Two-Photon In vivo Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di consentire l'imaging transcranico, una struttura sinaptica marcata in fluorescenza nella corteccia del topo vivente mediante microscopia a due fotoni. Il primo passo dopo l'anestetizzazione del topo è eseguire una preparazione del cranio assottigliato. Successivamente, la testa del mouse viene immobilizzata utilizzando una piastra di supporto su misura.

Quindi le pile di immagini vengono acquisite attraverso il cranio assottigliato utilizzando la microscopia a due fotoni. In definitiva, il trasferimento e l'imaging. La regione precedentemente ripresa ha permesso di tracciare la dinamica delle spine dendritiche in diversi periodi di tempo in varie condizioni.

Per prepararsi all'intervento chirurgico, anestetizzare un topo con ketamina e xilazina ed eseguire un pizzicamento delle dita dei piedi per garantire un'anestesia completa. Quindi posiziona il mouse su un termoforo e usa una lama di rasoio per radere la testa. Pulire la pelle con tamponi imbevuti di alcol alternati per sterilizzare l'area rasata e rimuovere eventuali residui di ritagli di capelli.

Inoltre, applica delicatamente l'unguento per gli occhi su entrambi gli occhi. Quindi, praticare un'incisione diritta lungo la linea mediana del cuoio capelluto e spostare la pelle lateralmente verso i bordi del cranio. Quindi rimuovere il tessuto connettivo attaccato al cranio per iniziare la preparazione del cranio assottigliato.

Innanzitutto, identifica la regione di imaging desiderata in base alla sua posizione relativa alla linea mediana e al bgma. Quindi inumidire il cranio con soluzione fisiologica per osservare la vascolarizzazione in modo da evitare di assottigliare il cranio in un'area con grandi vasi sanguigni poiché bloccano la penetrazione della luce e offuscano le strutture dell'immagine. Una volta selezionata un'area di diametro compreso tra 0,5 e un millimetro, utilizzare un micro trapano ad alta velocità per assottigliare una regione circolare del cranio.

Muovi il trapano parallelamente alla superficie del cranio piuttosto che tenerlo contro il cranio e premere verso il basso per evitare danni causati dal surriscaldamento. Evitare il contatto prolungato tra la punta del trapano e il trapano del cranio fino a quando non vengono rimossi sia lo strato osseo compatto esterno che lo strato osseo spugnoso centrale. Quindi, utilizzare una lama microchirurgica tenuta a circa 45 gradi per assottigliare lo strato osseo compatto interno al centro della regione assottigliata del trapano.

Raschiare il cranio senza premere contro il cranio fino ad ottenere una regione uniformemente assottigliata di 200-300 micrometri di diametro con uno spessore di circa 20-30 micrometri. Una volta che il cranio è sufficientemente assottigliato, rimuovere con cura i detriti ossei. Il prossimo passo è quello di fissare la piastra della testa, che è modellata da lame di rasoio con bordi affilati coperti da nastri.

Inizia posizionando una piccola goccia di colla cianoacrilica su ciascun bordo dell'apertura centrale della piastra di testa. Quindi centrare la piastra di testa sulla regione assottigliata. Tienilo saldamente contro il cranio.

Ora, tira delicatamente la pelle dai lati del cranio fino ai bordi dell'apertura centrale della piastra per la testa. Tenere la piastra di testa in posizione per uno o due minuti. Quindi attendi altri otto o nove minuti fino a quando la piastra della testa non è ben attaccata al cranio.

Dopo 10 minuti, posizionare la piastra di testa sui due blocchi laterali della piastra di supporto. Quindi, serrare le viti sui bordi della piastra della testa per immobilizzare il mouse sulla piastra di supporto. Guarda la testa del topo attraverso un microscopio da dissezione mentre imbottisci delicatamente la schiena del topo per assicurarti che la testa sia correttamente immobilizzata.

