Behavioral Fenotipizzazione di modelli di malattia murini con la stazione Integrated Behavioral (INBEST)

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di migliorare la riproducibilità e la standardizzazione della fenotipizzazione comportamentale e dei topi sperimentali attraverso il monitoraggio continuo delle misure comportamentali di base in un ambiente familiare. Questo sistema modulare è composto da una ruota da corsa computerizzata a rete rampicante digitalizzata, un distributore di cibo automatizzato, due TER controllati da fotocellula, uno stimolo luminoso controllato da computer e un rifugio, componenti di terze parti e la tecnologia MPEG four a infrarossi integrata con il monitoraggio video e la registrazione degli eventi I pacchetti software sono interfacciati per creare otto arene, consentendo il monitoraggio simultaneo di quattro animali sperimentali e quattro di controllo. Le latenze, le frequenze e le durate di comportamenti specifici vengono analizzate utilizzando il software MED PC four.

Mentre l'attività locomotoria e la topografia dei percorsi di movimento vengono valutate con il software ETH ovision XT 8.5 utilizzando un'analisi statistica completa. I dati sono stati spesso elaborati per rivelare cambiamenti comportamentali indotti dalla progressione della malattia in diversi modelli murini. La natura complessa e sensibile del comportamento rende spesso molto difficili misurazioni affidabili nei topi malati cronici.

Utilizzando nuove tecnologie che consentono un'analisi comportamentale accurata e imparziale. Descriviamo un sistema di monitoraggio su misura chiamato Inves o Integrated behavioral station. Questo apparecchio è progettato per fornire misurazioni prolungate di output funzionali di base come l'attività spontanea, l'assunzione di cibo e acqua, la reattività emotiva, il comportamento motivato, il tutto in un ambiente domestico a basso stress.

I principali vantaggi di invest rispetto ai singoli test comportamentali includono il monitoraggio continuo, la riduzione dello stress da trasporto e la raccolta rapida di più set di dati che vengono immediatamente alimentati per un'analisi computerizzata imparziale. Sebbene il monitoraggio continuo affronti i fattori confondenti comuni negli studi tradizionali, è importante notare che alcuni domini del comportamento, come la funzione neurologica e l'apprendimento spaziale, non possono essere studiati nell'ambiente domestico della gabbia, richiedendo quindi ulteriori test Per completare la valutazione del profilo comportamentale, una o due settimane prima dell'inizio dell'esperimento, Inizia ad abituare i topi a un ciclo da 12 a 12 da luce a buio. I topi sono più attivi di notte.

Imposta l'intervallo di tempo del ciclo di buio in modo che corrisponda all'orario di lavoro dello sperimentatore. Tutti gli altri fattori ambientali, come la temperatura e la ventilazione, dovrebbero rimanere costanti durante questo periodo. Per l'identificazione numerica permanente, tatuare la coda ai topi per cinque-sette giorni prima del test.

Maneggiare regolarmente i topi per un massimo di due ore al giorno, abituandoli così allo stress misurare e registrare il peso corporeo, la temperatura rettale e prendere nota del loro aspetto generale. Escludere dallo studio i topi che mostrano anomalie grossolane come un basso consumo di cibo o acqua, perdita di peso corporeo, una postura curva, pelo arruffato o macchiato, idrocefalo o secrezione di porfirine intorno agli occhi. Inoltre, durante questo periodo di tempo è possibile eseguire un'ampia varietà di test comportamentali, come il campo aperto, consentendo una comprensione più completa dei deficit di prestazione.

Per uno studio comportamentale prolungato, il distributore di cibo dovrebbe avere una scorta completa di pellet di cibo per topi. Ciascuno del peso di 20 milligrammi. Una bottiglia deve essere sempre riempita con acqua fresca del rubinetto.

In un test di preferenza, una seconda bottiglia può fornire una soluzione alternativa di interesse, come quella contenente zucchero. Pesare le bottiglie per stimare il volume consumato tra una sessione e l'altra. Per misurare la latenza e la frequenza degli attacchi di bevute, i beccucci delle bottiglie devono essere collegati ai TER.

Un sensore a infrarossi rileva il leccamento, quindi assicurati che il sensore non sia bloccato dall'ugello del beccuccio. In tal caso, modificare la lunghezza del beccuccio in modo che si adatti alla gabbia. Un riparo dovrebbe essere posizionato in un angolo distale rispetto alla ruota da corsa.

Per il tracciamento video, è necessario che la stanza sia illuminata con una luce diffusa e fioca che non si rifletta sul pavimento o sulle pareti degli investimenti. Una volta impostata correttamente l'illuminazione, l'arena di test può essere digitalizzata per il software di test. Per questa dimostrazione, il pacchetto software ETH Ovision XT 8.5 viene utilizzato per configurare l'arena.

Inizia aprendo un progetto di tracciamento predefinito e inserendo le impostazioni sperimentali. Quindi scegli la sorgente video, in questo caso l'ottavino diligente grabber. Imposta il numero di arene di tracciamento su quattro.

Scegli il naso e la coda centrali per i punti di inseguimento e seleziona le unità di misura Next dall'elenco di prova. Nel menu di configurazione, definire il numero di prove facendo clic sul pulsante Aggiungi prove. Quindi attiva l'opzione aggiungi variabile per specificare variabili indipendenti come l'ID del mouse, il gruppo di sesso, l'assegnazione e la deformazione.

