Name: Two-Photon In vivo Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Scopri l'imaging in vivo a due fotoni delle spine dendritiche nella corteccia del mouse utilizzando una preparazione con teschio assottigliato. Questo metodo consente di tracciare la dinamica sinaptica nel tempo.

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Ringraziamo James Perna per l&#39;illustrazione grafica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institute of Mental Health a YZ

Approvazione deve essere ottenuto da istituti d&#39;origine prima dell&#39;inizio della chirurgia e studio di imaging. Esperimenti descritti in questo manoscritto sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti della University of California, Santa Cruz Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa. 1. Chirurgia <ol><li> Sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici e sterilizzare l&#39;area di lavoro con il 70% di alcol accuratamente prima di un intervento chirurgico. </li><li> Anestetizzare il mouse intraperitoneale (IP) iniezione di soluzione anestetica KX (200 mg / ketamina kg e 20 mg / kg xilazina) in base al peso corporeo del topo. Nota: KX dosaggio può essere regolato a seconda del ceppo, età e lo stato di salute dei topi. Si raccomanda inoltre la consultazione veterinario per determinare la dose ottimale. </li><li> Eseguire un test toe-pinch periodicamente premendo le dita dei piedi del topo e di controllo per una risposta riflessiva per monitorare lo stato di anestesia.Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato prima di iniziare l&#39;intervento. Nota: Durante le sessioni di imaging prolungati, controllare lo stato di anestesia del topo periodicamente, amministrare ulteriore KX, se necessario. </li><li> Posizionare il mouse su una piastra elettrica per mantenere la temperatura corporea durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Radere la testa del mouse usando una lama di rasoio per esporre il cuoio capelluto. </li><li> Sterilizzare l&#39;area rasata pulendo la pelle con alternanza di tamponi imbevuti di alcool e Betadine. Rimuovere eventuali ritagli di capelli residui. </li><li> Applicare delicatamente unguento occhio per lubrificare entrambi gli occhi, impedendo quindi danni permanenti causati dalla disidratazione durante l&#39;esperimento. </li><li> Effettuare una incisione retta lungo la linea mediana del cuoio capelluto, e spostare la pelle lateralmente verso i bordi del cranio. </li><li> Rimuovere il tessuto connettivo attaccato al cranio. </li></ol> 2. Diluito cranio-Preparazione <ol><li> Identificare la regione di imaging basato su ster. coordinate eotaxic Nota: Cercate di evitare grandi vasi sanguigni, che la penetrazione della luce di blocco e sfocare le strutture imaged. Vascolare è meglio osservata quando il cranio è umido con soluzione salina sterile. </li><li> Utilizzare il micro drill ad alta velocità per assottigliare una regione circolare del cranio (diametro 0,5-1,0 mm). Spostare il trapano parallelo alla superficie del cranio, piuttosto che tenendolo contro il cranio e premendo verso il basso. Drill fino a quando sia lo strato di osso compatto esterno e lo strato di osso spugnoso centrale vengono rimossi. Nota: Per prevenire i danni causati da surriscaldamento, evitare il contatto prolungato tra la punta e il cranio. </li><li> Continua assottigliamento dello strato di osso compatto interno con una lama microchirurgico nel centro della regione drill-assottigliato. Tenere la lama microchirurgico ad un angolo di circa 45 ° per raschiare il cranio senza premere contro il cranio finché un uniformemente diluiti piccola regione (200-300 micron di diametro) con uno spessore di approssimativaly 20-30 micron si ottiene. A causa della auto-fluorescenza del cranio, lo spessore può essere misurata attraverso la scansione la distanza tra la superficie superiore e inferiore del cranio sotto il microscopio a due fotoni. Nota: sebbene uno spessore cranio di meno di 20 micron fornisce una buona qualità delle immagini, non è consigliabile perché rende il processo di diradamento in sessioni di re-imaging successive difficile. Per evitare un eccessivo diradamento, lo spessore del cranio deve essere controllata periodicamente durante l&#39;intervento chirurgico (vedi Discussione). </li></ol> 3. Immobilizzazione <ol><li> Rimuovere con cautela detriti ossei. </li><li> Mettere una piccola goccia di colla cianoacrilato su ciascun bordo dell&#39;apertura centro della piastra di testa sterile, che è stato autoclavato (vedi Figura 1). Tenere la piastra di testa saldamente contro il cranio con la regione assottigliata situato nel centro dell&#39;apertura. Nota: Se la colla contamina il r assottigliataEgion per caso, rimuoverlo delicatamente con la lama microchirurgico. </li><li> Estrarre delicatamente la pelle dai lati del cranio ai bordi dell&#39;apertura centro della piastra di testa. </li><li> Attendere circa 10 minuti finché la piastra di testa è ben attaccato al cranio. </li><li> Posizionare la piastra di testa su due blocchi laterali della piastra di supporto e poi stringere le viti