Name: Le colture per pluripotenti umane alternative staminali produzione di celle, manutenzione e analisi genetica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Impara a coltivare cellule staminali pluripotenti umane con il metodo NCM utilizzando inibitori ROCK e laminina-521. Questo protocollo garantisce popolazioni omogenee per la manipolazione genetica e la scoperta di farmaci.

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Questo lavoro è stato supportato dal Programma di Ricerca Intramurale del National Institutes of Health (NIH) presso il National Institute of Neurological Disorders and Stroke. Vorremmo ringraziare il Dr. Ronald D. McKay per la sua discussione e i suoi commenti su questo progetto.

Basato Single-cell di tipo non-colonia monostrato (NCM) cultura della hPSCs. 1. Preparativi <ol><li> Rendere 500 ml di terreno per la cultura di fibroblasti embrionali di topo (MEF): medie DMEM supplementato con 10% FBS, 2 mM L-glutammina, e 0,1 mm aminoacidi non essenziali (NEAA). </li><li> Isolare fibroblasti embrionali di topo (MEF), le cellule derivate dal ceppo CF1 a seguito di un protocollo di routine 16 e cultura MEF sul 0,1% di gelatina rivestite 6-pozzetti di coltura cellulare in DMEM. In alternativa, l&#39;acquisto di azioni del MEF al passaggio 3 da risorse commerciali. </li><li> Preparare piatti Matrigel. <ol><li> Diluire 5 ml di hESC qualificati Matrigel magazzino con 5 ml di DMEM/F12 medio (raffreddato a ~ 4 ° C) e conservare il 50% aliquote in una -20 ° C freezer. Scongelare ghiacciato Matrigel magazzino in frigorifero (~ 4 ° C) O / N e diluire ulteriormente la Matrigel in mezzo DMEM/F12 freddo (per dare luogo ad una concentrazione di lavoro 2,5%). </li><li&gt; Coat 6 pozzetti piastre di coltura cellulare con 1,5 ml di 2,5% Matrigel per bene, conservare le piastre rivestite in frigorifero O / N (Nota: utilizzare la piastra Matrigel rivestite entro 2 settimane). </li><li> Rimuovere la piastra Matrigel dal frigorifero, lasciare che la piastra si riscaldi a temperatura ambiente nella cappa di coltura cellulare per 10-30 min (Nota: non scaldare la piastra in un incubatore coltura cellulare), e aspirare DMEM prima della placcatura hPSCs. </li></ol></li><li> Rendere 500 ml mezzo hESC: 80% medio DMEM/F12, 20% KSR, 2 mM L-glutammina, 0,1 mM aminoacidi non essenziali, 0,1 mM β-mercaptoetanolo, e 4 ng / ml di FGF-2. </li><li> Preparare 10 ml di 2X HPSC medio di congelamento: 60% FBS, 20% DMSO e 20 mM Y-27632 in mTeSR1 mezzo, sterilizzare per filtrazione, e utilizzare il mezzo entro 1 settimana. </li></ol> . 2 Protocollo 1 (Elementare): Grow HPSC Colonie su Alimentatori <ol><li> Utilizzare numeri passaggio MEF a 5 o 6 (designato come p5 e p6) per cultura HPSC per vedere Resul coerentets. Mitoticamente inattivare MEF trattando le cellule con 10 pg / ml mitomicina C per 3 ore a 37 ° C, lavare le cellule 3x con di 1X Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (D-PBS), e poi si dissociano MEF con 0,05% tripsina in 0,53 mM EDTA. In alternativa, irradiare MEF alla dose di 8.000 rad considerando un irradiatore a raggi X. </li><li> Contare il numero di cellule utilizzando il metodo di esclusione del Trypan Blue macchia sotto microscopio. In alternativa, utilizzare un contatore automatico cella. </li><li> Piastre MEF irradiati su lastre di polistirene 6 pozzetti rivestiti con 0,1% di gelatina ad una densità di 1,88 x 10 5 cellule per pozzetto (cioè, 1,96 x 10 4 cellule / cm 2). Incubare le cellule a 37 ° C e 5% di CO 2 per 24 ore. </li><li> Rimuovere il terreno di coltura MEF per aspirazione con una pipetta Pasteur (Nota: nessun fasi di lavaggio necessari in questo momento). </li><li> Triturare HPSC colonie dalla cultura precedente in piccoli ciuffi, esaminano i grumi sotto il microscopio per assicurare loro dimensioni variano from 50 a 100 micron di diametro, e piastra ciuffi HPSC sulla cima MEF strati feeder in un pozzetto contenente 2 ml di HPSC medie. </li><li> Cambiare hESC mezzo al giorno per 3 a 5 giorni, record di crescita