Name: Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata In Situ Protocollo di ibridazione in Xenopus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 50 s
Description: Impara l'ibridazione in situ in toto in Xenopus laevis per visualizzare l'espressione genica durante lo sviluppo embrionale. Questo protocollo semplificato consente di localizzare l'RNA con reazioni colorimetriche precise.

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Gli autori desiderano ringraziare il CIHR per il sostegno alla borsa di studio di Steve Deimling e il Dipartimento di Pediatria, Università dell'Ontario Occidentale per il supporto di Steve Deimling, Rami Halabi e Stephanie Grover. Questo lavoro è stato supportato dal R2654A11 di sovvenzione NSERC e da un supplemento NSERC Discovery Accelerator

<ol><li>Ninomiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-dependent+differential+cell+adhesion+in+Xenopus+causes+cell+sorting+in+vitro+but+not+in+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo.</a> J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).</li>
<li>Movassagh, M., Philpott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+differentiation+in+Xenopus+requires+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitor%2C+p27Xic1%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1.</a> Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+alphaA-+and+betaB1-crystallin+during+normal+development+and+regeneration%2C+and+proteomic+analysis+for+the+regenerating+lens+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis.</a> Mol Vis. 17, 768-778 (2011).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+Xenopus+primordial+germ+cell+migration+depends+on+the+germplasm+mRNA+encoding+the+PDZ+domain+protein+Grip2%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2.</a> Differentiation. 76, 392-403 (2008).</li>
<li>Deimling, S. J., Drysdale, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+is+required+to+regulate+anterior-posterior+patterning+in+the+Xenopus+lateral+plate+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm.</a> Mech Dev. , (2011).</li>
<li>Fletcher, R. B., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+FGF+signaling+in+the+establishment+and+maintenance+of+mesodermal+gene+expression+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus.</a> Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis+%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+cDNA+microarray+identification+of+genes+with+endodermal+organ+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression.</a> Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).</li>
<li>Horb, M. E., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoderm+specification+and+differentiation+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos.</a> Dev Biol. 236, 330-343 (2001).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29+%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland Pub. (1994).</li>
<li>Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+Lithium+on+the+Competence+of+the+Ectoderm+in+Ambystoma+Mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum.</a> J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+artificially+activated+ectoderm+%28Rana+pipiens+and+Ambystoma+punctatum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum).</a> Dev Biol. 6, 255-279 (1963).</li>
<li>Sato, S. M., Sargent, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+approach+to+dorsoanterior+development+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 137, 135-141 (1990).</li>
<li>Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPOX2-peroxidase+expression+and+the+XLURP-1+promoter+reveal+the+site+of+embryonic+myeloid+cell+development+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus.</a> Mech Dev. 117, 173-186 (2002).</li>
<li>Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+troponin+I+is+a+heart-specific+marker+in+the+Xenopus+embryo%3A+expression+during+abnormal+heart+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis.</a> Dev Biol. 165, 432-441 (1994).</li>
<li>Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+pronephric+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of pronephric development.</a> Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).</li>
<li>Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XNkx-2.5%2C+a+Xenopus+gene+related+to+Nkx-2.5+and+tinman%3A+evidence+for+a+conserved+role+in+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development.</a> Dev Biol. 162, 325-328 (1994).</li>
<li>Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+wound+healing+by+apical+contraction+and+ingression+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).</li>
<li>Hurtado, R., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+and+stability+in+two-color+in+situ+hybridization+by+means+of+a+novel+chromagenic+substrate+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination.</a> Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da rivelare.

La possibilità di utilizzare l&#39;ibridazione in situ per visualizzare il pattern di espressione di geni specifici rimane il metodo più comunemente utilizzato per identificare organi specifici o tipi cellulari nell&#39;embrione Xenopus. Questo è causa di numerosi vantaggi offerti da questa tecnica. L&#39;espressione di un gene in grado di identificare le strutture specifiche ben prima di qualsiasi segno istologico di differenziazione, come nel caso di espressione Nkx2.5 nei progenitori cardia...

