Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata

L'obiettivo generale del seguente esperimento è mostrare in quale sede viene espressa una particolare gene all'interno di un embrione integro. Questo risultato si ottiene fissando l'RNA da localizzare in loco all'interno dell'embrione come secondo passaggio. Una sonda a RNA antisenso specifica per il gene di interesse viene ibridata all'RNA bersaglio all'interno dell'embrione.

Questo sonda contiene un epitopo, solitamente digoxigenina, che può essere successivamente rilevato. Successivamente, un anticorpo coniugato alla fosfatasi alcalina viene ibridato all'epitopo presente sulla sonda di RNA, seguito dall'uso di un colorante cromogenico. Per visualizzare la localizzazione dell'RNA all'interno dell'embrione, si ottengono risultati che mostrano con precisione dove il gene di interesse è espresso, in base alla reazione cromogenica e alla conoscenza dell'anatomia dell'embrione.

Il vantaggio principale del nostro protocollo istituzionale rispetto ai protocolli esistenti è che è più rapido e utilizza meno reagenti, senza alcuna perdita evidente di qualità. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali in embriologia, come ad esempio come i tessuti vengono specificati e organizzati. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo sviluppo di opus, può essere utilizzato anche per molti altri embrioni di piccole dimensioni, come quelli di zebrafish e di topo nei primi stadi.

Abbiamo iniziato a sviluppare questi metodi perché i metodi originali richiedevano molto tempo, e abbiamo cominciato a sperimentare l'omissione di alcuni passaggi di Ed per aumentare l'efficienza del procedimento senza comprometterne la qualità. La fissazione degli embrioni viene eseguita in fasi successive. Preparare innanzitutto i vial di vetro che saranno utilizzati per tutti i passaggi, inclusa la conservazione finale degli embrioni, in modo da consentire il monitoraggio degli embrioni durante tutte le fasi del processo.

Utilizzare viali trasparenti con un buon sigillo in teflon nel coperchio e applicare un'etichetta con un pennarello indelebile contenente le informazioni sperimentali appropriate. Coprire l'etichetta con del nastro trasparente per evitare la perdita dell'etichettatura nel corso della procedura. A causa dell'uso di alcoli e altri solventi, preparare la soluzione di fissaggio MFA come descritto nel testo del protocollo.

Riempire ogni provetta di vetro etichettata con tre o quattro millilitri di soluzione MFA. Conservare una soluzione di metanolo al 100% a meno 20 gradi Celsius. Preparare una pipetta di vetro tagliata e utilizzarla per trasferire gli embrioni nelle provette di vetro contenenti soluzione Memphis per la fissazione.

Aggiungere gli embrioni con il minimo trasferimento di liquido dal mezzo embrionale. Fissare non più di 20-30 embrioni per provetta. Lasciare gli embrioni in soluzione di Memphis per due ore a temperatura ambiente su un agitatore rotatorio.

Al termine della fissazione con paraformaldeide, sostituire la soluzione di Memphis con circa quattro millilitri di metanolo al 100% a meno 20 gradi Celsius per la conservazione degli embrioni prima di allestire la reazione di sintesi della sonda. Lasciare che la miscela di DNA, acqua, NTP e tampone polimerasico raggiunga la temperatura ambiente. Uno dei passaggi più critici per il successo di questa procedura è l'allestimento corretto della reazione della sonda.

Assemblare la reazione di sintesi della sonda a temperatura ambiente. Aggiungere i seguenti componenti in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri in questo ordine: DNA stampo, acqua aggiustata a un volume tale da portare il volume totale della reazione a 20 microlitri, mix di NTP, inibitore dell'RNA, buffer della RNA polimerasi e RNA polimerasi. Incubare la reazione di trascrizione per due ore a 37 gradi Celsius.

Incubazioni leggermente superiori a due ore non hanno effetti negativi, ma mostrano anche un aumento minimo del rendimento; se l'incubazione dura un'ora, il rendimento sarà ridotto, sebbene ancora sufficiente per ottenere una buona sonda. Al termine della reazione di trascrizione, prelevare un microlitro della miscela di reazione per verificarla su un gel di agarosio al 1% in tampone TAE, aggiungendo il prelievo alla restante miscela di reazione.

