Funzionalità di monitoraggio e di Morfologia Vasculature Reclutato da fattori secreti dalle cellule a crescita rapida, la generazione di tumore

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare l'ecografia e la microscopia endoscopica per illustrare il potenziale angiogenico di un insieme di fattori secreti dalle cellule tumorali. Questo viene ottenuto innanzitutto impiantando un tappo per generare un ambiente simile a un tumore nel topo in assenza di cellule tumorali. Successivamente, vengono valutate la densità dei vasi sanguigni e la percentuale di vasi sanguigni funzionali all'interno del tappo.

Nell'ultimo passaggio, viene visualizzata la morfologia dei vasi sanguigni. In definitiva, l'equilibrio tra i fattori pro- e anti-angiogenici secreti dalle cellule e i loro effetti sull'angiogenesi può essere valutato in vitro, in vivo e in diversi punti temporali mediante due modalità complementari di imaging. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio convenzionale del plug di matrigel, è che consente l'analisi di un insieme di fattori secreti dalle cellule sfruttando modalità complementari di imaging intravitale.

Dimostreranno questa procedura She Ran F. e Andra, studenti di dottorato del mio laboratorio. Per utilizzare l'ultrasuono nella valutazione della vascularizzazione di un gel plug che imita la matrice extracellulare (ECM), iniziare posizionando un tubo Eppendorf da 1,5 millilitri contenente 80 microlitri di mezzo condizionato appena preparato sul ghiaccio. La parte più delicata della procedura consiste nell'iniettare il gel senza formare bolle, utilizzando punte ghiacciate. Un'accurata miscelazione delicata e un'iniezione lenta garantiranno un'ottimale somministrazione del gel.

Quindi, utilizzando punte da 1000 microlitri ghiacciate, mescolare 600 microlitri di gel mimetico di matrice extracellulare scongelato, mantenuto a quattro gradi Celsius durante la notte, nel mezzo, avendo cura di non formare bolle d'aria. Dopo aver confermato la sedazione mediante pizzicamento del dito del piede, rasare l'addome di ogni topo e utilizzare una siringa da un millilitro ghiacciata, dotata di un ago da 27 gauge, per iniettare lentamente per via sottocutanea.

Iniettare il contenuto di un tubo EEND DPH per animale. Una volta somministrato l'intero volume, mantenere l'ago in posizione per alcuni minuti fino a quando non avviene la solidificazione. Tre settimane dopo, rasare nuovamente la zona addominale dei topi, rimuovendo i peli residui con una crema depilatoria, quindi fissare i topi in posizione supina sulla piastra del micromanipolatore.

Successivamente, riempire una siringa da un millilitro dotata di un ago da 30 gauge con soluzione fisiologica. Quindi inserire l'ago nella vena della coda. Fissare saldamente l'ago e allentare la siringa.

Ora posizionare il trasduttore al centro dell'area di scansione desiderata e fare clic su 3D per inizializzare lo stadio motorizzato 3D. Fare clic su 3D. Inserire nuovamente la distanza di scansione e la dimensione del passo, quindi premere scansione.

Verificare che l'intero tappo sia stato scansionato nei dati dell'immagine 3D visualizzati. In caso contrario, regolare il trasduttore in modo che l'intero tappo sia visibile e scansionare nuovamente l'area come appena dimostrato. Successivamente, selezionare il contrasto e regolare i controlli di compensazione del guadagno nel tempo o tgc per scurire l'immagine; utilizzare un mescolatore per provette per attivare le microbolle per 45 secondi.

Quindi mescolare 50 microlitri di microbolle con 50 microlitri di soluzione fisiologica in una siringa da un millilitro. Sostituire la siringa contenente soluzione fisiologica allentata con la siringa contenente le microbolle attivate e iniettare le microbolle diluite nella vena della coda di ogni topo. Attendere alcuni secondi affinché le bolle raggiungano uno stato stazionario, quindi fare clic su 3D e selezionare "scan" per acquisire l'immagine 3D.

Immagini con contrasto migliorato. Fare clic su un archivio per salvare i dati dell'immagine, quindi selezionare 3D ed eliminare il 3D. Per distruggere i microbolle, fare clic nuovamente su 3D e selezionare la scansione per acquisire un ciclo post distruzione.

Quindi fare clic su un negozio visualizzato nuovamente. Successivamente, nelle impostazioni di riferimento, fare clic su crea riferimento e quindi selezionare gestione dello studio. Per aprire il ciclo pre distruzione cena.

Ora fare clic su "process cena" per generare una sovrapposizione di contrasto verde. Quindi selezionare "load into 3D" nel software di imaging ecografico. Successivamente, fare clic su "mode settings", selezionare "volume" e quindi scegliere "parallel".

Quindi segmentare una serie di contorni per creare un volume 3D del tessuto bersaglio e fare clic su fine per completare la segmentazione. Per utilizzare la microscopia endoscopica confocale con fibra ottica per valutare la morfologia della vascolarizzazione nel tappo di gel che imita la matrice extracellulare, iniettare 200 microlitri di dextrano marcato con fits C a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro nella vena della coda di ciascun animale sperimentale. Quindi praticare una piccola incisione a circa un centimetro dal tappo e posizionare delicatamente la sonda di microscopia endoscopica sulla superficie del tappo, mantenendolo intatto.

Una volta posizionata la sonda, utilizzare il pedale per avviare il laser. Quando la fluorescenza appare sullo schermo, premere seleziona con il pedale per acquisire filmati brevi fino a 32esimi di lunghezza; tra un filmato e l'altro, lavare la punta della sonda in un tubo contenente acqua. Al termine della ripresa, pulire la punta con un bastoncino di cotone per analizzare il diametro medio dei vasi.

Successivamente, fare clic su "detect micro vessels" per aprire la finestra del modulo di rilevamento dei vasi e fare clic su preferenze. Assicurarsi che il diametro medio dei vasi sia selezionato nelle statistiche di interesse e che le barre dell'istogramma nella modalità di visualizzazione siano marcate.

Fare clic su "detect" per visualizzare le misurazioni selezionate. Per analizzare l'intensità del segnale fluorescente nelle aree adiacenti ai vasi sanguigni, selezionare "create circle ROI" e creare un cerchio nell'area di interesse. Infine, selezionare "compute histogram within ROI" per calcolare i valori relativi alla regione cerchiata.

Qui il vasto reclutamento di vasi sanguigni funzionali all'interno dei plug caricati con mezzo condizionato da U 87 mg è rivelato da un'immagine ecografica con contrasto a microbolle. Al contrario, all'interno dei plug contenenti mezzo condizionato da cellule generatrici di tumori dormienti, il flusso sanguigno è quasi impercettibile. La morfologia di questi vasi sanguigni neoformati è ulteriormente evidenziata dalla microscopia endoscopica confocale a fibra ottica dei vasi dopo la somministrazione di dextrano marcato con FITC, come mostrato in queste immagini rappresentative; si noti come i vasi sanguigni all'interno dei plug caricati con il mezzo condizionato da U 87 mg presentino una tipica morfologia vascolare dilatata, ottusa e permeabile.

Le strutture vascolari ingrandite e altamente intrecciate mostrano inoltre un flusso non continuo e lento, e si osserva una fuoriuscita di sangue nella zona circostante, come dimostrato anche dal segnale fluorescente intenso visibile al di fuori dei vasi sanguigni. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in poche ore in diversi punti temporali per ottimizzare la cinetica dell'angiogenesi.