Successivamente, sciacquare il cranio esposto con soluzione salina per rimuovere l'eventuale colla non polimerizzata al fine di riposizionare la regione precedentemente ripresa. Nelle successive sessioni di imaging, scattare una foto della vascolarizzazione della regione assottigliata del cranio esposto, che è designata mappa uno. Quindi posizionare il mouse sotto il microscopio di imaging e individuare l'area assottigliata sotto l'obiettivo pneumatico 10x.

Utilizzando l'epifluorescenza, sposta l'area più sottile al centro della vista. Ora aggiungi una goccia di soluzione salina sulla parte superiore del cranio e passa all'obiettivo 60x. Seleziona una regione in cui le singole spine dendritiche sono chiaramente visualizzate lungo i dendriti.

Identificare ed etichettare la regione corrispondente sulla mappa uno confrontando la vascolarizzazione tra la vista epifluorescente e la foto del sistema vascolare. Quindi, sintonizzare la lunghezza d'onda del laser a due fotoni in base ai quattro fluoro. Quindi, utilizzando l'obiettivo 60x, acquisisci pile di immagini con passi di due micrometri lungo l'asse Z, coprendo un'area di circa 200 micrometri per 200 micrometri.

Questa è designata come mappa due e viene utilizzata per riposizionare il segmento dendritico dell'immagine durante le successive sessioni di imaging. Ora acquisisci nove pile di immagini all'interno della mappa due utilizzando lo zoom digitale tre x. Ogni pila di immagini copre un'area approssimativa di 70 micrometri per 70 micrometri con incrementi di 0,7 micrometri lungo l'asse Z.

Dopo l'imaging, staccare delicatamente la piastra della testa dal cranio. Quindi, usa una lama microchirurgica per rimuovere la colla rimanente dal cranio. Quindi sciacquare più volte il cranio e la pelle con soluzione fisiologica e suturare il cuoio capelluto con suture chirurgiche sterili.

Durante il recupero, tenere l'animale su un termoforo in una gabbia separata e somministrare analgesico alla buprenorfina per via sottocutanea per il dolore postoperatorio. Dopo il completo recupero, riportare l'animale all'indicatore di casa Per ri-immaginare i dendriti in un altro giorno, anestetizzare l'animale ed esporre il cranio. Come prima, ripetere l'immobilizzazione della testa montando la piastra di testa e fissandola alla piastra di supporto.

Quindi individua la regione precedentemente ripresa confrontando il modello di vascolarizzazione per mappare uno e il modello di ramificazione dendritica per mappare due. Se la rivisitazione viene eseguita entro una settimana, il sottile strato di osso appena cresciuto può essere rimosso con una lama microchirurgica. Se la ricreazione dell'imaging viene eseguita dopo più di una settimana, utilizzare prima il microtrapano, quindi la lama microchirurgica per assottigliare il cranio.

Ora regola la posizione e l'orientamento sotto il microscopio a due fotoni per ottenere pile di immagini che corrispondano alle pile di immagini scattate in precedenza. Dopo aver acquisito le immagini, lasciare che il topo si riprenda e riportarlo nella sua gabbia come prima, e un'immagine del modello vascolare che circonda l'area sottile del cranio designata come mappa uno viene utilizzata per fare riferimento a tutte le successive sessioni di imaging. La scatola nera indica la regione in cui sono state acquisite due immagini in vivo di fotoni.

Questa immagine dei rami dendritici nella corteccia motoria di un topo di un mese è designata come mappa due. La casella bianca mostra il segmento dendritico selezionato per l'imaging. Nel corso del tempo, sono state eseguite immagini di due fotoni dello stesso segmento dendritico il giorno zero, il giorno due, il giorno quattro e il giorno otto.

Spine di nuova formazione. Cioè, le spine che non erano presenti nella precedente sessione di imaging sono mostrate dalle frecce, le spine che sono state eliminate tra le sessioni di imaging sono mostrate dalle frecce. I Philip Podia sono indicati da stelle una volta padroneggiati.

Questa tecnica può essere eseguita in una o due ore se eseguita correttamente.