colonia fotografia, contrassegnare tutte le colonie morfologicamente alterati o differenziati (~ 5%), e rimuovere manualmente le colonie contrassegnati con delicatezza aspirazione con una pipetta Pasteur. </li><li> Risciacquare le restanti colonie MEFs due volte (2 min ciascuno con D-PBS), e incubare le colonie con 2 ml di 1 mg / ml di collagenasi IV in HPSC medio per 10 a 30 minuti), ed esaminare il distacco delle colonie HPSC dal MEF superficie rivestita (Nota: utilizzare un raschietto per aiutare il processo di distacco solo se le colonie sono strettamente collegati alla piastra). </li><li> Aggiungere 5 ml di HPSC mezzo a ciascun pozzetto per minimizzare le reazioni enzimatiche, trasferimento colonie ad una provetta da 15 ml, permettere colonie HPSC sedimentare per 3 a 5 minuti a temperatura ambiente, e garantire la sedimentazione delle colonie tramite visualizzazione diretta del cells nella parte inferiore del tubo (Nota: non centrifugare la provetta in questa fase). </li><li> Rimuovere il surnatante contenente MEF residue e dissociato singole cellule, risospendere le colonie con 5 ml di hESC medie, e ripetere l&#39;operazione di sedimentazione due volte. </li><li> Rimuovere le medie, triturare colonie HPSC in piccoli ciuffi, negozio in 1X HPSC congelamento medio (o CryoStore CS10 mezzo congelamento) per la crioconservazione (1 confluente bene per fiala congelata) o piastra su un 6-pozzetti per passaging cellulare. </li></ol> 3 Protocollo 2:. Convertire HPSC colonie da alimentatori a NCM <ol><li> Sciacquare pellets HPSC in D-PBS una volta, incubare il pellet con 1 ml di 1X Accutase per 10 minuti, ed esaminare la reazione enzimatica sotto un microscopio per assicurare dissociazione singola cellula. </li><li> Terminate le reazioni enzimatiche da risospendere delicatamente le cellule in 5 ml di mTeSR1 mezzo contenente 10 mM Y-27632 seguito da centrifugazione a 200 xg a temperatura ambiente per 5 min(Nota, non utilizzare eccessive forze di centrifugazione che causano danni alle cellule). </li><li> Aggiungere 5 ml di mTeSR1 mezzo al pellet, risospendere il pellet come singole cellule, e filtro dissociato cellule attraverso un colino cella 40 pm (per eliminare eventuali aggregati di cellule residue). </li><li> Seed 1,3-2 x 10 6 hPSCs in un pozzetto (1,4-2,1 x 10 5 cellule / cm 2) di un 6-pozzetti rivestiti con 2,5% hESC qualificato Matrigel, aggiungere mTeSR1 medio fino a 2,5 ml, e comprendono 10 micron Y-27632 nel mezzo (per facilitare il 24 hr placcatura singola cellula iniziale). In alternativa, utilizzare le seguenti piccole molecole di sostituire 10 micron Y-27632 per migliorare la placcatura unicellulare: 1 micron Y-39983 (ROCK I inibitore), 1 mM phenylbenzodioxane (inibitore ROCK II), 1 micron thiazovivin (un inibitore ROCK romanzo) , e inibitore JAK 2 mM 1. </li><li> Sostituire il mezzo con drug-free medio mTeSR1 il giorno successivo (entro 24 ore), dissociare le cellule da uno in piùbene, e contare il numero di cellule per determinare singola cellula efficienza placcatura (Nota: approssimativamente, dal 50 al 90% della singola cellula placcatura di efficienza che può essere raggiunto in questa fase). </li><li> Permettono alle cellule di crescere come una cellula formata singolo monostrato per alcuni giorni con 3 ml di mTeSR1 medie. Cambiare medio giornaliero. </li><li> Determinare empiricamente la pianificazione per passaging adattato NCM seconda della densità cellulare. Passage quando la crescita delle cellule raggiunge confluenza al giorno 3 o 4 ° giorno, o al punto di tempo 4 ore dopo la scomparsa dei confini cellula-cellula. Dissociare le cellule in 1 ml di Accutase, utilizzare un 1 a 3 rapporto di splittaggio (cioè, 1 confluenti ben di cellule piastrate in 3 pozzetti della piastra da 6 pozzetti) per passaging cella, e stabilizzare adattato NCM da 5 passaggi. </li><li> Il congelamento delle cellule <ol><li> Utilizzare un pozzetto confluenti (~ 5-6 x10 6 cellule) per una fiala congelata: dissociare celle da una confluenti bene con 1 ml di