sui bordi della piastra di testa per immobilizzare il mouse sulla piastra di supporto (vedi Figura 1). Nota: Assicurarsi che non ci sia pelle o baffi tra la piastra di testa e blocchi prima di stringere le viti. Una buona preparazione immobilizzato dovrebbe mostrare alcun movimento osservabile del cranio al microscopio da dissezione quando la parte posteriore dell&#39;animale viene accarezzò delicatamente. </li><li> . Sciacquare il cranio esposto con soluzione fisiologica per rimuovere la colla non polimerizzato Nota: è importante per rimuovere eventuali residui di colla, come collante non polimerizzato offusca le immagini ei danni microscopio obiettivi &lt;./ Li&gt; </ol> 4. Imaging <ol><li> Prendere una foto del sistema vascolare del cranio esposta con la regione diluito mappa 1, che viene utilizzato per spostare la regione ripreso in sessioni di imaging successive (vedi Figura 2). </li><li> Posizionare il mouse sotto il microscopio imaging. Individuare la zona assottigliata sotto un obiettivo 10X aria usando epifluorescenza e spostare l&#39;area più sottile al centro della vista. </li><li> Aggiungere una goccia di soluzione salina sulla sommità del cranio e passare alla obiettivo 60X, sciacquato con acqua sterile. Seleziona una regione in cui le singole spine dendritiche sono chiaramente visualizzate lungo dendriti. Identificare ed etichettare la regione corrispondente Mappa 1 confrontando vascolare tra la vista epifluorescente e la foto vascolare. </li><li> Sintonizzare la lunghezza d&#39;onda del laser a due fotoni secondo i fluorofori. Per esempio, 920 nm per YFP; 890 nm per GFP; 1.000 nm per DsRed e tdTomato 24. </li><li> Acquisire pile di immagine con 2passi micron lungo l&#39;asse z usando l&#39;obiettivo 60X. Questo stack immagine copre circa 200 micron x 200 micron zona (512 x 512 pixel) e viene utilizzato come cartina 2 per trasferimento durante sessioni di imaging successive (vedi Figura 2). </li><li> Acquisire nove stack di immagini all&#39;interno Map 2 utilizzando lo zoom digitale 3X. Ogni stack immagine copre una superficie di circa 70 micron x 70 micron (512 x 512 pixel), con 0,7 micron passi lungo l&#39;asse z. Nota: L&#39;intensità del laser deve essere inferiore a 40 mW quando misurato a campioni di minimizzare fototossicità. </li></ol> 5. Recovery <ol><li> A seguito di imaging, staccare delicatamente la piastra di testa dal cranio. </li><li> Pulire accuratamente il cranio e la pelle per rimuovere tutti i residui di colla. Nota: Qualsiasi residuo di colla sulla pelle provoca irritazioni e rallentare la guarigione della pelle mentre l&#39;eventuale residuo di colla sul cranio causerà l&#39;erosione del cranio e di unngiogenesis nello strato osso appena cresciuti, rendendo il successivo riposizionamento e re-imaging difficile. </li><li> Sciacquare il cranio e la pelle con saline diverse volte. </li><li> Suturare il cuoio capelluto con sterile sutura chirurgica. </li><li> Tenere l&#39;animale su una piastra elettrica in una gabbia separata. Somministrare buprenorfina analgesico (0,1 mg / kg) per via sottocutanea per attenuare il dolore post-operatorio. Rispedire l&#39;animale verso la gabbia a casa dopo il pieno recupero. Monitorare l&#39;animale da vicino (controllare almeno una volta al giorno) fino a quando l&#39;incisione è guarita e punti di sutura vengono rimossi. Somministrare successive iniezioni di buprenorfina analgesico, se necessario. </li></ol> 6. Re-imaging <ol><li> Ripetere i passaggi 1,1-1,8. </li><li> Ripetere i passaggi 3,1-3,6 </li><li> Individuare regione già ripreso confrontando il pattern vascolare di Mappa 1 e il ramo modello dendritiche a Mappa 2. </li><li> Se reimaging viene effettuata entro 1 settimana, ripetere il passo 2.3 per rimuovere lo strato sottile di osso appena cresciuti in cima al re assottigliataregione con la lama microchirurgico. Se reimaging viene eseguita dopo più di 1 settimana, ripetere i passaggi sia 2.2 e 2.3. Nota: Lo strato osseo appena cresciuti costituito da una struttura meno condensata rispetto al livello originale osso compatto, con conseguente riduzione della qualità dell&#39;immagine. Pertanto, per acquisire la stessa qualità, è necessario sottile cranio leggermente superiore alla precedente sessione di imaging. </li><li> Regolare la posizione e l&#39;orientamento di ottenere pile di immagini con parametro precedentemente presi stack di immagini al microscopio a due fotoni. </li><li> Acquisire le immagini come al punto 4.6. </li><li> Ripetere i passaggi 5,1-5,5 dopo imaging. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Per ottenere un successo preparato assottigliato-teschio, diversi passaggi in questo protocollo sono cruciali. 1) Lo spessore del cranio. L&#39;osso cranico ha una struttura a sandwich, con due strati di alta densità dell&#39;osso compatto e uno strato intermedio di bassa densità dell&#39;osso spugnoso. Mentre il micro trapano ad alta velocità è adatto per rimuovere gli strati esterni di osso compatto e osso spugnoso, la lama microchirurgico è ideale per diluire lo strato interno di osso compatto. Poiché lo spessore e l...