Il modello di espressione di un gene specifico è un'informazione importante nel determinare il ruolo potenziale di quel gene nello sviluppo di un organo o di un tipo di cellula specifico. In poche parole, se non viene espresso al momento e nel luogo giusto, è improbabile che svolga un ruolo chiave. In Xenopus, come nella maggior parte degli embrioni precoci, il test più comunemente usato per rilevare l'espressione di un gene è l'ibridazione in situ a montaggio intero utilizzando sonde di RNA antisenso marcate. L'uso della colorazione degli anticorpi per valutare l'espressione di un gene in Xenopus sta diventando sempre più comune man mano che i ricercatori scoprono anticorpi, di solito sollevati contro le proteine dei mammiferi, che reagiscono in modo incrociato all'omologo di Xenopus o generano i propri 1-3. Tuttavia, la stragrande maggioranza degli studi sull'organogenesi di Xenopus utilizza ancora sonde di RNA antisenso. Quando vengono utilizzati gli anticorpi, ogni singolo anticorpo richiede spesso l'ottimizzazione per la concentrazione di anticorpi primari o i protocolli di fissazione. Al contrario, il protocollo per le ibridazioni in situ è essenzialmente invariante per diverse sonde. Il concetto di base è relativamente semplice ed è stato ben consolidato un eccellente protocollo standard 4. Il nostro protocollo è una versione semplificata del protocollo originale 4 che fornisce ancora un'eccellente rilevazione dei modelli di espressione genica nell'embrione precoce. Gli embrioni vengono fissati e quindi preparati per l'ibridazione modificando le soluzioni e le temperature in modo tale da consentire un legame ad alta stringenza della sonda di RNA antisenso marcata al suo mRNA bersaglio. La sonda non legata viene lavata via e gli embrioni vengono quindi preparati per il legame di un anticorpo contro l'etichetta sulle sonde di RNA. L'anticorpo in eccesso viene quindi lavato via e viene utilizzata una reazione enzimatica del colore per localizzare il punto in cui la sonda di RNA è legata nell'embrione. Ora ci sono un certo numero di linee transgeniche di Xenopus che guidano l'espressione di proteine fluorescenti in tessuti specifici e queste sono disponibili presso i centri di stoccaggio Xenopus come il National Xenopus Resource a Woods Hole. Sebbene sia molto utile per molti esperimenti che richiedono l'esame dell'organogenesi negli embrioni viventi, questa opzione richiede un alloggiamento separato per le linee transgeniche. 
L'ibridazione in situ può delineare chiaramente dove si formeranno organi o tipi di cellule specifici nell'embrione precoce (Figura 1). La tecnica è notevolmente sensibile dato che è possibile rilevare l'espressione genica in un piccolo numero di cellule in un singolo embrione 5. Tuttavia, l'ibridazione in situ utilizzando l'intensità della colorazione colorimetrica non è considerata quantificabile perché la reazione cromatica non è lineare. Nonostante la difficoltà nel quantificare l'intensità della colorazione, i cambiamenti nell'espressione sono spesso abbastanza evidenti; in particolare quando l'ibridazione in situ mostra aumenti o diminuzioni quantificabili nella dimensione dei domini di espressione 6,7. 
I chiari vantaggi dell'ibridazione in situ a montatura intera la rendono un saggio critico nello studio dello sviluppo precoce. Tuttavia, è un processo che richiede molto tempo e molti passaggi nell'arco di diversi giorni. Questo protocollo è una versione semplificata del protocollo standard che elimina diversi passaggi senza ridurre la qualità del risultato in situ. La semplificazione elimina anche le fonti di variabilità, facilitando la risoluzione dei problemi se un'ibridazione in situ non è ottimale. In particolare, abbiamo eliminato l'uso di trattamenti con proteinasi K e RNAsi dell'embrione, due passaggi che possono dipendere dalla qualità del reagente e possono anche ridurre l'intensità del segnale se esagerati. Il protocollo offre anche un certo grado di risparmio sui costi grazie all'eliminazione dell'uso di diversi reagenti. Infine, questo protocollo fornisce anche alcune semplici linee guida per una migliore acquisizione delle immagini dei risultati dell'ibridazione in situ. Sebbene questo protocollo sia ottimizzato per il lavoro negli embrioni di Xenopus, è probabile che almeno alcune delle semplificazioni saranno applicabili al lavoro di ibridazione in situ in altri sistemi embrionali.