Accutase per 10 min. </li><li> Diluire wesima 5 ml di mTeSR1 medie e centrifugare le cellule come descritto sopra. </li><li> Risospendere il pellet in 500 ml di mTeSR1 medio e poi aggiungere lentamente 500 ml di 2X HPSC medio di congelamento (contenenti 20 micron Y-27632) in un flaconcino di crioconservazione. In alternativa, risospendere le cellule in 1X HPSC medio congelamento contenenti inibitore JAK 2 mM 1 o 1X CryoStor CS10 medio in presenza di 10 pM o Y-27632 o 2 inibitore JAK 1 mM. </li><li> Mettere fiale congelate in un cryocontainer ghiaccio freddo (bottom-riempita con isopranol) e trasferire il cryocontainer ad un -80 ° C freezer immediatamente. </li><li> Trasferire le cellule dal -80 ° C congelatore ad un serbatoio di azoto liquido (il giorno successivo) per la crioconservazione a lungo termine. </li></ol></li><li> Scongelamento delle cellule <ol><li> Utilizzare un flaconcino crioconservazione per la placcatura 1 pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. </li><li> Pre-riscaldare medio mTeSR1 in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 10 min, cellule disgelo nella stessa bagnomaria per 2 min,goccia a goccia aggiungere celle a 5 ml di pre-riscaldato medio mTeSR1 contenenti 10 mM Y-27632, e centrifuga come sopra descritto. </li><li> Risospendere delicatamente i pellet cellulari con 2 ml di mTeSR1 mezzo contenente 10 mM Y-27632 e lentamente trasferire cellule ad una ben pre-rivestito con Matrigel (Nota: evitare di produrre bolle d&#39;aria). </li><li> Cambia medio giornaliero e si aspettano una crescita HPSC raggiungere confluenza al giorno 3 o 4. </li></ol></li></ol> 4 Protocollo 3:. Convertire HPSC colonie su Matrigel per NCM Cultura <ol><li> Rimuovere un piatto Matrigel rivestite da frigorifero, posizionare la piastra nella cappa coltura tissutale da 10 a 30 minuti, rimuovere il terreno da ciascun pozzetto della piastra, e aggiungere 2 ml di pre-riscaldato medio mTeSR1 a ciascun pozzetto. </li><li> Trasferimento triturato ciuffi HPSC dalla cultura alimentatore (Passo 2.10 del protocollo di base) alla piastra sopra Matrigel. Aggiungi mTeSR1 medio fino a 2,5 ml di volume finale in ogni pozzetto. </li><li> Cambiare mezzo al giorno per 3 a 4 giornis fino colonie raggiungono l&#39;80-90% di confluenza. </li><li> Per passaging cella: sciacquare le colonie con D-PBS due volte, trattare le cellule con 1 ml di 2 mg / ml dispasi a 37 ° C per 15 a 20 minuti, e sedimenti e passaggio cellule come grumi. </li><li> Per la cultura NCM: ripetere i passaggi 3,1-3,9 descritto nel protocollo 2. </li></ol> 5 Protocollo 4:. NCM Cultura della hPSCs su LN-521 <ol><li> Scongelare il ricombinante soluzione LN-521 a 4 ° C prima del giorno di utilizzo e rendere la soluzione di rivestimento laminina (LCS) diluendo la laminina scongelato con 1X D-PBS (contenente Ca 2 + / Mg 2 +) ad una concentrazione finale di 10 ug / ml. </li><li> Aggiungere 1 ml di LCS da un pozzetto in 6 pozzetti (nota: evitare a secco durante il processo di rivestimento). </li><li> Sigillare la piastra ricoperta con Parafilm per evitare l&#39;evaporazione e conservare il piatto in frigorifero (4 ° C) O / N (nota: utilizzare la piastra entro 1 settimana). </li><li> Rimuovere delicatamente le LCS con una pipetta Pasteur, senza peruching la superficie rivestita e aggiungere 2 ml di mTeSR1 mezzo ad un pozzetto. </li><li> Riscaldare tutte le soluzioni di coltura (inclusi D-PBS) in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 25 min. </li><li> Convertire colonie HPSC a NCM <ol><li> Dissociare aggregati cellulari alle celle singole con Accutase come descritto nel protocollo 2. </li><li> Seme circa 1,3-2 x 10 6 hPSCs in uno LN-521 rivestita di (1,4-2,1 x 10 5 cellule / cm 2) senza la presenza di inibitori ROCK. </li><li> Cambiare mezzo al giorno per 3-4 giorni. </li><li> Dissociare le cellule in 1 ml di Accutase al giorno 3 o 4 per il prossimo passaging cellulare utilizzando un 1 a 3 rapporto di splittaggio. </li></ol></li></ol> . 