La corteccia dei mammiferi partecipa a molte funzioni cerebrali, dalla percezione e il controllo del movimento per l&#39;elaborazione delle informazioni sensoriali astratta e cognizione. Varie funzioni corticali si basano sui diversi circuiti neurali, che sono costituiti da diversi tipi di neuroni che comunicano e scambiano informazioni su singole sinapsi. La struttura e la funzione delle sinapsi sono costantemente in corso di modifica in risposta alle esperienze e patologie. Nel cervello maturo, la plasticità sinaptica assume la forma di entrambe le modifiche di forza e l&#39;aggiunta / rimozione di sinapsi, che giocano un ruolo importante nella formazione e il mantenimento di un circuito neurale funzionale. Spine dendritiche sono le componenti postsinaptici della maggioranza delle sinapsi eccitatorie nel cervello dei mammiferi. Il fatturato costante e le variazioni morfologiche delle spine si crede per servire come un buon indicatore di modifiche nelle connessioni sinaptiche 1-7. Due fotoni scansione laser microscopia offre penetrazione profonda attraverso fitti, preparati opachi e bassa fototossicità, che lo rende adatto per l&#39;imaging dal vivo nel cervello intatto 8. In combinazione con marcatura fluorescente, imaging a due fotoni fornisce un potente strumento per sbirciare nel cervello vivente e seguire riorganizzazione strutturale a livello delle sinapsi individuali con alta risoluzione temporale e spaziale. Vari metodi sono stati utilizzati per preparare topi per l&#39;imaging dal vivo 9-13. Qui, descriviamo un preparato assottigliato-teschio in vivo di due fotoni imaging per studiare la plasticità strutturale postsinaptici spine dendritiche nella corteccia mouse. Usando questo approccio, i nostri studi recenti hanno rappresentato un quadro dinamico di cambiamenti spine dendritiche in risposta alle abilità motoria imparando Con la crescente disponibilità di animali transgenici con sottoinsiemi di neuroni fluorescente e rapido sviluppo di vivo tecniche in materia di etichettatura, procedure analoghe qui descritti possono essere applicati anche di indaginete altri tipi cellulari e regioni corticali, in combinazione con altre manipolazioni, così come utilizzato in modelli di malattia 16-23.