<table><tbody><tr><td>Labguake Agitatori per provette</td><td>VWR</td><td>17-08-2011</td><td></td></tr><tr><td>VWR Fiale</td><td>VWR</td><td>VWR 10-07-2012</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteina</td><td>BioShop</td><td>CYS342.500</td><td></td></tr><tr><td>Set di trifosfato ribonucleosidico, 100mM</td><td>Roche</td><td>11277057001</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenina-11-UTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della Rnasi (Rnase OUT)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polimerasi</td><td>fermentas</td><td>EPO111</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA polimerasi</td><td>fermentas</td><td>EPO101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA polimerasi</td><td>fermentas</td><td>EPO131</td><td></td></tr><tr><td>Dnase 1</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>18047-019</td><td></td></tr><tr><td>Siero di pecora</td><td>&nbsp; Wisent</td><td>31150</td><td></td></tr><tr><td>Reagente bloccante</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>BM viola Substrato Ap</td><td>Roche</td><td>11442094001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenina-Ap Frammenti di Feb</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>VWR</td><td>CAMX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioShop</td><td>SOD002.10</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>EM&nbsp;</td><td>7910</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioShop</td><td>TRS003.5</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>EM&nbsp;</td><td>9480</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Mops</td><td>BioShop</td><td>MOP001.250</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>BioShop</td><td>PAR070.500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>&nbsp; VWR &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CAFX0420-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNA</td><td>Roche</td><td>10109223001</td><td></td></tr><tr><td>acido maleico</td><td>&nbsp; VWR &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CAMX0100-3</td><td></td></tr><tr><td>citrato tri-sodio</td><td>BioShop</td><td>CIT001</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno (soluzione al 30%)</td><td>EM&nbsp;</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>BioShop</td><td>ALB001.100</td><td></td></tr><tr><td>PVP-40</td><td>ICN</td><td>195451</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td></td></tr><tr><td>Alcool benzilico</td><td>Sigma</td><td>B-1042</td><td></td></tr><tr><td>Benzoato benzilico</td><td>Sigma</td><td>B-6630</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio ultrapuro&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>16500-500</td><td></td></tr></tbody></table>

capire in anticipo organogenesis utilizzando una semplificata<em&gt; in situ</em&gt; protocollo di ibridazione in<em&gt; xenopus</em

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

L'organogenesi è lo studio di come gli organi vengono specificati e quindi acquisiscono la loro forma e funzioni specifiche durante lo sviluppo. L'embrione di Xenopuslaevis è molto utile per lo studio dell'organogenesi perché le sue grandi dimensioni lo rendono molto adatto per identificare gli organi nelle prime fasi dell'organogenesi. Al momento, il metodo principale utilizzato per identificare un organo specifico o primordio è l'ibridazione in situ a montatura intera con sonde di RNA antisenso marcate specifiche per un gene che è espresso nell'organo di interesse. Inoltre, è relativamente facile manipolare i geni o le vie di segnalazione in Xenopus e l'ibridazione in situ consente di analizzare i cambiamenti nella presenza o nella morfologia di un organo bersaglio. L'ibridazione in situ dell'intera montatura è un protocollo di più giorni con molti passaggi coinvolti. Qui forniamo un protocollo semplificato con un numero ridotto di passaggi e reagenti utilizzati che funziona bene per i test di routine. I robot di ibridazione in situ hanno notevolmente facilitato il processo e descriviamo in dettaglio come e quando utilizziamo tale tecnologia nel processo. Una volta completata l'ibridazione in situ, catturare l'immagine migliore del risultato può essere frustrante. Forniamo consulenza su come ottimizzare l'imaging dei risultati dell'ibridazione in situ. Sebbene il protocollo descriva la valutazione dell'organogenesi in Xenopus laevis, lo stesso protocollo di base può quasi certamente essere adattato a Xenopus tropicalis e ad altri sistemi modello.

L&#39;uso di sonde specifiche del tessuto può fornire informazioni eccellente per quanto riguarda lo stato di sviluppo per organi specifici. Nei seguenti esempi, la fase dell&#39;embrione si basa sulla tabella di gestione temporanea Nieuwkoop e Faber 11. Se uno usa geni forma sonde espressi dopo la differenziazione, troponina I cardiaca in fase di 28-30, per esempio (Figura 1C), la presenza o la dimensione di un organo differenziata può essere valutata in ogni differenziazione fase d...