6 Protocollo 5: NCM cultura per il plasmide DNA Transfezione <ol><li> Adattare le colonie HPSC alla cultura NCM come descritto nei protocolli 2-4. </li><li> Piatto dissociata hPSCs a 12-pozzetti con una densità cellulare di 7,5 x 10 5 cellule / pozzetto in mTeSR1 medio in presenza di 10 mM Y-27632. </li><li> Sostituire mTeSR1 media con drug-free mTeSR1 medio tra 4-8 ore dopo la placcatura le cellule. </li><li> Per ogni trasfezione, diluire 2,5 mg di plasmidi di espressione (ad esempio, pmaxGFP) e 5 ml di Lipofectamine 2000 in provette Eppendorf separati in 125 ml ciascuna di Opti-MEM Ridotto Serum Medium. </li><li> Dopo 5 min, miscelare i reagenti diluito e incubare per 20 min a temperatura ambiente (per formare complessi trasfezione). </li><li> Aggiungere 250 microlitri complessi trasfezione per ciascun pozzetto contenente hPSCs in 1 ml mTeSR1 medio e incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 per 24 ore. </li><li> Esaminare l&#39;efficienza di trasfezione sotto un microscopio a fluorescenza e fotografia casualmente per il calcolo della effettiva efficienza di trasfezione. </li></ol> . 7 Protocollo 6: NCM cultura per trasfezione di microRNA <ol><li> Dissociare hPSCs semi-confluenti al giorno 2 in condizioni NCM con l&#39;aggiunta di 1 ml di Accutase per pozzetto in 6<html> -Pozzetti. </li><li> Aggiungere 10 ml di mTeSR1 mezzo per diluire le reazioni enzimatiche e centrifugare a 200 xg per 5 min. </li><li> Risospendere il pellet cellulare con mTeSR1 medio, seminare le cellule ad una densità di 7,5 x 10 5 cellule per pozzetto in una piastra 12 pozzetti in mTeSR1 terreno contenente 10 mM Y-27632, e lasciare che le cellule attaccano per 4 ore. </li><li> Sostituire il mezzo con Y27632-libera mTeSR1 medie. </li><li> Utilizzare disponibili in commercio microRNA (ad esempio, un non-targeting miRIDIAN miRNA Transfezione controllo etichettato con Dy547). Titolare concentrazioni che vanno 0-160 nM utilizzando i reagenti forniti e seguire le istruzioni del produttore. </li><li> Ottimizzare l&#39;efficienza di trasfezione per ciascuna concentrazione in linee HPSC dal imaging di fluorescenza Dy547 delle cellule vive sotto un microscopio a 24 ore dopo la trasfezione. </li><li> Calcolare le efficienze di trasfezione in base alla percentuale di cellule positive Dy547 su tutte le cellule impressi. </li></ol>. tle &quot;&gt; 8 Protocollo 7: NCM cultura per la trasduzione di vettori lentivirali <ol><li> Ripetere i passaggi 7,1-7,4 del protocollo 6. </li><li> Calcolare la quantità di particelle virali da utilizzare per la trasduzione: Utilizzare la seguente formula: TU = (MOI x CN) / VT, mentre TU indica il numero totale di unità di trasformazione, MOI è uguale alla molteplicità desiderato di infezione nel pozzo (MOI o TU / cell), CN specifica il numero di celle in ogni bene, e VT indica archivi titoli virali (TU / ml). Ad esempio, dato che i titoli azionari virali per SMART-shRNA vettore è uguale a 1 x 10 9 TU / ml (unità di trasformazione per ml), 7,5 x 10 5 cellule per pozzetto al momento della trasduzione e un MOI previsto di 20: utilizzare 15 microlitri delle particelle virali di archivi per ogni bene (nota: questa condizione è raccomandato per l&#39;induzione lentivirali transitorio). </li><li> Pre-riscaldare 300 ml di mTeSR1 medio con 10 mg / ml di polibrene per 30 min. </li><li> Aggiungere 15 ml di archivi particelle virali inil mezzo mTeSR1 pre-riscaldato contenente polibrene e mescolare delicatamente la soluzione. </li><li> Sostituire il mezzo di coltura cellulare con 300 ml di mezzo preriscaldata contenenti particelle virali. </li><li> Dopo 4 ore di incubazione, esaminare turboGFP fluorescenza (un creatore di espressione shRNA) per determinare l&#39;efficienza di trasduzione. </li><li> Aggiungere 300 ml di ulteriore mezzo mTeSR1 alla trasduzione bene quando le cellule iniziano a esprimere turboGFP. </li><li> Dopo 12-16 ore di incubazione, riesaminare l&#39;espressione turbo-GFP. </li><li> Effettuare esperimenti di follow-up desiderati con queste cellule trasdotte entro 72 ore. </li></ol>