<table><tbody><tr><td>Ketamina</td><td>Bioniche Pharma</td><td>67457-034-10</td><td>Miscelato con xilazina per anestesia</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Lloyd laboratories</td><td>139-236</td><td>Miscelato con ketamina per anestesia</td></tr><tr><td>Soluzione salina</td><td>Hospira</td><td>0409-7983-09</td><td>0,9% NaCl per iniezione e imaging</td></tr><tr><td>Lame di rasoio</td><td>Microscopia elettronica scienze</td><td>72000</td><td>Lamette da barba in acciaio inossidabile a doppio taglio</td></tr><tr><td>Tamponi imbevuti di alcol</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-62</td><td>Tamponi sterili per la preparazione dell'alcol</td></tr><tr><td>Unguento per gli occhi</td><td>Henry Schein</td><td>102-9470</td><td>Unguento oftalmico Petrolatum lubrificante oculare sterile</td></tr> Micro <tr><td>trapano ad alta velocità</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td>Il micro trapano ad alta velocità è adatto per assottigliare lo strato esterno di osso compatto e mirare a una piccola area</td></tr><tr><td>Micro frese in acciaio</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-14</td> Lama microchirurgica <td>da 1,4 mm di diametro</td></tr><tr><td></td><td>Surgistar</td><td>6961</td><td>La lama microchirurgica è adatta per assottigliare lo strato interno di osso compatto e lo strato intermedio di osso spugnoso</td></tr><tr><td>Colla cianoacrilica</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9062131</td><td>Fissare la piastra della testa sul cranio</td></tr><tr><td>Sutura</td><td>Havard Apparato</td><td>510461</td><td>Sutura di seta sterile e non assorbente, 6-0 monofilamento</td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Olympus</td><td></td><td>SZ61</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Infinity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a due fotoni</td><td>Prairie Technologies</td><td></td><td>Ultima IV</td></tr><tr><td>10X obiettivo</td><td>Olympus</td><td></td><td>NA 0.30,</td></tr><tr><td>aria 60X obiettivo</td><td>Olympus</td><td></td><td>NA 1.1, IR permeabile,</td></tr><tr><td>immersione in acqua Laser Ti-zaffiro</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>Mai Tai HP</td></tr></tbody></table>

two-photon<em&gt; in vivo</em&gt; imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse uso un teschio diluito-preparazione

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Nella corteccia dei mammiferi, i neuroni formano reti estremamente complicate e scambiare informazioni a livello delle sinapsi. I cambiamenti della concentrazione sinaptica, nonché aggiunta / rimozione di sinapsi, si verificano in modo dipendente dall&#39;esperienza, fornendo la base strutturale di plasticità neuronale. Come componenti postsinaptici delle sinapsi più eccitatori nella corteccia, spine dendritiche sono considerati un buon indicatore di sinapsi. Prendendo vantaggi della genetica del topo e tecniche di etichettatura fluorescenti, i singoli neuroni e le loro strutture sinaptiche possono essere etichettati nel cervello intatto. Qui vi presentiamo un protocollo di imaging transcranica con due fotoni microscopia a scansione laser per seguire fluorescente post-sinaptici spine dendritiche nel tempo in vivo. Questo protocollo utilizza un preparato assottigliato-teschio, che mantiene il cranio intatto ed evita effetti infiammatori provocati dall&#39;esposizione delle meningi e la corteccia. Pertanto, le immagini possono essere acquisite subito dopo suviene eseguita rgery. La procedura sperimentale può essere eseguita ripetutamente su vari intervalli temporali da ore ad anni. L&#39;applicazione di questa preparazione può anche essere esteso per indagare diverse regioni corticali e strati, così come altri tipi di cellule, in condizioni fisiologiche e patologiche.

In YFP-H topi linea 25, proteina fluorescente gialla esprime in un sottoinsieme di neuroni piramidali strato V, che proiettano loro dendriti apicali agli strati superficiali della corteccia. Attraverso la preparazione assottigliato-teschio, i segmenti dendritiche fluorescente possono essere ripetutamente ripreso sotto il microscopio a due fotoni su vari intervalli di imaging, che vanno da ore a mesi. Qui mostriamo un esempio di rappresentazione quattro volte le stesse dendriti oltre 8 giorni in corteccia moto...