L'embrione di Xenopus laevis continua ad essere eccezionalmente utile nello studio dello sviluppo precoce grazie alle sue grandi dimensioni e alla facilità di manipolazione. Viene fornito un protocollo semplificato per l'ibridazione in situ dell'intera montatura che può essere utilizzato nell'identificazione di organi specifici in questo sistema modello.

Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata<em&gt; In Situ</em&gt; Protocollo di ibridazione in<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è mostrare in quale sede viene espressa una particolare gene all'interno di un embrione integro. Questo risultato si ottiene fissando l'RNA da localizzare in loco all'interno dell'embrione come secondo passaggio. Una sonda a RNA antisenso specifica per il gene di interesse viene ibridata all'RNA bersaglio all'interno dell'embrione.Questo sonda contiene un epitopo, solitamente digoxigenina, che può essere successivamente rilevato. Successivamente, un anticorpo coniugato alla fosfatasi alcalina viene ibridato all'epitopo presente sulla sonda di RNA, seguito dall'uso di un colorante cromogenico. Per visualizzare la localizzazione dell'RNA all'interno dell'embrione, si ottengono risultati che mostrano con precisione dove il gene di interesse è espresso, in base alla reazione cromogenica e alla conoscenza dell'anatomia dell'embrione.Il vantaggio principale del nostro protocollo istituzionale rispetto ai protocolli esistenti è che è più rapido e utilizza meno reagenti, senza alcuna perdita evidente di qualità. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali in embriologia, come ad esempio come i tessuti vengono specificati e organizzati. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo sviluppo di opus, può essere utilizzato anche per molti altri embrioni di piccole dimensioni, come quelli di zebrafish e di topo nei primi stadi.Abbiamo iniziato a sviluppare questi metodi perché i metodi originali richiedevano molto tempo, e abbiamo cominciato a sperimentare l'omissione di alcuni passaggi di Ed per aumentare l'efficienza del procedimento senza comprometterne la qualità. La fissazione degli embrioni viene eseguita in fasi successive. Preparare innanzitutto i vial di vetro che saranno utilizzati per tutti i passaggi, inclusa la conservazione finale degli embrioni, in modo da consentire il monitoraggio degli embrioni durante tutte le fasi del processo.Utilizzare viali trasparenti con un buon sigillo in teflon nel coperchio e applicare un'etichetta con un pennarello indelebile contenente le informazioni sperimentali appropriate. Coprire l'etichetta con del nastro trasparente per evitare la perdita dell'etichettatura nel corso della procedura. A causa dell'uso di alcoli e altri solventi, preparare la soluzione di fissaggio MFA come descritto nel testo del protocollo.Riempire ogni provetta di vetro etichettata con tre o quattro millilitri di soluzione MFA. Conservare una soluzione di metanolo al 100% a meno 20 gradi Celsius. Preparare una pipetta di vetro tagliata e utilizzarla per trasferire gli embrioni nelle provette di vetro contenenti soluzione Memphis per la fissazione.Aggiungere gli embrioni con il minimo trasferimento di liquido dal mezzo embrionale. Fissare non più di 20-30 embrioni per provetta. Lasciare gli embrioni in soluzione di Memphis per due ore a temperatura ambiente su un agitatore rotatorio.Al termine della fissazione con paraformaldeide, sostituire la soluzione di Memphis con circa quattro millilitri di metanolo al 100% a meno 20 gradi Celsius per la conservazione degli embrioni prima di allestire la reazione di sintesi della sonda. Lasciare che la miscela di DNA, acqua, NTP e tampone polimerasico raggiunga la temperatura ambiente. Uno dei passaggi più critici per il successo di questa procedura è l'allestimento corretto della reazione della sonda.Assemblare la reazione di sintesi della sonda a temperatura ambiente. Aggiungere i seguenti componenti in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri in questo ordine: DNA stampo, acqua aggiustata a un volume tale da portare il volume totale della reazione a 20 microlitri, mix di NTP, inibitore dell'RNA, buffer della RNA polimerasi e RNA polimerasi. Incubare la reazione di trascrizione per due ore a 37 gradi Celsius.Incubazioni leggermente