selettivamente Cr, VIP e Re- sottotipi 3,8,10. La nostra tecnica permette di elettroporazione sparse, che facilitala ricostruzione delle caratteristiche morfologiche delle cellule singe. Inoltre, eccezionalmente alti livelli di espressione genica in neuroni corticali GABAergici permette di studi funzionali. Abbiamo effettuato perdita e guadagno di studi di funzione utilizzando diversi wild type e geni dominanti negativi 11.

<table><tbody><tr><td>Elettroporatore con pedale</td><td>Protech International</td><td>CUY21</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi a paletta da 5 mm.</td><td>Protech International</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>DCT-15</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Instruments P30 Estrattore&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>3282322</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac Sistemi di anestesia</td><td>Harvard Apparecchio</td><td>726425</td><td></td></tr><tr><td>Forbici operative delicate 4.75" Dritto Affilato/Affilato</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Seta Treccia Nera 18" C-1 Scatola 36&nbsp;</td><td>Roboz</td><td>SUT-1073-21</td><td></td></tr><tr><td>Micro Clip Applicazione Pinze 5.5"</td> <td>Roboz</td><td>RS-5410</td><td></td></tr><tr><td>2 Forbici a morsetto</td><td>Roboz</td><td>RC-4894</td><td></td></tr><tr><td>Pinze di tenuta&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11031-15</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capillare in vetro&nbsp;</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td>Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile PBS</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr></tbody></table>

sottotipo-selettivo elettroporazione della corticale interneuroni

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Lo studio del sistema nervoso centrale (CNS) maturazione si basa su di targeting genetica delle popolazioni neuronali. Tuttavia, il compito di limitare l&#39;espressione di geni di interesse per specifici sottotipi neuronali si è dimostrato straordinariamente difficile a causa della relativa scarsità di specifici elementi promotori. Interneuroni GABAergici costituiscono una popolazione neuronale con una vasta diversità genetica e morfologica. Infatti, più di 11 differenti sottotipi di interneuroni GABAergici sono stati caratterizzati nella corteccia mouse 1. Qui vi presentiamo un protocollo adatto per il targeting selettivo delle popolazioni GABAergici. Abbiamo raggiunto sottotipo selettivi mirati interneuroni GABAergici utilizzando l&#39;elemento enhancer della trascrizione homeobox fattori Dlx5 e Dlx6, omologhi del distale-less (Dll) gene Drosophila 2,3, per guidare l&#39;espressione di geni specifici mediante elettroporazione in utero.

Abbiamo adattato la tecnica di elettroporazione in utero per raggiungere tipo cellulare specifico orientamento dei neuroni in scadenza. Per guidare l&#39;espressione di eGFP in interneuroni CGE-derivati, abbiamo utilizzato l&#39;elemento enhancer Dlx5 / 6 e limitati i nostri iniezioni per E15.5, la fase in cui la maggior parte degli interneuroni CGE-derivati ​​vengono generati. Abbiamo effettuato l&#39;analisi a P8 e P15 11 (figure 1 e 2). Abbiamo confermato...

Questa procedura mostra come indirizzare gli interneuroni nel prosencefalo del topo in via di sviluppo per mezzo dell'elettroporazione in utero. Questa tecnica è stata particolarmente efficace per ottenere l'espressione genica selettiva nei sottotipi di interneuroni destinati agli strati superficiali della corteccia.