L'imaging time-lapse nell'animale vivente fornisce informazioni preziose sulla riorganizzazione strutturale nel cervello intatto. Qui, introduciamo una preparazione di cranio assottigliato che consente l'imaging transcranico di strutture sinaptiche marcate in fluorescenza nella corteccia di topo vivente mediante microscopia a due fotoni.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

L'obiettivo generale di questa procedura è consentire l'imaging transcranico, mediante microscopia a due fotoni, di strutture sinaptiche marcate con fluorescenza nella corteccia del topo vivo. Il primo passo, dopo l'anestesia del topo, consiste nell'eseguire una preparazione del cranio sottile. Successivamente, la testa del topo viene immobilizzata utilizzando una piastra di fissaggio su misura.Successivamente, gli stack di immagini vengono acquisiti attraverso il cranio assottigliato utilizzando la microscopia a due fotoni. In definitiva, riposizionando e acquisendo immagini della regione precedentemente analizzata, è stato possibile tracciare la dinamica degli spinosi dendritici in diversi periodi di tempo e sotto varie condizioni.Per prepararsi all'intervento chirurgico, anestetizzare un topo con chetamina e xilazina ed eseguire una compressione del dito del piede per verificare l'anestesia completa. Successivamente, posizionare il topo su un tappetino riscaldante e utilizzare una lametta per rasare la testa. Pulire la pelle con dischetti imbevuti di alcol in modo alternato per sterilizzare l'area rasata e rimuovere eventuali residui di peli tagliati.Inoltre, applicare delicatamente un unguento oftalmico su entrambi gli occhi. Successivamente, effettuare un'incisione dritta lungo la linea mediana del cuoio capelluto e spostare lateralmente la pelle verso i margini del cranio. Quindi rimuovere il tessuto connettivo aderente al cranio per iniziare la preparazione del cranio sottile.Per prima cosa, identificare la regione di imaging desiderata in base alla sua posizione relativa rispetto alla linea mediana e al bgma. Quindi inumidire il cranio con soluzione salina per osservare la vascolarizzazione, in modo da evitare di assottigliare il cranio in un'area con vasi sanguigni di grandi dimensioni, poiché questi ostacolano il passaggio della luce e sfocano le strutture dell'immagine. Una volta selezionata un'area dal diametro compreso tra 0,5 e un millimetro, utilizzare un micromotore ad alta velocità per assottigliare una regione circolare del cranio.Spostare il trapano parallelamente alla superficie del cranio, piuttosto che appoggiarlo contro il cranio e premere verso il basso, per evitare danni causati dal surriscaldamento. Evitare un contatto prolungato tra la punta del trapano e il cranio fino a quando non sono state rimossi sia lo strato osseo compatto esterno che lo strato osseo spugnoso intermedio. Successivamente, utilizzare una lama microchirurgica tenuta a circa 45 gradi per assottigliare lo strato osseo compatto interno al centro della regione assottigliata dal trapano.Scalpello il cranio senza premere contro di esso fino a ottenere una regione uniformemente sottile con un diametro compreso tra 200 e 300 micrometri e uno spessore di circa 20-30 micrometri. Una volta che il cranio è sufficientemente sottile, rimuovi con attenzione i detriti ossei. Il passaggio successivo consiste nell'attaccare la piastra cranica, realizzata con lamette da rasoio le cui bordature taglienti sono ricoperte da nastro adesivo.Iniziare applicando una piccola goccia di colla cianoacrilica su ciascun bordo dell'apertura centrale della piastra cranica. Quindi posizionare al centro la piastra sulla regione assottigliata. Tenerla saldamente premuta contro il cranio.Ora, tirare delicatamente la pelle dai lati del cranio verso i bordi dell'apertura centrale della piastra cranica. Tenere ferma la piastra cranica per uno o due minuti. Attendere quindi altri otto o nove minuti finché la piastra cranica non sarà ben aderente al cranio.Dopo 10 minuti, posizionare la piastra cranica sui due blocchi laterali della piastra di fissaggio. Successivamente, stringere le viti lungo i bordi della piastra cranica per immobilizzare il mouse sulla piastra di fissaggio. Osservare la testa del mouse attraverso un microscopio stereoscopico, tamponando delicatamente la schiena del mouse per