Aggiungere 80 microlitri di SDS al 1% in tampone TE, 10 microlitri di acetato di ammonio 5 M e 220 microlitri di etanolo freddo. Vortexare energicamente la miscela e lasciarla in ghiaccio fino a quando non si conoscono i risultati del controllo della qualità dell'RNA. Dopo aver aggiunto acqua e colorante di carico standard all'uno microlitro di RNA prelevato prima della precipitazione, eseguire l'RNA su un gel di agarosio al 1% in tampone TAE contenente bromuro di AUM.

Visualizzare l'RNA marcato con bromuro di etidio sul gel utilizzando un transilluminatore a luce UV per verificare la qualità della sonda. Dovrebbe essere visibile una singola banda senza sbavature né al di sopra né al di sotto. Una volta verificata la qualità dell'RNA, precipitare l'RNA rimanente messo da parte sul ghiaccio centrifugando in un microcentrifugo a velocità massima per 10-15 minuti.

Rimuovere il soprannatante con una pipetta di vetro affusolata e lasciare asciugare brevemente l'RNA. Successivamente, la sonda viene risospesa in un tampone di ibridazione per RNA e conservata in un tubo in polistirene da 15 millilitri con tappo a vite a meno 20 gradi Celsius. Per iniziare questa procedura, recuperare gli embrioni conservati nel metanolo a meno 20 gradi Celsius e lasciarli riscaldare alla temperatura ambiente.

L'intero procedimento viene eseguito in provette di vetro. Se diversi embrioni provenienti da un singolo gruppo devono essere analizzati con sonde diverse, mantenerli in una singola provetta fino a subito prima dell'aggiunta delle sonde. Per ridurre la variabilità e il lavoro richiesto nel primo giorno di preparazione per l'aggiunta della sonda, idratare gli embrioni attraverso una serie di metanolo come indicato in questa tabella, utilizzando pipette di vetro per rimuovere e aggiungere con attenzione ogni soluzione, poiché gli embrioni possono essere facilmente danneggiati durante questo passaggio.

Quando si trasferiscono i liquidi, controllare l'interno dei tappi per assicurarsi che non vi siano embrioni intrappolati. Dopo ogni cambio, agitare delicatamente gli embrioni per verificare che non si attacchino alle pareti o l'uno all'altro. Inoltre, agitare gli embrioni posizionando le provette su un agitatore; prima dell'uso, il tampone per ibridazione dell'RNA e la sonda devono essere preriscaldati a 65 gradi Celsius.

Ibridare gli embrioni nella soluzione di sonda durante la notte con agitazione a 65 gradi Celsius il giorno successivo. Rimuovere la soluzione di sonda e conservarla in un tubo in polistirene da 15 millilitri con tappo a vite, contrassegnato con la data e il numero di volte in cui la sonda è stata utilizzata. Conservare la soluzione di sonda a meno 20 gradi Celsius.

Dopo aver rimosso la sonda, preparare gli embrioni per la colorazione con anticorpi diretti contro la sonda eseguendo una serie di lavaggi come indicato qui. Cambiare la temperatura spostando il mutatore con le provette contenenti gli embrioni direttamente in forni per ibridazione impostati alla temperatura appropriata. Durante l'incubazione degli embrioni nella soluzione di blocco, preparare il volume appropriato di soluzione di blocco più anticorpo anti-D dig in modo che l'anticorpo venga bloccato prima dell'aggiunta agli embrioni. Incubare gli embrioni nella soluzione anticorpale tutta la notte con agitazione a quattro gradi Celsius il giorno successivo.

Rimuovere la soluzione di anticorpo e lavare con mab, una soluzione contenente acido malico e cloruro di sodio. Eseguire almeno 12 lavaggi di 30 minuti a temperatura ambiente con agitazione. Sostituire l'ultima soluzione di lavaggio con il substrato della fosfatasi alcalina.

Eseguire la reazione di colorazione a temperatura ambiente con agitazione lenta durante la notte al giorno successivo. Arrestare la reazione di colorazione e preparare gli embrioni per la conservazione e l'acquisizione delle immagini cambiando i liquidi come indicato in questa tabella. Dopo aver riidratato gli embrioni, fissare la colorazione con MFA per 30 minuti.