Sottotipo-selettivo elettroporazione della corticale interneuroni

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indirizzare i neuroni interni nel cervello del topo in via di sviluppo mediante elettroporazione in utero. Questo viene realizzato innanzitutto preparando gli aghi per l'iniezione. Il secondo passaggio consiste nel rimuovere la catena embrionale dall'animale anestetizzato.Successivamente, viene effettuata l'iniezione di DNA ed elettroporazione nel cervello. L'ultimo passaggio consiste nel permettere all'animale di riprendersi dall'intervento chirurgico. In definitiva, l'elettroporazione in utero viene utilizzata per consentire il targeting selettivo di sottotipi di interneuroni.Il vantaggio di questi metodi rispetto alle tecniche esistenti, come l'elettroporazione in utero non specifica, è che forniscono i mezzi per eseguire un'analisi autonoma cellulare di un sottoinsieme di interneuroni corticali. I livelli elevati di espressione di GFP permettono la visualizzazione e l'analisi di singoli interneuroni. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo neurologico, ad esempio quali sono le regole che governano l'integrazione degli interneuroni in maturazione.Per iniziare questa procedura, preparare la pipetta per microiniezione tirando una capillare di vetro con un estrattore di pipette. Successivamente, rimuovere con attenzione la capillare e raccogliere l'ago inferiore per la microiniezione. Ora, posizionare un topo gravido anestetizzato con il lato ventrale rivolto verso l'alto sul tappetino riscaldante.Coprire le vie aeree con una maschera che continuerà a fornire isoflurano durante l'intervento chirurgico. Applicare quindi un lubrificante oculare su entrambi gli occhi. Impostare il tappetino riscaldante a 36 gradi Celsius per prevenire l'ipotermia successivamente.Verificare l'assenza di riflessi plantari e caudali pizzicando le zampe posteriori o la coda. Successivamente, detergere la cute dell'addome con etanolo al 70%. Utilizzare una pinza per sollevare la cute verso l'alto.Quindi effettuare un piccolo incisione verticale di due centimetri lungo la linea mediana, a partire dal punto intermedio tra la terza e la quarta coppia di ghiandole mammarie. Avere cura di non danneggiare la parete addominale utilizzando pinze rotonde. Tirare delicatamente la catena embrionale lontano dalla cavità.Lasciare la catena appoggiata sulle salviette umidificate. Iniziare esponendo una metà dell'utero, quindi procedere all'elettroporazione degli embrioni prima di passare all'altra metà.In questo procedimento, preparare una soluzione di DNA sciogliendo il pellet ottenuto da un protocollo standard di purificazione con maxi prep in acqua distillata. Successivamente, aggiungere il fast green alla soluzione di DNA in un rapporto di uno a venti per consentire la visualizzazione durante l'iniezione. Quindi, tagliare la punta di una micropipetta pre-trazionata con pinzette fini, lasciando sei millimetri dalla fine della spalla all'estremità della punta.Successivamente, caricare la micropipetta con un microlitro di soluzione di DNA contenente verde brillante per l'iniezione. Trattenere la testa dell'embrione con pinzette rotonde. Inserire la pipetta nel cervello con un angolo di 45 gradi, puntando verso il ventricolo laterale situato vicino alla linea mediana.Se l'ago penetra attraverso il ventricolo, ritirare lentamente la pipetta. Il ventricolo dovrebbe diventare verde quando la soluzione inizia a riempirlo. A questo punto, fermare il movimento della pipetta ed iniettare un microlitro di DNA.Quindi ritirare delicatamente la pipetta. Impostare l'ECM eight 30 ator su impulsi di 5 45 volt della durata di 50 millisecondi, intervallati da un intervallo inter-impulso di 950 millisecondi. Immergere gli elettrodi a paletta da cinque millimetri in PBS per garantire una trasmissione efficiente della corrente.Quindi posizionare le palette dell'elettrodo attorno alla testa dell'embrione con una paletta positiva sul ventricolo contenente la soluzione di DNA. Posizionare la paletta positiva leggermente più in basso rispetto a quella negativa per creare una corrente ventrale attraverso le eminenze gangliari. Questo ridurrà al minimo l'espressione ectopica nelle cellule parametali.Ora erogare un impulso premendo una volta il pedale, quindi rimuovere gli elettrodi e pulirli. Ripetere i passaggi per ciascuno degli embrioni. Dopo aver elettroporato tutti gli embrioni.Versare tre millilitri di PBS nella cavità addominale e reinserire gli embrioni nella cavità addominale. Successivamente, suturare la parete addominale con un ago curvo e sutura di seta 5-0, quindi suturare la cute. Applicare lidocaina sulla ferita e somministrare inizialmente 120 milligrammi per chilogrammo di aspirina per l'analgesia.Rimuovere l'animale dal tubo dell'anestesia e lasciarlo riprendere su un asciugatore di carta posto sul tappetino riscaldante. Successivamente, restituire l'animale alla gabbia. Mantenerlo sul tappetino riscaldante a 37 gradi Celsius e monitorare lo stato di salute.In questo esperimento, i neuroni intercalati elettroporati sono delineati dall'espressione di marcatori del sottotipo derivati dal CGE. Questa immagine mostra che i neuroni intercalati derivati dal CGE sono stati elettroporati con un plasmide DLX5/6-EGFP. Questa immagine mostra un neurone intercalato che esprime VIP a P8.L'espressione di EGFP delinea l'intero albero dendritico e l'arborizzazione assonica di singoli neuroni, e qui è mostrato un interneurone esprimente NPY a P8. L'espressione di NP y delinea le cellule di forma neurogliale. Infine, qui è mostrato un interneurone esprimente NPY a P15.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20 minuti se effettuata correttamente. Combinando l'uso di plasmidi specifici e linee di topi geneticamente modificati, è possibile ottenere un controllo temporale e spaziale nell'espressione dei geni di interesse. In alcuni esperimenti, utilizziamo il plasmide A-D-L-X-T-T-A per indurre l'espressione di transgeni dipendenti da AU.In questi esperimenti, silenziamo l'espressione del transgene somministrando doxiciclina.

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Elettroporazione in utero è un metodo prezioso per trasfezione delle cellule progenitrici neuronali in vivo. A seconda del posizionamento degli elettrodi e la timepoint sviluppo di elettroporazione, alcuni sottoinsiemi di cellule corticali può essere mirati. Cellule bersaglio può quindi essere analizzato in vivo o in vitro per gli effetti di alterazione genetica.