superiori a due ore non hanno effetti negativi, ma mostrano anche un aumento minimo del rendimento; se l'incubazione dura un'ora, il rendimento sarà ridotto, sebbene ancora sufficiente per ottenere una buona sonda. Al termine della reazione di trascrizione, prelevare un microlitro della miscela di reazione per verificarla su un gel di agarosio al 1% in tampone TAE, aggiungendo il prelievo alla restante miscela di reazione.Aggiungere 80 microlitri di SDS al 1% in tampone TE, 10 microlitri di acetato di ammonio 5 M e 220 microlitri di etanolo freddo. Vortexare energicamente la miscela e lasciarla in ghiaccio fino a quando non si conoscono i risultati del controllo della qualità dell'RNA. Dopo aver aggiunto acqua e colorante di carico standard all'uno microlitro di RNA prelevato prima della precipitazione, eseguire l'RNA su un gel di agarosio al 1% in tampone TAE contenente bromuro di AUM.Visualizzare l'RNA marcato con bromuro di etidio sul gel utilizzando un transilluminatore a luce UV per verificare la qualità della sonda. Dovrebbe essere visibile una singola banda senza sbavature né al di sopra né al di sotto. Una volta verificata la qualità dell'RNA, precipitare l'RNA rimanente messo da parte sul ghiaccio centrifugando in un microcentrifugo a velocità massima per 10-15 minuti.Rimuovere il soprannatante con una pipetta di vetro affusolata e lasciare asciugare brevemente l'RNA. Successivamente, la sonda viene risospesa in un tampone di ibridazione per RNA e conservata in un tubo in polistirene da 15 millilitri con tappo a vite a meno 20 gradi Celsius. Per iniziare questa procedura, recuperare gli embrioni conservati nel metanolo a meno 20 gradi Celsius e lasciarli riscaldare alla temperatura ambiente.L'intero procedimento viene eseguito in provette di vetro. Se diversi embrioni provenienti da un singolo gruppo devono essere analizzati con sonde diverse, mantenerli in una singola provetta fino a subito prima dell'aggiunta delle sonde. Per ridurre la variabilità e il lavoro richiesto nel primo giorno di preparazione per l'aggiunta della sonda, idratare gli embrioni attraverso una serie di metanolo come indicato in questa tabella, utilizzando pipette di vetro per rimuovere e aggiungere con attenzione ogni soluzione, poiché gli embrioni possono essere facilmente danneggiati durante questo passaggio.Quando si trasferiscono i liquidi, controllare l'interno dei tappi per assicurarsi che non vi siano embrioni intrappolati. Dopo ogni cambio, agitare delicatamente gli embrioni per verificare che non si attacchino alle pareti o l'uno all'altro. Inoltre, agitare gli embrioni posizionando le provette su un agitatore; prima dell'uso, il tampone per ibridazione dell'RNA e la sonda devono essere preriscaldati a 65 gradi Celsius.Ibridare gli embrioni nella soluzione di sonda durante la notte con agitazione a 65 gradi Celsius il giorno successivo. Rimuovere la soluzione di sonda e conservarla in un tubo in polistirene da 15 millilitri con tappo a vite, contrassegnato con la data e il numero di volte in cui la sonda è stata utilizzata. Conservare la soluzione di sonda a meno 20 gradi Celsius.Dopo aver rimosso la sonda, preparare gli embrioni per la colorazione con anticorpi diretti contro la sonda eseguendo una serie di lavaggi come indicato qui. Cambiare la temperatura spostando il mutatore con le provette contenenti gli embrioni direttamente in forni per ibridazione impostati alla temperatura appropriata. Durante l'incubazione degli embrioni nella soluzione di blocco, preparare il volume appropriato di soluzione di blocco più anticorpo anti-D dig in modo che l'anticorpo venga bloccato prima dell'aggiunta agli embrioni. Incubare gli embrioni nella soluzione anticorpale tutta la notte con agitazione a quattro gradi Celsius il giorno successivo.Rimuovere la soluzione di anticorpo e lavare con mab, una soluzione contenente acido malico e cloruro di sodio. Eseguire almeno 12 lavaggi di 30 minuti a temperatura ambiente con agitazione. Sostituire l'ultima soluzione di lavaggio con il substrato della fosfatasi alcalina.Eseguire la reazione di colorazione a temperatura ambiente con agitazione lenta durante la notte al giorno successivo. Arrestare la reazione di colorazione e preparare gli embrioni per la conservazione e l'acquisizione delle immagini cambiando