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<li>Domogatskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversity+of+laminins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional diversity of laminins.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).</li>
<li>Liew, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells+in+serum+and+feeder-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media.</a> Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5, 389-392 (2008).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ci sono due modi principali per hPSCs coltura in vitro: coltura convenzionale colonia-tipo (di celle alimentatori o matrici extracellulari) e cultura sospensione delle hPSCs gli aggregati senza alimentatori 6. Le limitazioni di entrambi colonia-tipo e sospensione metodi di coltura comprendono eterogeneità accumulati e cambiamenti epigenetici ereditabili. Cultura NCM, sulla base sia passaging singola cellula e cellula placcatura ad alta densità, rappresenta un nuovo metodo di coltura per la crescita H...

La capacità di hPSCs di differenziare verso tessuti adulti multilineage ha aperto nuove strade alla cura dei pazienti che soffrono di malattie gravi che coinvolgono cardiovascolare, epatico, pancreatico e sistemi neurologici 1-4. Vari tipi di cellule derivate da hPSCs sarebbe anche fornire piattaforme cellulari robuste per la modellazione della malattia, l&#39;ingegneria genetica, screening di farmaci e test tossicologici 1,4. La questione chiave che assicura loro applicazioni cliniche e farmacologiche futuri è la generazione di un gran numero di hPSCs clinico-grade in coltura cellulare in vitro. Tuttavia, i sistemi di coltura attuali sono insufficienti o intrinsecamente variabile, che coinvolge vari alimentazione e senza alimentatore culture del hPSCs come colonie 5,6. Colony-tipo crescita delle quote hPSCs molte caratteristiche strutturali della massa cellulare interna (ICM) di embrioni di mammiferi. L&#39;ICM è incline a differenziarsi in tre strati germinaliin un ambiente multicellulare causa dell&#39;esistenza di gradienti di segnalazione eterogenei. Pertanto, l&#39;acquisizione di eterogeneità in sviluppo embrionale precoce è considerata come un processo necessario per la differenziazione, ma una caratteristica indesiderata della cultura HPSC. L&#39;eterogeneità nella cultura HPSC è spesso indotto da eccessivi segnali apoptotici e differenziazione spontanea a causa di condizioni di crescita ottimali. Così, in colonia-tipo coltura, le cellule eterogenee si osservano spesso nella periferia delle colonie 7,8. È stato anche dimostrato che le cellule in cellule staminali embrionali umane (hESC) Colonie risposte differenziali Esporre a molecole di segnalazione come BMP-4 9. Inoltre, metodi di coltura colonia producono produzioni di cellule basse così come i tassi di recupero molto bassi cellulare da crioconservazione a causa di tassi di crescita incontrollabili e segnale apoptotico Percorsi di 6,9. Negli ultimi anni, diverse culture sospensioni sono state sviluppate per hPSCs coltura, soprattarly per l&#39;espansione di grandi quantità di hPSCs in-e alimentatore condizioni prive di matrice 6,10-13. Ovviamente, diversi sistemi di coltura hanno i loro vantaggi e svantaggi. In generale, l&#39;eterogeneità hPSCs rappresenta uno dei principali inconvenienti di tipo colonia e cultura aggregato metodi, che sono ottimali per la consegna di DNA e RNA materiali in hPSCs per l&#39;ingegneria genetica 6. Chiaramente, vi è la necessità imperativa di sviluppare nuovi sistemi che aggirano alcune carenze delle attuali metodi di coltura. Le scoperte di piccoli inibitori della molecola (come l&#39;inibitore ROCK Y-27632 e JAK inibitore 1) che migliorano la sopravvivenza a cella singola spianare la strada per dissociato-HPSC cultura 14,15. Con l&#39;uso di queste piccole molecole, abbiamo recentemente sviluppato un metodo di coltura in base al tipo non-colonia (NCM) crescita di dissociate-hPSCs 9. Questo metodo di coltura romanzo combina passaging cella singola e ad alta densitàplaccatura metodi, che ci permette di produrre grandi quantità di hPSCs omogenee sotto cicli di crescita costante senza grandi anomalie cromosomiche 9. In alternativa, cultura NCM potrebbe essere implementato con diverse piccole molecole e matrici definite (quale laminine) al fine di ottimizzare il metodo di coltura per le applicazioni di larghezza. Qui vi presentiamo diversi protocolli dettagliati basato sulla cultura NCM e delineare le procedure dettagliate per l&#39;ingegneria genetica. Per dimostrare la versatilità dei protocolli di NCM, abbiamo provato anche la cultura NCM con inibitori ROCK diversi e con il singolo laminina isoforma 521 (vale a dire, LN-521).

