Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata In Situ Protocollo di ibridazione in Xenopus

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di mostrare dove un particolare gene è espresso all'interno di un embrione intatto. Ciò si ottiene fissando l'RNA da localizzare in posizione all'interno dell'embrione come secondo passo. Una sonda di RNA antisenso specifica per il gene di interesse viene ibridata con l'RNA bersaglio all'interno dell'embrione.

Questa sonda contiene un epitopo, di solito digo genin, che può quindi essere rilevato. Successivamente, un anticorpo accoppiato alla fosfatasi alcalina viene ibridato all'epitopo sulla sonda RNA, seguito dall'uso di una colorazione colorimetrica. Al fine di visualizzare dove è localizzato l'RNA all'interno dell'embrione, si ottengono risultati che mostrano con precisione dove si esprime il gene di interesse in base alla reazione cromatica e alla conoscenza dell'anatomia dell'embrione.

Il vantaggio principale del nostro protocollo dell'istituto rispetto ai protocolli esistenti è che è più veloce e utilizza meno reagenti senza apparente perdita di qualità. Questo metodo può rispondere a domande chiave in embriologia, come ad esempio come i tessuti sono specificati e modellati. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo sviluppo dell'opus, può essere utilizzato anche per molti altri piccoli embrioni, come il pesce zebra e gli embrioni precoci di topo.

Abbiamo iniziato a sviluppare questi metodi perché i metodi originali richiedevano molto tempo e abbiamo iniziato a sperimentare con l'uscita dai passaggi Ed per aumentare l'efficienza della procedura senza compromettere la qualità. La fissazione dell'embrione viene eseguita in più fasi. Innanzitutto, prepara le fiale di vetro che verranno utilizzate per tutte le fasi, inclusa la conservazione finale degli embrioni per consentire il monitoraggio degli embrioni durante tutte le fasi del processo.

Utilizzare fiale trasparenti con una buona tenuta in teflon nel coperchio, utilizzando un pennarello indelebile, etichettare le fiale con le informazioni sperimentali appropriate. Coprire l'etichetta con nastro adesivo trasparente per evitare la perdita dell'etichettatura nel corso della procedura. A causa dell'uso di alcoli e altri solventi, preparare la soluzione di fissazione MFA come descritto nel testo del protocollo.

Riempire ogni flaconcino di vetro etichettato con tre o quattro millilitri di soluzione MFA. Conservare una soluzione di metanolo al 100% a meno 20 gradi Celsius. Prepara una pipetta di vetro tagliata e usala per trasferire gli embrioni nelle fiale di vetro contenenti la soluzione di Memphis per la fissazione.

Aggiungere gli embrioni con un minimo di trasferimento di liquidi dal terreno embrionale. Fissare non più di 20-30 embrioni per pila. Lasciare gli embrioni in soluzione Memphis per due ore a temperatura ambiente su un mutatore.

Al termine della fissazione dell'aldeide paraformale, sostituire la soluzione di Memphis con circa quattro millilitri di meno 20 gradi Celsius. 100% di metanolo per la conservazione degli embrioni prima di assemblare la reazione di sintesi della sonda, lasciare che la miscela NTP di acqua di DNA e il tampone polimerasi si riscaldino a temperatura ambiente. Uno dei passaggi più critici per il successo di questa procedura è assemblare correttamente la reazione della sonda.

Assemblare la reazione di sintesi della sonda a temperatura ambiente. Aggiungere i seguenti componenti a una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri in questo ordine. L'acqua del DNA stampo regolata a un volume che porta il volume totale della reazione a 20 microlitri La miscela NTP, l'inibitore dell'RNA, il tampone RNA polimerasi e l'RNA polimerasi incubano la reazione di trascrizione per due ore a 37 gradi Celsius.

Incubazioni leggermente superiori alle due ore, non hanno effetti avversi, ma mostrano anche un piccolo aumento della resa se incubate per un'ora, la resa sarà ridotta, anche se comunque sufficiente per fare una buona sonda. Quando la reazione di trascrizione è completa, rimuovere un microlitro della miscela di reazione per controllare un aros all'1%. TAE alla miscela di reazione rimanente.