i liquidi come indicato in questa tabella. Dopo aver riidratato gli embrioni, fissare la colorazione con MFA per 30 minuti.Dopo la fissazione, rimuovere la MFA e lavare gli embrioni con metanolo al 25%. Se necessario rimuovere il pigmento endogeno, eliminare il metanolo al 25% e aggiungere la soluzione sbiancante. Osservare attentamente lo sbiancamento poiché avviene relativamente in fretta, e il grado di sbiancamento può essere variato per ottenere effetti diversi.Per la conservazione a lungo termine, disidratare gli embrioni attraverso una serie di metanolo fino a raggiungere il metanolo al 100%, dopo la schiaritura per la conservazione a breve termine e per le successive analisi di imaging; trasferire quindi gli embrioni in PBS. Gli embrioni non schiariti vanno osservati e analizzati al meglio su uno sfondo di aros all'1%. Per preparare la soluzione di aros, aggiungere l'aros all'acqua e portare a ebollizione finché l'aros non è completamente disciolto. Dopo che l'aros si è raffreddato a 50 gradi Celsius, versarlo in una piastra di Petri fino a uno spessore di circa due millimetri.Quando la piastra aros è pronta, posizionare gli embrioni non schiariti nella piastra ed eseguire l'acquisizione delle immagini. L'aros fornisce uno sfondo grigio bluastro che contrasta bene con l'embrione e con il colore blu della reazione di colorazione. Inoltre, aiuta a diffondere ombre e riflessi fastidiosi che distolgono l'attenzione dall'embrione, permettendo di acquisire l'immagine dell'embrione da angolazioni alternative, ad esempio dal lato ventrale.Utilizzare pinzette fini per praticare incisioni nell'aro in modo da adattarlo all'embrione. Posizionare gli embrioni in questi canali per l'orientamento. Prestare attenzione durante la manipolazione degli embrioni poiché sono facilmente danneggiabili.Utilizzare una sorgente luminosa a fibra ottica per illuminare l'embrione con un angolo poco inclinato, creando ombre sull'embrione che conferiscono profondità all'immagine e aiutano a distinguere le strutture superficiali, poiché la schiaritura può eliminare il pigmento che fornisce punti di riferimento utili. Usare l'effetto di ombreggiatura per embrioni fortemente schiariti. Gli embrioni trasparentizzati vengono utilizzati per acquisire immagini di colorazioni localizzate in profondità all'interno dell'embrione, come nel notocorda, nei polmoni o in regioni del cervello.In questo protocollo, diversi livelli di sbiancamento vengono utilizzati per visualizzare la colorazione nell'embrione. Se la colorazione è intensa, uno sbiancamento più leggero che mantiene una certa pigmentazione permette una migliore determinazione dello stadio e un migliore orientamento dell'embrione. Tuttavia, se la colorazione si trova in un'area con elevati livelli di pigmentazione, come il rene, uno sbiancamento più intenso fornisce un risultato migliore.La manipolazione della base dell'ARO può essere utile per l'orientamento dell'embrione. Ad esempio, creando un canale sottile negli aros, è possibile osservare da un lato ventrale un embrione allo stadio di girino che giace su un fianco, con una stabilità sufficiente per acquisire un'immagine di buona qualità. Questo embrione è stato posizionato in un piccolo foro che ne stabilizzava la posizione con il lato ventrale rivolto verso l'alto, consentendo una visione completa del pattern di espressione del gene di interesse.Gli organi interni possono essere osservati sia in embrioni non trasparentizzati che in embrioni trasparentizzati, a partire da un embrione opaco non trasparentizzato colorato per PAX due. Allo stadio 34, è possibile visualizzare il peduncolo ottico così come il tubo neurale. Tuttavia, i dettagli non sono nitidi. Trasparentizzando l'embrione, i confini dei siti di espressione, inclusi quelli del peduncolo ottico, risultano più definiti.Il grado di chiarificazione è indicato dalla capacità di visualizzare entrambi gli occhi in questo embrione. Tuttavia, un problema comune con gli embrioni chiarificati è l'accumulo di colorazione nelle cavità interne. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere un'idea chiara di come eseguire rapidamente un'ibridazione in situ su preparato intero utilizzando meno reagenti e ottenere immagini di alta qualità.

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