<table><tbody><tr><td>Contacellule automatizzato Countess</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>C10227</td><td>Conteggio automatico delle cellule</td></tr><tr><td>Sistema a raggi X Faxitron Cabinet</td><td>Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL&nbsp;</td><td>Modello RX-650</td><td>Irradiazione a raggi X di MEF,</td></tr><tr><td>piastre MULTIWELL a 6 pozzetti</td>, <td>Becton Dickinson, Labware</td><td>353046</td>, <td>piastre in polistirene</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen, Inc.</td><td>11965&ndash; 092</td><td>Per MEF medio</td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Roche</td><td>107409</td><td>Inibitore mitotico</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>25300-054</td><td>Per dissociazione MEF</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11330&ndash; 032</td><td>Per il terreno hPSC</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Siero ridotto</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>31985-062</td><td>Per la trasfezione hPSC</td></tr><tr><td>FBS inattivato a caldo</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>16000&ndash; 044</td><td>Componente del</td></tr><tr><td>siero di ricambio MEF medium Knockout</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>10828&ndash; 028</td><td>KSR, Componente del fluido hPSC</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>14190-144</td><td>D-PBS, privo di Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Invitrogen</td><td>11140&ndash; 050</td><td>NEAA, componente del medio hPSC</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>25030&ndash; 081</td><td>Componente del mezzo hPSC</td></tr><tr><td>mTeSR1 & Integratori</td><td>StemCell Technologies</td><td>5850</td><td>TeSR2 senza proteine animali</td></tr><tr><td>& Integratori</td><td>StemCell Technologies</td><td>5860</td><td>Terreno privo di xeno</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M7522</td><td>Componente di hPSC medium</td></tr><tr><td> MEF (CF-1) ATCC</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)&nbsp;</td><td>SCRC-1040</td><td>Per la coltura in feeder di hPSC</td></tr><tr><td>qualificata per hESC Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354277</td><td>Per la coltura senza feeder di hPSC</td></tr><tr><td>Laminina-521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td>Proteina ricombinante umana</td></tr><tr><td>FGF-2 (FGF ricombinante, basica)</td><td>R& D Systems, MN</td><td>223-FB</td><td>Fattore di crescita nel mezzo hPSC</td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT-104</td><td>1X soluzione enzimatica mista</td></tr><tr><td>Inibitore JAK I</td><td>EMD4 Biosciences</td><td>420099</td><td>Un inibitore della Janus chinasi</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>EMD4 Biosciences</td><td>688000</td><td>Inibitore ROCK</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td>Inibitore ROCK</td></tr><tr><td>Y-39983</td><td>Stemgent</td><td>04-0029</td><td>Inibitore ROCK I</td></tr><tr><td>Fenilbenzodioxano</td><td>Stemgent</td><td>04-0030</td><td>Inibitore ROCK II</td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>Un nuovo inibitore ROCK</td></tr><tr><td>BD Falcon Cell Strainer</td><td>BD Bioscience</td><td>352340</td><td>40 &micro; filtro per cellule m</td></tr><tr><td>Nalgene 5100-0001 Cryo 1 C</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>C6516F-1</td><td>"Il signor Frosty" Contenitore di congelamento</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11668-027</td><td>Reagenti di trasfezione</td></tr><tr><td>DharmaFECT Duo</td><td>Thermo Scientific</td><td>T-2010-02</td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>MiRIDIAN non mirato Controllo di trasfezione miRNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>IP-004500-01-05</td><td>Marcato con Dy547, per monitorare la consegna di microRNA&nbsp;</td></tr><tr><td>SMART-shRNA</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Da determinare</td><td>Vettore lentivirale</td></tr><tr><td>pmaxGFP</td><td>amaxa Inc (Lonza)</td><td>Incluso in ogni kit di trasfezione</td><td>Plasmide di espressione per il controllo della trasfezione</td></tr><tr><td>Oct-4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-5279</td><td>IgG2b di topo, marcatore pluripotente</td></tr><tr><td>SSEA-1</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21702</td><td>IgM di topo, marcatore di differenziazione</td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>sc-21704</td><td>Topo IgG3, marcatore pluripotente</td></tr><tr><td>Tra-1-60</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>sc-21705&nbsp;</td><td>IgM di topo, marcatore pluripotente</td></tr><tr><td>Tra-1-81</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21706</td><td>IgM di topo, marcatore pluripotente</td></tr><tr><td>CK8 (C51)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8020</td><td>IgG1 di topo, contro la citocheratina 8</td></tr><tr><td>&alfa;-fetoproteina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8399</td><td>AFP, IgG2a di topo</td></tr><tr><td>HNF-3&beta; (P-19)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9187</td><td>FOXA2, anticorpo policlonale di capra</td></tr><tr><td>Troponina T (Av-1)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-295-P0</td><td>Mouse IgG1</td></tr><tr><td>Desmin</td><td>Thermo Scientific</td><td>RB-9014-P1</td><td>IgG di coniglio</td></tr><tr><td>Anti-NANOG</td><td>ReproCELL Inc, Giappone</td><td>RCAB0004P-F</td><td>Anticorpo policlonale&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-GFAP di ratto</td><td>Zymed</td><td>13-0300</td><td>Proteina acida fibrillare gliale</td></tr><tr><td>Albumina (clone HSA1/25.1.3)</td><td>Cedarlane Laboratories Ltd.</td><td>CL2513A</td><td>IgG1 di topo</td></tr><tr><td>Actina muscolare liscia (clone 1A4)</td><td>DakoCytomation Inc</td><td>IR611/IS611</td><td>IgG2a di topo</td></tr><tr><td>Nestina</td><td>Chemicon International</td><td>MAB5326</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio</td></tr><tr><td>TUBB3</td><td>Convance Inc</td><td>MMS-435P</td><td>Tuj1, IgG2a di topo</td></tr><tr><td>HNF4&alpha; (C11F12)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>3113</td><td>Anticorpo monoclonale di coniglio</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (soluzione)</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>15710</td><td>PFA, fissativo, diluito in D-PBS</td></tr></tbody></table>

