Funzionalità di monitoraggio e di Morfologia Vasculature Reclutato da fattori secreti dalle cellule a crescita rapida, la generazione di tumore

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare l'ecografia e l'endomicroscopia per illustrare il potenziale angiogenico di un pool di fattori secreti dalle cellule tumorali. Ciò si ottiene impiantando prima un tappo per generare un ambiente simile a un tumore nel topo in assenza di cellule tumorali. Successivamente, vengono valutate la densità dei vasi sanguigni e la percentuale dei vasi sanguigni funzionali all'interno del tappo.

Nella fase finale, viene visualizzata la morfologia dei vasi sanguigni. In definitiva, l'equilibrio tra i fattori pro e anti-angiogenici secreti dalle cellule e i loro effetti sull'angiogenesi possono essere valutati internamente, vitalmente e in vari momenti temporali dalle due modalità di imaging complementari. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il test convenzionale matrigel plug, è che consente l'analisi di un pool di fattori secreti dalle cellule, utilizzando modalità di imaging intravitali complementari.

A dimostrazione di questa procedura sarà lei ha eseguito F Andra studenti di dottorato dal mio laboratorio Per utilizzare gli ultrasuoni per valutare la matrice extracellulare o la vascolarizzazione del tappo di gel mimico ECM, iniziare posizionando un tubo einor da 1,5 millilitri contenente 80 microlitri di terreno condizionato appena preparato su ghiaccio. La parte più complicata della procedura è iniettare il gel senza bolle usando punte ghiacciate. Una miscelazione delicata e un'iniezione lenta garantiranno una somministrazione ottimale del gel.

Quindi, utilizzando punte ghiacciate da 1000 microlitri, mescola 600 microlitri di ghiaccio freddo a quattro gradi Celsius durante la notte. Il gel imitatore ECM scongelato nel mezzo fa attenzione a non formare bolle. Dopo aver confermato la sedazione con un pizzico di punta, radere l'addome di ciascun topo e utilizzare una siringa da un millilitro ghiacciata dotata di un ago calibro 27 per sottocutanea lentamente.

Iniettare il contenuto di una provetta EEND DPH per animale. Una volta somministrato l'intero volume, tenere l'ago in posizione per diversi minuti fino a quando non si verifica la solidificazione. Tre settimane dopo, radere nuovamente la zona addominale dei topi, rimuovendo i peli in eccesso con una crema depilatoria, quindi fissare i topi in posizione supina sul palco del micro manipolatore.

Quindi, riempire una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 30 con soluzione fisiologica. Quindi posizionare l'ago all'interno della vena caudale. Fissare saldamente l'ago e allentare la siringa.

Ora posiziona il trasduttore al centro dell'area di scansione desiderata e fai clic su 3D per inizializzare lo stadio del motore 3D. Fare clic su 3D. Ancora una volta, inserire la distanza di scansione e la dimensione del passo e premere scansione.

Verificare che l'intera spina sia stata scansionata nei dati dell'immagine 3D visualizzati. In caso contrario, regolare il trasduttore in modo che l'intera spina sia visibile ed eseguire nuovamente la scansione dell'area come appena dimostrato. Quindi seleziona il contrasto e regola la compensazione del guadagno di tempo o i controlli tgc per scurire l'immagine, usa un mixer per fiale per attivare le microbolle per 45 secondi.

Quindi mescolare 50 microlitri di microbolle con 50 microlitri di soluzione fisiologica in una siringa da un millilitro. Sostituire la siringa contenente soluzione fisiologica con la siringa contenente le microbolle attivate e iniettare le microbolle diluite nella vena caudale di ciascun topo. Attendi qualche secondo affinché le bolle raggiungano uno stato stazionario, quindi fai clic su 3D e seleziona scansione per acquisire 3D.

Immagini con contrasto migliorato. Fare clic su Seen a Store per salvare i dati dell'immagine, quindi selezionare 3D ed eliminare il 3D. Per distruggere le microbolle, fai nuovamente clic su 3D e seleziona Scansione per acquisire un ciclo di cena post distruzione.

Quindi fai di nuovo clic su Hai visto un negozio. Successivamente, nelle impostazioni di riferimento, fare clic su Crea riferimento, quindi selezionare Gestione studio. Per aprire il ciclo cena pre distruzione.

Ora fai clic su Elabora cena per generare una sovrapposizione di contrasto verde. Quindi selezionare Carica in 3D nel software di imaging a ultrasuoni. Quindi, fai clic su impostazioni modalità, fai clic su volume e seleziona parallelo.

Quindi segmentare una serie di contorni per creare un volume 3D del tessuto target e fare clic su Fine per completare la segmentazione. Per utilizzare l'endomicroscopia endoconfocale a fibre per valutare la morfologia vascolare del tappo in gel mimico della MEC, iniettare 200 microlitri di 10 milligrammi per millilitro, inserire destrano marcato C nella vena caudale di ciascun animale da esperimento. Quindi applicare una piccola incisione a circa un centimetro dal tappo e posizionare delicatamente la sonda per endomicroscopia sopra il tappo mantenendo intatto il tappo.

Una volta posizionata la sonda, utilizzare il pedale per premere il laser di avvio. Una volta che la fluorescenza appare sullo schermo, premere select con il pedale per acquisire filmati brevi fino al 32° tra un filmato e l'altro, lavare la punta della sonda in un tubo contenente acqua. Al termine della ripresa, pulire la punta con un batuffolo di cotone per analizzare il diametro medio del vaso.

Quindi, fai clic su Rileva micro recipienti per aprire la finestra del modulo di rilevamento dei recipienti e fai clic su Preferenze. Assicurati che il diametro medio del recipiente sia nella statistica di interesse. Le barre della finestra e dell'istogramma di visualizzazione nella modalità di visualizzazione sono contrassegnate.

Fare clic su Rileva per visualizzare le misurazioni selezionate. Per analizzare l'intensità del segnale fluorescente nelle aree adiacenti ai vasi sanguigni, selezionare crea ROI circolare e creare un cerchio nell'area di interesse. Infine, selezionare calcola istogramma all'interno del ROI per calcolare i valori relativi alla regione cerchiata.

Qui, l'ampio reclutamento di vasi sanguigni funzionali all'interno di tappi a medio carico condizionati con U 87 mg è rivelato dall'imaging ecografico con contrasto a microbolle. Al contrario, all'interno dei tappi contenenti mezzo condizionato da cellule tumorali dormienti, il flusso sanguigno è quasi impercettibile. La morfologia di questi vasi sanguigni di nuova formazione è ulteriormente enfatizzata dalla microscopia endoconfocale a fibre dei vasi dopo la somministrazione di destrano come dimostrato in queste immagini rappresentative, si noti come i vasi sanguigni all'interno dei tappi caricati con il mezzo condizionato U 87 mg mostrino una tipica morfologia dei vasi ingranditi con estremità smussata che perde.

I vasi sanguigni allargati e molto aggrovigliati dimostrano anche un flusso non continuo e lento e la perdita di sangue è osservata nell'area circostante, oltre a essere evidenziata dall'alto segnale fluorescente evidente all'esterno dei vasi sanguigni. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in ore in diversi punti temporali per ottimizzare la cinetica dell'angiogenesi.