Aggiungere 80 microlitri di SDS all'1% in tampone TE, 10 microlitri di acetato di ammonio a cinque molari e 220 microlitri di etanolo freddo. Agitare energicamente la miscela e metterla da parte con ghiaccio fino a quando non si conoscono i risultati del controllo di qualità dell'RNA. Dopo aver aggiunto acqua e colorante di caricamento standard al microlitro di RNA rimosso prima della precipitazione, far scorrere l'RNA su un gel TAE all'1% contenente bromuro AUM.

Visualizzare l'RNA marcato con il bromuro di aterio sul gel utilizzando un transluminatore a luce UV per verificare la qualità della sonda. Dovrebbe essere visualizzata una singola banda senza sbavature né sopra né sotto di essa. Una volta verificata la qualità dell'RNA, precipitare l'RNA rimanente che è stato messo da parte sul ghiaccio facendolo girare in una microcentrifuga a piena velocità per 10-15 minuti.

Rimuovere il surnatante con una pipetta di vetro estratta e lasciare asciugare brevemente l'RNA. Successivamente, la sonda viene risospesa in un tampone di ibridazione dell'RNA e conservata in una provetta di polistirene con tappo a vite da 15 millilitri a meno 20 gradi Celsius. Per iniziare questa procedura, recupera gli embrioni che sono stati conservati in metanolo a meno 20 gradi Celsius e lasciali riscaldare a temperatura ambiente.

L'intera procedura viene eseguita nelle fiale di vetro. Se embrioni diversi di un gruppo devono essere esaminati da sonde diverse, conservarli in un'unica fiala fino a poco prima che le sonde vengano aggiunte. Per ridurre la variabilità e il travaglio il primo giorno in preparazione per l'aggiunta della sonda, reidratare gli embrioni attraverso una serie di metanolo come descritto in questa tabella, utilizzare pipette di vetro per rimuovere e aggiungere ogni soluzione con attenzione poiché gli embrioni possono essere facilmente danneggiati durante questa fase.

Durante il trasferimento dei liquidi, controllare l'interno dei tappi per assicurarsi che gli embrioni non siano rimasti intrappolati lì. Agita delicatamente gli embrioni dopo ogni cambio per assicurarti che non si attacchino ai lati o l'uno all'altro. E scuoti gli embrioni montando le fiale su un mutatore prima di utilizzare il tampone di ibridazione dell'RNA e la sonda deve essere pre-avvertita a 65 gradi Celsius.

Ibridare gli embrioni nella soluzione della sonda durante la notte con oscillazione a 65 gradi Celsius il giorno successivo. Rimuovere la soluzione della sonda e conservarla in un tubo di polistirene con tappo a vite da 15 millilitri contrassegnato con la data e il numero di volte in cui la sonda è stata utilizzata. Conservare la soluzione della sonda a meno 20 gradi Celsius.

Una volta rimossa la sonda, preparare gli embrioni per la colorazione degli anticorpi contro la sonda attraverso una serie di lavaggi come descritto qui, modificare la temperatura come richiesto spostando il mutatore con fiale di embrioni attaccati direttamente nei forni di ibridazione impostati alla temperatura appropriata. Durante il periodo in cui gli embrioni vengono incubati nella soluzione bloccante, preparare il volume appropriato della soluzione bloccante più l'anticorpo anti-D dig in modo che l'anticorpo venga bloccato prima della sua aggiunta agli embrioni. Incubare gli embrioni nella soluzione anticorpale durante la notte con oscillazione a quattro gradi Celsius il giorno successivo.

Rimuovere la soluzione di anticorpi e lavare con mab, una soluzione che contiene acido maleico e cloruro di sodio. Eseguire almeno 1230 minuti di lavaggi a temperatura ambiente con oscillazione. Sostituire l'ultima soluzione di lavaggio con il substrato di fosfatasi alcalina.