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

Elettroporazione in utero permette per la consegna rapida in un gene-spazialmente e temporalmente modo controllato nello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC). Qui descriviamo altamente adattabile a protocollo di elettroporazione utero che possono essere usati per fornire costruisce espressione in più domini embrionale del SNC, tra cui il diencefalo telencefalo, e della retina.

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

Questo video dimostra il protocollo per l'elettroporazione di geni a singola cellula sia nei neuroni eccitatori che in quelli inibitori in una serie di colture di fette di ippocampo in vitro. La tecnica è utile per esaminare specifiche funzioni molecolari e fisiologiche dei neuroni, compresi i meccanismi autonomi delle cellule e le interazioni proteiche transsinaptiche.

Elettroporazione di singole cellule in colture organotipiche di fette di cervello: una tecnica in vitro per fornire plasmidi all'interno di neuroni mirati in fette di ippocampo cerebrale

Fonte: Denaxa, M., el al., Trapianto di progenitori interneuronali corticali chemiogeneticamente modificati in cervelli di topo postnatali precoci. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra la procedura per iniettare un vettore plasmidico che trasporta il gene di interesse nei progenitori degli interneuroni in una fetta di cervello embrionale, seguita dall'elettroporazione per l'ingresso nel plasmide e l'espressione genica. Questi progenitori modificati possono essere successivamente utilizzati...

Trasferimento genico assistito da elettroporazione incorporato in agarosio nei progenitori degli interneuroni corticali di topo

La superficie piale è una zona progenitore unico nel SNC che sta ricevendo crescente attenzione. Qui, noi dettaglio un metodo per la manipolazione genetica rapido di questa zona progenitore utilizzando un metodo di elettroporazione modificato. Questa procedura può essere utilizzata per indagini cellulari e molecolari delle linee cellulari e vie di segnalazione coinvolte nella differenziazione cellulare e per chiarire il destino e le proprietà delle cellule figlie.

Neonatale Pial elettroporazione Surface

Questo manoscritto fornisce protocolli che utilizzano in utero elettroporazione (IUE) per descrivere la connettività strutturale dei neuroni a livello di singola cellula e l'eccitabilità dei neuroni fluorescente. Istologia è utilizzato per caratterizzare dendritiche e le proiezioni assonali. registrazione a cellula intera a fette acuta viene utilizzato per studiare l'eccitabilità.

Elettroporazione in utero approcci per studiare l&#39;eccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell

Qui presentiamo un protocollo, progettato per utilizzare strumenti chemiogenetici per manipolare l'attività dei progenitori interneuroni corticali trapiantati nella corteccia dei primi topi postnatali.

Trapianto di progenitori interneuroni corticali chemiogeneticamente ingegnerizzati nei primi cervelli dei topi postnatali

La doppia elettropozione in utero consente di colpire le popolazioni cellulari separate spazialmente e temporaneamente. Questa tecnica è utile per visualizzare le interazioni tra quelle popolazioni cellulari utilizzando proteine fluorescenti in condizioni normali, ma anche dopo esperimenti funzionali per perturbare i geni di interesse.

Doppia elettroporazione in utero per colpire le popolazioni di cellule temporali e separate spazialmente

Presentato qui è un protocollo per l'elettroporazione a singola cellula in grado di fornire geni sia nei neuroni eccitatori che inibitori in una vasta gamma di età della coltura di fette ippocampali in vitro. Il nostro approccio fornisce un'espressione precisa ed efficiente dei geni nelle singole cellule, che può essere utilizzata per esaminare le funzioni cellulari autonome e intercellulari.

Elettroporazione a cella singola attraverso diverse culture di fette organotipiche di neuroni eccitatori ippocampali del topo e specifici della classe

Qui presentiamo un protocollo che descrive la trasduzione virale di regioni cerebrali discrete con costrutti optogenetici per consentire la caratterizzazione elettrofisiologica sinaptico-specifica in fette acute di cervello di roditori.

Ex Vivo Interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale

Qui, presentiamo la manipolazione genetica acuta di organoidi corticali umani affettati mediante elettroporazione. Questi modelli di organoidi corticali sono particolarmente suscettibili di iniezione in quanto le strutture simili a ventricole possono essere facilmente identificate dopo lo slicing, consentendo l'indagine funzionale dello sviluppo corticale umano, dei disturbi dello sviluppo neurologico e dell'evoluzione corticale.

Elettroporazione di organoidi corticali umani affettati per studi di funzione genica

Impara l'elettroporazione in utero per bersagliare sottotipi specifici di interneuroni corticali nel cervello in sviluppo del topo. Questo metodo consente l'espressione genica selettiva per studiare la funzione neuronale.

Sottotipo-selettivo elettroporazione della corticale interneuroni

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