Ora cattura un'immagine di sfondo dell'arena facendo clic sulla scheda delle impostazioni dell'arena e definendo il perimetro dell'arena utilizzando gli strumenti di disegno disponibili dopo aver definito l'arena, usa l'opzione Aggiungi zona per delineare le zone di interesse come il pavimento, i TER, il distributore di cibo e così via. Quindi aggiungi le zone in cui il mouse non può essere visto utilizzando l'opzione Aggiungi gruppo di zone nascoste. Ciò includerebbe il rifugio e la ruota da corsa.

Ogni zona nascosta deve inoltre disporre di un punto di uscita di ingresso specificato. Dopo aver definito il perimetro e le zone di ogni arena, eseguire i test di calibrazione utilizzando l'opzione di calibrazione nel software. Usa lo strumento di accesso alla scala per determinare la larghezza e la lunghezza di ogni arena.

Quindi convalida le impostazioni di ciascuna arena utilizzando il pulsante di convalida e procedi con l'impostazione dei parametri di prova e la raccolta dei dati. Per acquisire i dati è necessario prima impostare i parametri di acquisizione nel programma. Per iniziare, accedere alla scheda delle impostazioni di controllo della versione di prova e specificare i tempi per il set di versioni di prova.

La condizione di inizio per iniziare quando la durata del punto centrale supera un secondo nell'arena, la durata della prova viene impostata espandendo la casella della condizione di arresto e impostando la prova in modo che termini dopo un ritardo preimpostato come 10 ore, ora seleziona un'opzione dal metodo di rilevamento dalla scheda delle impostazioni di rilevamento. Quindi, prendi l'immagine di riferimento dell'arena vuota utilizzando il pulsante delle impostazioni e selezionando Afferra corrente mentre sei ancora nel modulo di rilevamento, regola l'intervallo di contrasto per i punti di rilevamento del muso e della coda centrali. Impostare l'intervallo in modo che sia continuo.

Quindi indica che il mouse è più luminoso o più scuro dello sfondo. Ora regola l'impostazione della dimensione del soggetto, che si basa sul campo visivo della fotocamera. Quindi, se necessario, regolare i fotogrammi al secondo di analisi in base a ciò che il computer è in grado di fare.

Elaborazione di 14,9 fotogrammi. Il secondo è di solito sufficiente. Quando vengono apportate tutte le modifiche alle opzioni del modulo di rilevamento, assicurarsi di salvarle prima di procedere alla misurazione della latenza, della frequenza e della durata degli atti comportamentali.

Una routine personalizzata in MED PC four viene utilizzata per l'inserimento passo-passo dei parametri della sessione come l'id del mouse, la durata della prova, gli attacchi di rotelli, eccetera. Quando tutti questi parametri sono stati inseriti e tutte le apparecchiature di test sono state accese, procedere posizionando il mouse nell'arena. Quindi sincronizza i pacchetti di monitoraggio video ed eventi premendo contemporaneamente i pulsanti di registrazione e lascia silenziosamente la stanza più tardi quando scade il periodo di registrazione, riporta i topi nelle loro gabbie domestiche, misura il peso delle bottiglie e salva tutti i dati registrati su supporti digitali.

I dati grezzi possono essere inviati a un foglio di calcolo per l'analisi e i file video grezzi possono essere valutati per comportamenti poco frequenti come stereotipi o convulsioni. Uno studio prolungato con topi CD 1 utilizzando il migliore è stato eseguito diversi giorni prima dell'intervento chirurgico. Sono stati raccolti i dati basali, seguiti dai dati post-operatori che includono la somministrazione intra cerebroventricolare prolungata di anticorpi reattivi cerebrali.

A partire dal quinto giorno, i gruppi sperimentali hanno mostrato varie menomazioni, tra cui una riduzione del leccamento delle bottiglie d'acqua. Hanno anche mostrato una maggiore latenza nell'avvicinarsi ai flaconi con soluzione di sucralosio e hanno mostrato una diminuzione del consumo di cibo. In concomitanza con questi cambiamenti, i topi a cui sono stati somministrati anticorpi reattivi cerebrali hanno anche mostrato una diminuzione dell'attività della ruota di corsa rispetto alla deambulazione dei topi di controllo, misurata dal software di tracciamento video.

Nel gruppo sperimentale, i topi trattati hanno preferito trascorrere del tempo nei rifugi. Utilizzando questi dati, è stato costruito un semplice rogramma per illustrare queste differenze comportamentali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare un apparato di monitoraggio su misura per un'analisi comportamentale imparziale.

In un ambiente simile a quello domestico, la fenotipizzazione automatizzata della gabbia domestica fornisce una ricchezza di informazioni che consente una valutazione più accurata della cinetica di insorgenza e della gravità dei deficit comportamentali indotti dalla malattia correlati alla locomozione spontanea e al comportamento motivato e alla reattività emotiva, riducendo al minimo i problemi relativi a impostazioni ambientali incoerenti, trasporto, stress e apparecchiature di manipolazione ripetute come le inves possono migliorare significativamente la coerenza e la precisione dei risultati comportamentali attraverso studi separati.