Eseguire la reazione di colorazione a temperatura ambiente con oscillazione durante la notte del giorno successivo. Arrestare la reazione di colorazione e preparare gli embrioni per la conservazione e l'imaging cambiando i liquidi come descritto in questa tabella. Dopo aver reidratato gli embrioni, fissare la macchia con MFA per 30 minuti.

Una volta fissato, rimuovere l'MFA e lavare gli embrioni con il 25% di metanolo. Se è necessaria la rimozione del pigmento endogeno, rimuovere il metanolo al 25% e aggiungere la soluzione sbiancante. Osserva attentamente lo sbiancamento poiché avviene in tempi relativamente brevi e il grado di sbiancamento può essere variato per effetti diversi.

Per la conservazione a lungo termine, disidratare gli embrioni attraverso una serie di metanolo al 100% di metanolo dopo lo sbiancamento per la conservazione a breve termine e il successivo imaging, trasferire gli embrioni a PBS Gli embrioni non chiariti sono meglio visualizzati e visualizzati su uno sfondo all'1%aros. Per preparare la soluzione di aros, aggiungere aros all'acqua e portare a ebollizione fino a quando l'aros è in soluzione. Dopo che l'aros si è raffreddato a 50 gradi Celsius, versarlo in una capsula di Petri a una profondità di circa due millimetri.

Quando il piatto di aros è pronto, posizionare gli embrioni non chiariti nel piatto e procedere con l'imaging. L'aros dà uno sfondo grigio blu che contrasta bene con l'embrione e il colore blu della reazione di colorazione. Aiuta anche a diffondere le ombre e i riflessi che distraggono l'attenzione dall'embrione per visualizzare l'embrione da alternato, ad esempio dal lato ventrale.

Usa una pinza fine per tagliare gli aros per adattarli all'embrione. Posiziona gli embrioni in quei canali per l'orientamento. Fai attenzione a manipolare gli embrioni poiché si danneggiano facilmente.

Usa la fonte di luce a fibre ottiche per illuminare l'embrione da un angolo poco profondo, creando ombre sull'embrione che forniscono profondità all'immagine e aiutano a distinguere le strutture superficiali perché lo sbiancamento può eliminare il pigmento che fornisce punti di riferimento utili. Usa l'ombreggiamento per embrioni fortemente sbiancati. Gli embrioni chiariti vengono utilizzati per visualizzare la colorazione che si trova in profondità all'interno dell'embrione, ad esempio nel cordone ombelicale, nel polmone o nelle regioni del cervello.

In questo protocollo, vengono utilizzati diversi livelli di sbiancamento per visualizzare la colorazione nell'embrione. Se la macchia è forte, uno sbiancamento più leggero che lascia un po' di pigmentazione consente una migliore stadiazione e orientamento dell'embrione. Tuttavia, se la macchia si trova in un'area con alti livelli di pigmentazione come il rene, un maggiore sbiancamento dà un risultato migliore.

La manipolazione della base ARO può aiutare nell'orientamento dell'embrione. Ad esempio, tagliando un canale sottile nell'aros, un embrione allo stadio di polo tad che giace su un fianco può essere visto dal lato ventrale con sufficiente stabilità per catturare una buona immagine. Questo embrione è stato posto in un piccolo foro che ha stabilizzato la sua posizione con il lato ventrale rivolto verso l'alto, consentendo la visione completa del modello di espressione del gene di interesse.

Gli organi interni possono essere visualizzati sia in embrioni non chiari che in embrioni chiari e opachi colorati per PAX due. Al 34° stadio è possibile visualizzare il peduncolo ottico e il tubo neurale. Tuttavia, i dettagli non sono nitidi Eliminando l'embrione, i confini dei siti di espressione, compreso il gambo ottico, sono più nitidi.

L'entità della purificazione è dimostrata dalla capacità di vedere entrambi gli occhi in questo embrione. Tuttavia, un problema comune con gli embrioni chiariti è che alcune macchie si accumulano nelle cavità interne. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come eseguire rapidamente un'intera montatura in situ con meno reagenti e acquisire immagini di alta qualità.