Dopo la fissazione, rimuovere la MFA e lavare gli embrioni con metanolo al 25%. Se necessario rimuovere il pigmento endogeno, eliminare il metanolo al 25% e aggiungere la soluzione sbiancante. Osservare attentamente lo sbiancamento poiché avviene relativamente in fretta, e il grado di sbiancamento può essere variato per ottenere effetti diversi.

Per la conservazione a lungo termine, disidratare gli embrioni attraverso una serie di metanolo fino a raggiungere il metanolo al 100%, dopo la schiaritura per la conservazione a breve termine e per le successive analisi di imaging; trasferire quindi gli embrioni in PBS. Gli embrioni non schiariti vanno osservati e analizzati al meglio su uno sfondo di aros all'1%. Per preparare la soluzione di aros, aggiungere l'aros all'acqua e portare a ebollizione finché l'aros non è completamente disciolto. Dopo che l'aros si è raffreddato a 50 gradi Celsius, versarlo in una piastra di Petri fino a uno spessore di circa due millimetri.

Quando la piastra aros è pronta, posizionare gli embrioni non schiariti nella piastra ed eseguire l'acquisizione delle immagini. L'aros fornisce uno sfondo grigio bluastro che contrasta bene con l'embrione e con il colore blu della reazione di colorazione. Inoltre, aiuta a diffondere ombre e riflessi fastidiosi che distolgono l'attenzione dall'embrione, permettendo di acquisire l'immagine dell'embrione da angolazioni alternative, ad esempio dal lato ventrale.

Utilizzare pinzette fini per praticare incisioni nell'aro in modo da adattarlo all'embrione. Posizionare gli embrioni in questi canali per l'orientamento. Prestare attenzione durante la manipolazione degli embrioni poiché sono facilmente danneggiabili.

Utilizzare una sorgente luminosa a fibra ottica per illuminare l'embrione con un angolo poco inclinato, creando ombre sull'embrione che conferiscono profondità all'immagine e aiutano a distinguere le strutture superficiali, poiché la schiaritura può eliminare il pigmento che fornisce punti di riferimento utili. Usare l'effetto di ombreggiatura per embrioni fortemente schiariti. Gli embrioni trasparentizzati vengono utilizzati per acquisire immagini di colorazioni localizzate in profondità all'interno dell'embrione, come nel notocorda, nei polmoni o in regioni del cervello.

In questo protocollo, diversi livelli di sbiancamento vengono utilizzati per visualizzare la colorazione nell'embrione. Se la colorazione è intensa, uno sbiancamento più leggero che mantiene una certa pigmentazione permette una migliore determinazione dello stadio e un migliore orientamento dell'embrione. Tuttavia, se la colorazione si trova in un'area con elevati livelli di pigmentazione, come il rene, uno sbiancamento più intenso fornisce un risultato migliore.

La manipolazione della base dell'ARO può essere utile per l'orientamento dell'embrione. Ad esempio, creando un canale sottile negli aros, è possibile osservare da un lato ventrale un embrione allo stadio di girino che giace su un fianco, con una stabilità sufficiente per acquisire un'immagine di buona qualità. Questo embrione è stato posizionato in un piccolo foro che ne stabilizzava la posizione con il lato ventrale rivolto verso l'alto, consentendo una visione completa del pattern di espressione del gene di interesse.

Gli organi interni possono essere osservati sia in embrioni non trasparentizzati che in embrioni trasparentizzati, a partire da un embrione opaco non trasparentizzato colorato per PAX due. Allo stadio 34, è possibile visualizzare il peduncolo ottico così come il tubo neurale. Tuttavia, i dettagli non sono nitidi. Trasparentizzando l'embrione, i confini dei siti di espressione, inclusi quelli del peduncolo ottico, risultano più definiti.

Il grado di chiarificazione è indicato dalla capacità di visualizzare entrambi gli occhi in questo embrione. Tuttavia, un problema comune con gli embrioni chiarificati è l'accumulo di colorazione nelle cavità interne. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere un'idea chiara di come eseguire rapidamente un'ibridazione in situ su preparato intero utilizzando meno reagenti e ottenere immagini di alta qualità.