le colture per pluripotenti umane alternative staminali produzione di celle, manutenzione e analisi genetica

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono molto promettenti per la medicina rigenerativa e le applicazioni biofarmaceutiche. Attualmente, la coltura ottimale e l'espansione efficiente di grandi quantità di hPSC di livello clinico sono questioni critiche nelle terapie basate su hPSC. Convenzionalmente, le hPSC si propagano come colonie sia su sistemi di coltura feeder che feeder-free. Tuttavia, questi metodi presentano diverse limitazioni importanti, tra cui una bassa resa cellulare e la generazione di cellule eterogeneamente differenziate. Per migliorare gli attuali metodi di coltura di hPSC, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo metodo, che si basa sulla coltura di monostrato di tipo non colonico (NCM) di singole cellule dissociate. Qui, presentiamo protocolli NCM dettagliati basati sull'inibitore della chinasi associata Rho (ROCK) Y-27632. Forniamo anche nuove informazioni sulla coltura di NCM con diverse piccole molecole come l'Y-39983 (inibitore di ROCK I), il fenilbenzodiossano (inibitore di ROCK II) e la tiazovicina (un nuovo inibitore di ROCK). Estendiamo ulteriormente il nostro protocollo di base per coltivare hPSC su proteine extracellulari definite come l'isoforma 521 della laminina (LN-521) senza l'uso di inibitori ROCK. Inoltre, sulla base della NCM, abbiamo dimostrato l'efficiente trasfezione o trasduzione di DNA plasmidico, particelle lentivirali e microRNA basati su oligonucleotidi in hPSC al fine di modificare geneticamente queste cellule per analisi molecolari e scoperta di farmaci. I metodi basati su NCM superano le principali carenze della coltura di tipo colonia e quindi possono essere adatti per produrre grandi quantità di hPSC omogenee per future terapie cliniche, ricerca sulle cellule staminali e scoperta di farmaci.

Uno schema generale della cultura NCM Figura 1 rappresenta un tipico schema cultura NCM indica le variazioni dinamiche di hPSCs dopo alta densità di placcatura unicellulare in presenza dell&#39;inibitore ROCK Y-27632. Questi cambiamenti morfologici includono connessioni intercellulari dopo la placcatura, la formazione di cluster cellulari, e la crescita cellulare esponenziale seguita da condensazione cella (Figura 1A). Un esperimento rappres...

Qui, presentiamo protocolli di coltura di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), basati sulla crescita di singole cellule dissociate in monostrato (NCM) di tipo non coloniale. Questo nuovo metodo, che utilizza inibitori della chinasi Rho-associati o l'isoforma 521 della laminina (LN-521), è adatto per la produzione di grandi quantità di hPSC omogenee, la manipolazione genetica e la scoperta di farmaci.

Le colture per pluripotenti umane alternative staminali produzione di celle, manutenzione e analisi genetica

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

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Biologia

Questo protocollo dimostra come mantenere sani, indifferenziate staminali embrionali umane (ES) cellule.

Cultura e manutenzione di cellule staminali embrionali umane

Il protocollo seguente fornisce istruzioni per l'adattamento umano staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule di alimentazione priva di cultura con completo alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut medio (KSR-FF). Una volta adattato, istruzioni per la manutenzione costante sono anche previste.