accertarsi che la testa sia correttamente immobilizzata.Successivamente, risciacquare il cranio esposto con soluzione salina per rimuovere eventuali residui di colla non polimerizzata, al fine di ritrovare la regione precedentemente analizzata mediante imaging. Durante le sessioni successive di acquisizione delle immagini, scattare una foto della vascolarizzazione della zona assottigliata del cranio esposto, indicata come mappa uno. Quindi posizionare il topo sotto il microscopio per l'acquisizione delle immagini e individuare l'area assottigliata mediante l'obiettivo a immersione d'aria 10 x.Utilizzando la fluorescenza epi, posizionare l'area più sottile al centro del campo visivo. Aggiungere ora una goccia di soluzione salina sulla parte superiore del cranio e passare all'obiettivo 60x. Selezionare una regione in cui le spine dendritiche individuali siano chiaramente visibili lungo i dendriti.Identificare ed etichettare la regione corrispondente sulla mappa uno confrontando la vascolarizzazione tra la vista epifluorescente e la foto della vascolarizzazione. Successivamente, regolare la lunghezza d'onda del laser a due fotoni in base ai fluorocromi. Quindi, utilizzando l'obiettivo da 60x, acquisire stack di immagini con passi di due micrometri lungo l'asse Z, coprendo un'area di circa 200 micrometri per 200 micrometri.Questo è indicato come mappa due ed è utilizzato per riposizionare il segmento dendritico dell'immagine durante le sessioni di acquisizione successive. Acquisire ora nove stack di immagini all'interno della mappa due utilizzando un ingrandimento digitale 3x. Ogni stack di immagini copre un'area approssimativa di 70 micrometri per 70 micrometri con passi di 0,7 micrometri lungo l'asse Z.Dopo l'acquisizione delle immagini, staccare delicatamente la piastra cranica dal cranio. Successivamente, utilizzare una lama microchirurgica per rimuovere la colla residua dal cranio. Quindi risciacquare più volte il cranio e la cute con soluzione fisiologica e suturare il cuoio capelluto con suture chirurgiche sterili.Durante il recupero, mantenere l'animale su un tappetino riscaldante in una gabbia separata e somministrare analgesico a base di buprenorfina per via sottocutanea per il dolore postoperatorio. Dopo il completo recupero, restituire l'animale alla gabbia di provenienza. Per reimaging delle dendriti in un altro giorno, anestetizzare l'animale ed esporre il cranio. Come in precedenza, ripetere l'immobilizzazione della testa montando la piastra cranica e fissandola alla piastra di sostegno.Quindi localizzare la regione precedentemente immaginata confrontando il pattern della vascolarizzazione con la mappa uno e il pattern dei rami dendritici con la mappa due. Se la reimaging viene eseguita entro una settimana, lo strato sottile di osso neoformato può essere rimosso con una lama microchirurgica. Se la reimaging viene eseguita dopo più di una settimana, utilizzare prima il microtrapano, quindi la lama microchirurgica per assottigliare il cranio.Ora regolare la posizione e l'orientamento sotto il microscopio a due fotoni per ottenere stack di immagini che corrispondano agli stack di immagini acquisiti in precedenza. Dopo l'acquisizione delle immagini, permettere al topo di riprendersi e riposizionarlo nella gabbia come in precedenza; un'immagine del pattern vascolare circostante l'area del cranio sottile, designata come mappa uno, viene utilizzata come riferimento per tutte le successive sessioni di acquisizione. Il riquadro nero indica la regione in cui sono state acquisite le immagini in vivo a due fotoni.Questa immagine dei rami dendritici nella corteccia motoria di un topo di un mese è designata come mappa due. Il riquadro bianco mostra il segmento dendritico selezionato per l'acquisizione di immagini. Nel tempo, l'acquisizione di immagini mediante microscopia a due fotoni dello stesso segmento dendritico è stata eseguita al giorno zero, al giorno due, al giorno quattro e al giorno otto.Spine appena formate, ovvero spine che non erano presenti nella precedente sessione di imaging, sono indicate da puntine a freccia; le spine eliminate tra le sessioni di imaging sono indicate dalle frecce. I Philip Podia sono indicati con stelle una volta padroneggiati.Questa tecnica può essere eseguita in uno o due ore se viene effettuata correttamente.