Alimentatore-Free adattamento, la cultura e Passaging di cellule IPS utilizzando Completa alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut Media

I protocolli descritti consentono ai laboratori di eseguire colture di cellule staminali scalabili e aderenti ad alta produttività con un costo minimo di manodopera, esperienza e investimento in attrezzature utilizzando un robot programmabile per la manipolazione dei liquidi e piastre da 96 pozzetti.  Le iPSC sono passate più di 20 volte su questo sistema, hanno mantenuto la pluripotenza, cariotipi normali e si sono differenziate in cardiomiociti.

Scalabile piastra a 96 pozzetti Based iPSC cultura e di produzione utilizzando un sistema robotico Liquid Handling

Questo protocollo fornisce un modo semplice ed efficiente per propagare le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) utilizzando solo terreni condizionati derivati dalla placenta umana in un piatto rivestito di gelatina senza ulteriori supplementazioni esogene o substrati sintetici specifici per hPSC.

A Novel cultura Modello pluripotenti staminali umane propagazione delle cellule su Gelatina in Media Placenta condizionata

Ecco un protocollo per far crescere cellule staminali pluripotenti (PSC) e cellule staminali neurali (NSC) in un sistema di coltura cellulare chiuso che consente la massima sterilità e riproducibilità, sostituendo la tradizionale cappa di biosicurezza e l'incubatore. Questa apparecchiatura è conforme alle linee guida sulle buone pratiche cliniche di fabbricazione (cGMP) e sulle buone pratiche cliniche di laboratorio (cGLP).

Coltura umane pluripotenti e neurali cellule staminali in un sistema di coltura cellulare chiuso per base e preclinica di ricerca

La caratterizzazione regolare delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), per accertare il mantenimento del loro stato pluripotente, è un passo importante prima che queste cellule vengano utilizzate per altre applicazioni. Qui descriviamo un metodo per la propagazione su piccola scala di iPSC umane specificamente progettato per consentire la loro facile e routinaria caratterizzazione tramite immunocitochimica.

Propagazione in piccola scala di iPSCs umano in siero-liberi Condizioni di routine Caratterizzazione immunocitochimica

Una robusta derivazione di cellule pluripotenti indotte da humano (hiPS) è stata ottenuta utilizzando riprogrammazione mediata dei fibroblasti dermici da virus Sendai (SeV) non integrante. La manutenzione delle cellule hiPS e l'espansione clonale sono state eseguite usando condizioni di coltura xeno-free e chimicamente definite con matrice umana laminina 521 (LN-521) e Essential E8 (E8) Medium ricombinante.

Derivazione libera dell&#39;integrazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo usando la matrice Laminina 521

Vi presentiamo un protocollo per la reversione chimica efficiente, alla rinfusa e rapida delle cellule staminali pluripotenti umane lignaggio-innescato convenzionale (hPSC) in uno stato di preimpianto epiblasto-come pluripotenti ingenuo epigenomically-stable. Questo metodo provoca l'espressione genica in diminuzione di lignaggio-innescato e miglioramento notevole nella differenziazione multilineare diretto attraverso un vasto repertorio di hPSC convenzionali linee.

Reversione chimica delle cellule staminali pluripotenti umane convenzionali a uno stato ingenuo-simile con una migliore differenziazione di Multilineage potenza

Per evitare le limitazioni associate al passaggio enzimatico o meccanico di cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) coltivate su cellule feeder, abbiamo stabilito un metodo rapido, efficace, economico e ad alto rendimento per la raccolta di colonie hESC o hiPSC mantenute su uno strato di cellule feeder di fibroblasti prepuzi umani utilizzando la disadesione mediata da EDTA.

Passaggio rapido, economico e privo di enzimi di cellule staminali pluripotenti umane su cellule nutritrici mediante disadesione mediata dall'acido etilendiamminotetraacetico

Qui presentiamo un protocollo per un sistema di coltura cellulare automatizzato. Questo sistema di coltura automatizzato riduce il lavoro e avvantaggia gli utenti, compresi i ricercatori che non hanno familiarità con la manipolazione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), dal mantenimento delle cellule iPS alla differenziazione in vari tipi di cellule.

Un sistema di coltura automatizzato per il mantenimento e la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Impara a coltivare cellule staminali pluripotenti umane con il metodo NCM utilizzando inibitori ROCK e laminina-521. Questo protocollo garantisce popolazioni omogenee per la manipolazione genetica e la scoperta di farmaci.

Le colture per pluripotenti umane alternative staminali produzione di celle, manutenzione e analisi genetica

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