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In questo materiale video e supplementare, mostriamo un protocollo per la...

Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

Presentiamo un metodo per formare una finestra di imaging nel cranio topo che si estende millimetri ed è stabile per mesi senza infiammazione cerebrale. Questo metodo è adatto per studi longitudinali di flusso sanguigno, dinamica cellulare, e cellule / struttura vascolare con microscopia a due fotoni.

Un lucido e rinforzato Assottigliato cranio-Window a lungo termine Imaging del cervello di topo

Grazie alla combinazione di un lucido e rafforzata sottile cranio (porte) cranica finestra e il glioblastoma (GBM) l'iniezione di cellule, possiamo osservare l'inizio glioma e la crescita di cellule di GBM iniettate nel cervello di un topo vivo longitudinalmente.

Imaging Glioma Iniziazione<em&gt; In Vivo</em&gt; Attraverso un lucido e sottile rinforzato cranio finestra craniale

Fonte: Pekarek, B. T., et. al., Imaging e quantificazione di dendriti neuronali intatti tramite CLARITY Tissue Clearing. (2021)In questo video, dimostriamo la preparazione, l'imaging e l'analisi di un cervello di topo ripulito per esaminare gli arbori dendritici, la morfologia della colonna vertebrale e la distribuzione neuronale utilizzando la microscopia confocale e le tecniche di ricostruzione 3D.

Imaging al microscopio confocale di pergole dendritiche intatte e morfologia della colonna vertebrale in un cervello di topo pulito

Questo articolo descrive un protocollo di lavoro di immagine spine dendritiche di neuroni dell'ippocampo in vitro utilizzando Structured Illumination Microscopy (SIM). Microscopia super-risoluzione usando SIM fornisce risoluzione di immagine notevolmente oltre il limite di diffrazione della luce in tutte le tre dimensioni spaziali, permettendo l'imaging di singole spine dendritiche con maggiore dettaglio.

Imaging spine dendritiche di Rat Primaria neuroni dell&#39;ippocampo utilizzando Structured Illumination Microscopy

Questo video mostra la procedura di craniotomia che consente l'imaging cronico dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo nella linea transgenica Thy1-GFP. Questo approccio è combinato con l'iniezione di virus adeno-associato che esprime mCherry nell'ippocampo dorsale. Queste tecniche consentono il monitoraggio a lungo termine della plasticità strutturale dipendente dall'esperienza in RSC.

Simultanea a due fotoni<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

Questo metodo descrive una preparazione cronica che consente l'accesso ottico all'ippocampo di topi viventi. Questa preparazione può essere utilizzata per eseguire l'imaging ottico longitudinale della plasticità strutturale neuronale e della plasticità cellulare evocata dall'attività per un periodo di diverse settimane.

Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi

La microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) viene applicata per l'immagine e l'analisi delle spine dendritiche nell'ippocampo murino.

Microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) per lo studio delle spine dendritiche

Qui, descriviamo un protocollo che combina l'iniezione di virus adeno-associato con l'impianto di finestre craniche per l'imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale nei topi svegli.

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli

Questo protocollo contiene una descrizione dettagliata di un approccio passo dopo passo per un modello murino a finestra cranica cronica e embolia microvascolare, ottimizzato per la microscopia a due fotoni in vivo utilizzando microsfere fluorescenti al polistirene.

Modello murino per embolia microvascolare per microscopia a due fotoni in vivo utilizzando microsfere fluorescenti di polistirene

Scopri l'imaging in vivo a due fotoni delle spine dendritiche nella corteccia del mouse utilizzando una preparazione con teschio assottigliato. Questo metodo consente di tracciare la dinamica sinaptica nel tempo.

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